GoldMag: Recubrimiento PSS-MA mejora estabilidad y precisión óptica para detección de proteínas

Resumen

Las nanopartículas magnéticas de oro (GoldMag) han atraído gran atención debido a sus únicas prestaciones físicas y químicas combinando las de nanopartículas individuales de Fe₃O₄ y Au. El recubrimiento de GoldMag con polímeros no solo aumenta la estabilidad de las partículas compuestas suspendidas en tampón, sino que también juega un papel clave para establecer pruebas ópticas point-of-care para biomoléculas clínicamente relevantes. En el presente artículo, poli(ácido 4-estirensulfónico-co-maleico) (PSS-MA), un polielectrolito cargado negativamente con grupos aniónicos sulfonato y carboxilato, se usó para recubrir la superficie de GoldMag (30 nm) cargado positivamente. El complejo GoldMag recubierto con PSS-MA tiene un pico de adsorción de resonancia plasmonica estable a 544 nm. Un par de anticuerpos anti-D-dímero se ha acoplado en la superficie de esta nanopartícula compuesta GoldMag, y una proteína diana, D-dímero, fue detectada en el rango de 0.3–6 μg/mL. El desplazamiento del pico característico, causado por el ensamblaje de GoldMag debido a la formación de puentes sándwich D-dímero-anticuerpo, permitió la detección.

Introducción

Aprovechando una propiedad de magnetización específica, la superparamagnetismo, las nanopartículas magnéticas se han investigado ampliamente para aplicaciones biomédicas, como administración de fármacos/genes, imagen por resonancia magnética, y ensayos biológicos. Las nanopartículas magnéticas de oro (GoldMag), compuestas de Fe₃O₄/Au, no solo tienen las propiedades físico-químicas de nanopartículas de óxido de hierro, sino que también presentan características de nanopartículas de oro como fácil funcionalización superficial y propiedades ópticas únicas. Estas características distintivas han atraído gran atención en biología, especialmente en detección de biomoléculas basada en propiedades ópticas. Como ejemplo, Wang et al. usaron varillas Fe₃O₄-Au como sondas ópticas para detección multiplex de patógenos. Sin embargo, al igual que con otras nanopartículas, la alta energía superficial fuerza a las partículas GoldMag a agruparse formando agregados en solución tampón. Esto limita enormemente su aplicación para detección óptica en el área biomédica. Es por tanto crucial prevenir la agregación de GoldMag y asegurar una solución coloidal estable. Personalizar GoldMag para detectar moléculas diana basándose en recubrimiento con polímeros tiene alta utilidad. Se ha reportado que la dispersibilidad de GoldMag puede mejorarse mediante modificación superficial con diversos compuestos orgánicos macromoleculares, como ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA), poliestirensulfonato (PSS), y polietilenimina (PEI). MUA se llevó a la superficie de GoldMag usando estrategia de intercambio de ligandos. Mejoró la estabilidad de soluciones coloidales de GoldMag mediante modificación superficial con MUA. Estos MUA-GoldMag se han usado en detección de proteínas basada en propiedades ópticas. Sin embargo, la cadena de MUA era demasiado corta para proporcionar suficiente impedimento estérico para asegurar dispersibilidad suficiente de partículas. Además, la baja densidad de grupos carboxilo en MUA limita la cantidad de proteína que puede absorberse en GoldMag. Estas desventajas restringen la aplicación de partículas MUA en instrumentos ópticos y limitan la sensibilidad requerida para detección de biomarcadores.

Poli(ácido 4-estirensulfónico-co-maleico) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20,000), un copolímero en bloques, se fabrica por enlace covalente de PSS y ácido polimaleico y contiene tanto grupos sulfonato como carboxilato. La repulsión electrostática proporcionada por el gran número de grupos carboxilo y sulfonato, así como el impedimento estérico proveniente de la larga cadena polimérica de PSS-MA, hacen este polímero muy útil para mantener la estabilidad de las nanopartículas. De hecho, PSS-MA se ha usado como estabilizador en la preparación de nanomateriales, como nanomateriales de óxido de hierro, paladio, y nanoestructuras bimetálicas Ag-Au. Johnston et al. reportaron que nanoclusters de óxido de hierro recubiertos con copolímero aseguran un mayor grado de estabilización electroestérica que nanoclusters recubiertos con polímero macromolecular único. Además, el gran número de grupos carboxilo en la porción de ácido polimaleico de PSS-MA permite modificación química con biomoléculas para aplicaciones biomédicas.

Los D-dímeros son productos finales estables de la degradación de fibrina entrecruzada, resultante de formación aumentada de fibrina y fibrinólisis. La determinación del nivel de D-dímero en sangre se usa ampliamente en diagnóstico de eventos tromboembólicos e infarto de miocardio. Aquí, usamos D-dímero como modelo para evaluar el potencial de usar PSS-MA-GoldMag para detección óptica de proteínas específicas. Usamos un par de anticuerpos anti-D-dímero para inmovilización en PSS-MA-GoldMag con el fin de formar sondas para detección de D-dímero por inmunoensayo de sándwich de doble anticuerpo.

Así, en el presente estudio, PSS-MA se usó para modificación superficial de GoldMag. Esto no solo mejoró la estabilidad de las nanopartículas magnéticas, sino que también media la conjugación entre nanopartículas y anticuerpos para detección de Dímero.

Métodos

Materiales y reactivos

GoldMag (5 mg/mL) fueron proporcionados por Xi'an GoldMag Nanobiotech Co., Ltd. (Xi'an, China). Ácido bórico, borax, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), Poli(ácido 4-estirensulfónico-co-maleico) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20,000) se compraron de Sigma-Aldrich, USA. Un par de anticuerpos monoclonales anti-D-dímero (anticuerpo 1: M-2.1.16; anticuerpo 2: M-1.2.57) se compraron de Roche. D-dímero se compró de Meridian Chemicals, USA.

GoldMag modificado superficialmente con PSS-MA

Los GoldMag se sintetizaron como se describió previamente. 13.3 mL de CTAB (50 mmol/L) se añadieron a 13.3 mL de GoldMag (aproximadamente 3 mg/mL). La mezcla se agitó mecánicamente (200 rpm) combinado con ultrasonicación (SB-5200DTD, China) durante 30 min seguido de agitación adicional sin ultrasonicación por otros 30 min. Las partículas se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. Los CTAB-GoldMag se redispersaron en 10 mL de agua desionizada y se añadieron 16 mL de solución 25% (p/p) PSS-MA seguido de agitación (180 rpm) durante 90 min. Las partículas modificadas se lavaron con agua desionizada dos veces y se dispersaron en agua desionizada.

Caracterización

Los PSS-MA-GoldMag se observaron usando microscopio electrónico de transmisión (TEM, Hitachi H-600, Hitachi Corporation, Japón). La distribución de tamaño se analizó por DLS (zeta-sizer, Malvern Instruments, UK). Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR, Thermo Nicolet 5700, Thermo Nicolet Corporation, USA) se usó para caracterizar los grupos funcionales de PSS-MA-GoldMag. Un analizador termogravimétrico Metter Toledo SDTA 851e (TGA) se usó para analizar la proporción de capa superficial de polímero entre los PSS-MA-GoldMag. El espectro de resonancia plasmonica de superficie (SPR) de GoldMag se registró usando un espectrofotómetro UV-2550 (Shimadzu, Japón) en el rango de longitud de onda 450–700 nm.

Preparación de la sonda Anti-D-dímero Anticuerpo-PSS-MA-GoldMag

Un miligramo de GoldMag se suspendió en 1 mL tampón borax/borato (0.02 M, pH 7.4), conteniendo 75 mg/mL de 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida (EDC). Luego, 100 μg anticuerpo anti-D-dímero se añadió a la suspensión seguido de ultrasonicación durante 1 h. Tres mililitros de tampón de bloqueo (0.02 M tampón borax/borato, pH 7.4, conteniendo 5% BSA) se añadieron a la mezcla e incubaron durante 1.5 h. Tras separación bajo campo magnético externo, el compuesto anti-D-dímero anticuerpo-PSS-MA-GoldMag se mantuvo en tampón borax/borato bajo 4 °C. La conjugación del anticuerpo anti-D-dímero en la superficie PSS-MA-GoldMag se confirmó por espectroscopía SPR y medición de dispersión dinámica de luz (DLS).

La solución de D-dímero se preparó diluyendo una solución madre de D-dímero (40 mg/mL) con suero de ternera. Tres concentraciones de D-dímero (0.6, 2, y 6 μg/mL) se usaron para optimizar el tiempo de reacción entre D-dímero y el complejo anti-D-dímero anticuerpo-PSS-MA-GoldMag. Diez microlitros de anti-D-dímero anticuerpo-PSS-MA-GoldMag (0.3 mg/mL) se mezclaron con 80 μL de solución de D-dímero (0.6, 2, y 6 μg/mL), y la mezcla se incubó a 25 °C durante 10, 20, 30, y 40 min. La longitud de onda del pico SPR del compuesto PSS-MA-GoldMag se leyó usando un espectrofotómetro UV-2550.

Soluciones de D-dímero con concentraciones de 6, 3, 1.5, 0.75, y 0.3 μg/mL se prepararon para analizar la relación entre la concentración de D-dímero y el cambio del espectro SPR. Diez microlitros de anti-D-dímero anticuerpo-PSS-MA-GoldMag (0.3 mg/mL) se mezclaron con 80 μL de solución de D-dímero (6, 3, 1.5, 0.75, y 0.3 μg/mL) y la mezcla se incubó a 25 °C durante 30 min. La longitud de onda del pico SPR de PSS-MA-GoldMag se leyó usando un espectrofotómetro UV-2550.

Para evaluar si triglicéridos, bilirrubina, y hemoglobina pueden interferir con nuestro sistema de detección de proteínas, soluciones de D-dímero (0 y 3 μg/mL) se prepararon y se añadieron por separado 22 mg/mL triglicéridos, 0.2 mg/mL bilirrubina, y 2 mg/mL muestras de hemoglobina. Diez microlitros de anti-D-dímero anticuerpo-PSS-MA-GoldMag se añadieron a las mezclas anteriores, y la longitud de onda del pico SPR del compuesto PSS-MA-GoldMag se leyó usando un espectrofotómetro UV-2550.

Resultados y discusión

El Esquema 1 ilustra los procedimientos desarrollados para la modificación superficial y funcionalización de partículas para detección colorimétrica de proteínas. Para estudiar la adsorción e incorporación de PSS-MA en las estructuras PSS-MA-GoldMag, se realizaron análisis espectroscópicos FTIR, espectroscopía SPR, y TGA. La Figura 1a muestra el espectro FTIR para PSS-MA puro, PSS-MA-GoldMag, y GoldMag, respectivamente. La banda ancha y fuerte a 3000–3700 cm⁻¹ corresponde al estiramiento de grupos –CO–OH y grupos hidroxilo de –SO₂–OH en cadenas poliméricas. Vibraciones simétricas de grupos sulfonato: (SO₃⁻) estaban a 1037 y 1126 cm⁻¹ y vibraciones de estiramiento de C=C de Benceno a 1403 y 1637 cm⁻¹. Estas bandas de absorción características de PSS-MA se observaron en PSS-MA-GoldMag demostrando que las partículas crudas fueron recubiertas exitosamente con PSS-MA. El cambio de grupos químicos superficiales de GoldMag se confirmó por un claro desplazamiento al azul de 11 nm de 555 a 544 nm en la banda SPR tras la modificación (Fig. 1b). La posición y anchura del pico SPR se relacionaban con la superficie, el entorno, y la dispersibilidad de las nanopartículas. El análisis TGA indicó que la relación de peso de material orgánico a GoldMag era casi 1:4 (Fig. 1c). A baja temperatura, la pérdida de peso puede atribuirse a deshidratación; cuando la temperatura sube, la pérdida de peso puede atribuirse a descomposición oxidativa de las moléculas orgánicas en la superficie de las partículas modificadas. Durante la modificación, los CTAB-GoldMag estaban cargados positivamente (+12.2 mV) y la superficie de la partícula se volvió cargada negativamente (−24.5 mV) tras el recubrimiento PSS-MA en la superficie de las partículas (Fig. 1d). Todos los resultados anteriores muestran que PSS-MA se adhirió exitosamente en la superficie de las nanopartículas.

GoldMag: Recubrimiento PSS-MA mejora estabilidad y precisión óptica para detección de proteínas

Las micrografías (Fig. 2a, b) de GoldMag y PSS-MA-GoldMag obtenidas usando TEM muestran que estas partículas eran mono-dispersas, tras la modificación. La capa de polímero en la superficie de las partículas es claramente visible bajo la imagen microscópica electrónica de alta resolución indicando además que el recubrimiento de polímero en GoldMag fue exitoso (Fig. 2b). La Figura 2c muestra que el diámetro promedio de PSS-MA-GoldMag es 116 nm. La suspensión PSS-MA-GoldMag tiene un color rojo vino que indica una buena estabilidad de las nanopartículas (1 año en agua).

La estabilidad de las características ópticas de GoldMag y PSS-MA-GoldMag en soluciones tampón con diferentes valores de pH se analizaron por espectroscopía SPR. Como se muestra en la Fig. 3a, el pico característico SPR se desplazó a longitud de onda mayor desde 555 nm cuando GoldMag se suspendieron en tampón borax/borato con pH de 6.0 a 9.0. La composición de la solución tampón también influye en la estabilidad de la suspensión GoldMag. La posición del pico característico SPR se movió a longitudes de onda mayores (558 nm) cuando GoldMag se suspendieron en tampón PB (pH 7.4), tampón borax/borato (pH 7.4), y solución NaCl (10 mM) comparado con los de agua desionizada (550 nm) (Fig. 3c). Sin embargo, el pico característico SPR (545 ± 2 nm) no cambió significativamente cuando PSS-MA-GoldMag se dispersaron en solución electrolítica o en tampón con diferentes valores de pH (Fig. 3b, d). Xia et al. y Storhoff et al. también reportaron que la agregación de nanopartículas puede hacer que el espectro SPR se desplace a longitudes de onda mayores. El potencial zeta de GoldMag y PSS-MA-GoldMag también se midió (Fig. 3e, f). Se ha reportado que un potencial zeta bajo (menos de ±30 mV) llevará a aglomeración de partículas. Cuando GoldMag se suspendieron en tampón PB (pH 7.4), tampón borax/borato (pH 7.4) y solución NaCl (10 mM), el potencial zeta de GoldMag fue −16.7 ± 1.1 mV, −14.3 ± 2.1 mV, y −8.9 ± 1.5 mV, respectivamente. El potencial zeta de GoldMag fue −14.2 ± 1.7 mV, −17 ± 1.1 mV, 13.9 ± 1.7 mV, y −18.1 ± 1.6 mV cuando las partículas se suspendieron en tampón borax/borato con pH de 6.0 a 9.0. Sin embargo, la adhesión de PSS-MA a GoldMag disminuye dramáticamente su potencial zeta en diferentes soluciones electrolíticas, así como a diferentes valores de pH. En todos los casos, el potencial zeta fue menor que −30 mV. Estos resultados indican que la modificación superficial de GoldMag con PSS-MA mejora significativamente su resistencia a cambios de composición y valores de pH de soluciones tampón y asegura un alto nivel de dispersibilidad.

Para investigar la interacción entre proteína y PSS-MA-GoldMag, anticuerpos anti-D-dímero se conjugaron con PSS-MA-GoldMag a través de la reacción entre grupos amino de proteína y grupos carboxilo del polímero mediada por EDC. Como se muestra en la Fig. 4a, se observó un desplazamiento al rojo del pico SPR tras la reacción de PSS-MA-GoldMag con anticuerpos anti-D-dímero, lo que indica la conjugación de anticuerpos en nanopartículas. El aumento del diámetro promedio de partículas de 116 a 130 nm confirma la introducción del anticuerpo anti-D-dímero al PSS-MA-GoldMag (Fig. 4b). La influencia de la masa de anticuerpo en la propiedad óptica de PSS-MA-GoldMag se evaluó mediante espectroscopía SPR tras añadir diferentes cantidades de anticuerpo anti-D-dímero (de 20 a 200 μg) a la suspensión PSS-MA-GoldMag. Como se muestra en la Fig. 4c, el pico SPR no cambió y se mantuvo en 548 ± 3.0 nm, independiente de la cantidad de anticuerpo añadido.

Para evaluar la actividad de los anticuerpos tras conjugación en PSS-MA-GoldMag, se prepararon sonda A y sonda B inmovilizando un par de anticuerpos (anticuerpo 1 y anticuerpo 2), y anticuerpo 1 en PSS-MA-GoldMag, respectivamente. La interacción entre los dos tipos de sonda y D-dímero se analizó por espectroscopía SPR. El mejor tiempo de reacción se obtuvo observando el cambio del máximo del pico SPR durante 40 min tras añadir tres concentraciones de D-dímero (0.6, 2, y 6 μg/mL) a la sonda A. Como se muestra en la Fig. 5a, se observó un desplazamiento significativo en la banda de plasmon de superficie resultante de la agregación de PSS-MA-GoldMag a través de enlaces cruzados entre puentes sándwich antígeno-anticuerpo a lo largo del tiempo. A baja concentración (0.6 μg/mL), no hubo cambio significativo en el espectro SPR de 20 a 40 min, indicando que 20 min es suficiente para la reacción de 0.6 μg/mL o concentraciones menores de D-dímero. Sin embargo, usando concentraciones medias y altas de D-dímero (2 y 6 μg/mL), la longitud de onda siguió aumentando 30 min. Esto indica que el mejor tiempo de reacción es 30 min. Como se muestra en la Fig. 5b, el espectro SPR de las partículas compuestas reveló un desplazamiento al rojo distinto en resonancia plasmonica de superficie de λ_max = 550 a 570 nm y disminución de intensidad del pico característico a medida que la concentración de D-dímero aumentaba de 0.3 a 6 μg/mL. Esto es provocado por la agregación de PSS-MA-GoldMag causada por la conexión cruzada de D-dímero con anticuerpo 1 y anticuerpo 2 en la sonda A. La agregación de PSS-MA-GoldMag resultó en el cambio de las propiedades ópticas de la parte de oro de PSS-MA-GoldMag. Jiang et al. y Li et al. también reportaron que la agregación de nanogold puede hacer que el espectro SPR de nanopartículas se desplace al rojo y se ensanche. Sin embargo, no se observó desplazamiento al rojo en la Fig. 5d porque la interacción entre D-dímero y anticuerpo 1 no pudo llevar al ensamblaje de nanopartículas. Además, un desplazamiento al rojo distinguible (5 nm) se observó incluso cuando la cantidad de D-dímero añadido a la sonda A fue tan baja como 0.3 μg/mL, lo que indica que el límite de detección está por debajo de los valores de corte diagnósticos (0.5 μg/mL) para este biomarcador. Una relación lineal entre la posición del pico espectral SPR y la concentración de D-dímero se encontró en el rango de 0.3–6 μg/mL (r² = 0.9944) (Fig. 5c).

Como se muestra en la Fig. 6, no se encontró desplazamiento significativo del pico característico SPR de PSS-MA-GoldMag en presencia de triglicéridos, bilirrubina, y hemoglobina, respectivamente. Este resultado indica que nuestro sistema de detección de proteínas no tiene reacciones interferentes con triglicéridos, bilirrubina, y hemoglobina.

Estos resultados muestran que PSS-MA-GoldMag es una nanopartícula magnética prometedora para inmovilización de proteínas y puede formar un puente sándwich en la superficie de la partícula vía anticuerpo 1-proteína diana-anticuerpo 2. Esto hace a PSS-MA-GoldMag valioso como material para uso en detección óptica point-of-care de biomarcadores.

En este estudio, PSS-MA se usó por primera vez para modificación de GoldMag (Esquema 1). La introducción de PSS-MA en la superficie de GoldMag mejoró significativamente su estabilidad en solución tampón. Además del impedimento estérico causado por la larga cadena polimérica de PSS-MA, los grupos carboxilo y sulfo en PSS-MA causan repulsión electrostática entre las nanopartículas. Esto mejora significativamente la estabilidad de PSS-MA-GoldMag. El alto número de grupos carboxilo en la superficie de la partícula cumple el requisito para conjugación con biomolécula.

Conclusiones

En el presente estudio, se reportó un método fácil y rápido para recubrir GoldMag con PSS-MA. Los resultados muestran que la estabilidad coloidal y dispersibilidad de GoldMag mejoraron significativamente mediante la introducción de PSS-MA. Las partículas presentan buena estabilidad en solución tampón con un amplio rango de pH. Además, la presencia de grupo carboxilo ofrece la opción de conjugar proteínas a las nanopartículas. Tomando D-dímero y su anticuerpo como modelo, se encuentra que la característica óptica puede adaptarse a través del entrecruzamiento entre antígeno y anticuerpo-nanopartícula compuesto. Los resultados muestran que el GoldMag modificado con PSS-MA puede servir como candidato muy prometedor para detección óptica basada en inmunoensayos.

Abreviaturas

DLS:: Dispersión dinámica de luz
FTIR:: Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier
GoldMag:: Nanopartículas magnéticas de oro
MUA:: Ácido 11-mercaptoundecanoico
PEI:: Polietilenimina
PSS:: Poliestirensulfonato
PSS-MA:: Poli(ácido 4-estirensulfónico-co-maleico)
SPR:: Resonancia plasmonica de superficie
TEM:: Microscopio electrónico de transmisión
TGA:: Analizador termogravimétrico

Nanopartículas core-shell α-NaGdF₄/β-NaYF₄:Yb,Er solubles en agua: Síntesis controlada y luminiscencia upconversion superior Electrodo de compuerta de plata impreso por inyección de tinta y curado UV de baja resistividad: Un enfoque rápido, baja temperatura, alta adhesión

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