Las interacciones entre nanopartículas de oro y fármacos causan daño renal agudo en ratones: un estudio de toxicidad dependiente del tamaño

Resumen

Los nanomateriales son materiales innovadores con muchas propiedades útiles, pero existe preocupación por sus numerosos efectos desconocidos en los organismos vivos. Las nanopartículas de oro se utilizan ampliamente como materiales industriales debido a sus excelentes propiedades. Los peligros biológicos potenciales de las nanopartículas de oro son desconocidos; por ello, examinamos los efectos in vivo de nanopartículas de oro de 10, 50 y 100 nm de diámetro (GnP10, GnP50 y GnP100, respectivamente) y sus interacciones con fármacos en ratones para clarificar su seguridad en mamíferos. El cisplatino, el paraquat y el ácido 5-aminosalicílico causan daño hepático y renal en ratones. No se observó hepatotoxicidad ni nefrotoxicidad cuando se administró cualquiera de las nanopartículas de oro por sí sola por vía intravenosa. En cambio, la coadministración de GnP10 con cisplatino, paraquat o ácido 5-aminosalicílico provocó daño renal. Esto sugiere que las nanopartículas de oro con un tamaño de partícula de 10 nm son potencialmente nefrotóxicas debido a su interacción con fármacos.

Introducción

La nanotecnología desempeña un papel cada vez más importante en el siglo XXI, y los nanomateriales sustentan el progreso en este campo. Los avances recientes en la fabricación de nanopartículas han facilitado el uso de nanomateriales innovadores en todo el mundo. Los nanomateriales tienen un diámetro de 100 nm o menos; ejemplos incluyen nanopartículas de oro, plata, sílice, platino y dióxido de titanio, así como fullerenos y nanotubos de carbono. Estos materiales pueden encontrar aplicación en tecnología de almacenamiento electrónico, medicina genética/regenerativa y dispositivos electrónicos, y son la base de nuevas industrias en el siglo XXI. Sin embargo, nanopartículas como las PM2.5 causan contaminación ambiental grave, enfermedades respiratorias como el asma y cardiopatía isquémica. Además, las partículas diésel emitidas por automóviles pueden tener efectos biológicos al entrar en el cerebro y los órganos reproductivos, las partículas fibrosas finas como el asbesto inducen mesotelioma, y los nanomateriales fibrosos industriales como los nanotubos de carbono pueden afectar negativamente la salud humana. Por tanto, quedan muchas incógnitas sobre los efectos biológicos de las nanopartículas.

El oro (Au) tiene baja tendencia a la ionización y alta estabilidad, y se ha utilizado como metal precioso con fines decorativos desde la antigüedad. Las nanopartículas de oro desarrolladas recientemente se usan ampliamente en aplicaciones médicas e ingeniería debido a sus propiedades ópticas características, y sus excelentes propiedades optoelectrónicas han resultado en su uso en células solares orgánicas, sondas de sensores y materiales conductores. Las nanopartículas de oro se utilizan en la industria química como catalizadores para la síntesis de resinas acrílicas. También exhiben una actividad catalítica superior a baja temperatura para oxidar CO en comparación con nanopartículas de platino, lo que resulta en su uso como catalizador de purificación de gases de escape. Se esperan más aplicaciones de las nanopartículas de oro en el futuro, pero ha habido poca investigación sobre la toxicidad de las nanopartículas de oro y su potencial interacción con fármacos.

El campo de la nanotecnología se expande a medida que los investigadores exploran la seguridad, farmacología y farmacocinética de las nanopartículas. Se ha demostrado que las nanopartículas de sílice causan citotoxicidad, hepatotoxicidad y daño placentario, y los nanotubos de carbono pueden inducir mesotelioma pulmonar. Sin embargo, se sabe poco de los efectos farmacológicos resultantes de las interacciones entre nanopartículas y fármacos. En este estudio, investigamos la toxicidad de partículas de oro de 10, 50 y 100 nm de diámetro (GnP10, GnP50 y GnP100, respectivamente) en ratones para clarificar su seguridad en mamíferos. Además, examinamos los efectos de estas nanopartículas sobre la toxicidad del paraquat (PQ, un conocido hepatotoxina y nefrotoxina), cisplatino (CDDP, un agente antitumoral ampliamente utilizado) y ácido 5-aminosalicílico (5-ASA, un antiinflamatorio común).

Resultados y discusión

Primero medimos el tamaño de las nanopartículas de oro usando un Zetasizer y observamos las partículas mediante microscopía electrónica de transmisión (Fig. 1a, b, c). Los diámetros medios de las nanopartículas GnP10, GnP50 y GnP100 fueron 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 y 97,0 ± 27,1 nm, respectivamente (Fig. Supl. 1). Además, las nanopartículas de oro se agregan cuando se miden por microscopía electrónica, pero no se agregan cuando se administran a ratones. Medimos la concentración de iones de oro por ICP-MS, pero no se detectaron iones (datos no mostrados). Las superficies de las nanopartículas de oro se modificaron con ácido cítrico para aumentar la afinidad de las nanopartículas por el agua, pero esta modificación no exhibió otra funcionalidad.

Examinamos si las GnP exhiben hepatotoxicidad y nefrotoxicidad administrando una dosis máxima de 4 mg/kg a ratones por vena cola. No se observó hepatotoxicidad ni nefrotoxicidad cuando se administraron nanopartículas de oro por sí solas (Fig. 2). Los valores de ALT y AST de ratones administrados con GnP10, 50 y 100 por sí solos (Fig. 2a, b) fueron similares a los valores de control, al igual que los valores de BUN y Cr. Una sola administración de GnP a ratones no indujo daño hepático ni renal, ni daño cardíaco, pulmonar o esplénico (Fig. Supl. 2), lo que indica que las nanopartículas de oro no son tóxicas cuando se administran solas a ratones.

Se ha reportado que el daño hepático y renal es inducido por la coadministración de nanopartículas de sílice, nanarcillas o nanopartículas de poliestireno con fármacos o químicos. Por tanto, coadministramos nanopartículas de oro con PQ (una toxina hepatorrenal) o los fármacos CDDP o 5-ASA (que causan efectos adversos hepatotóxicos y nefrotóxicos). La Figura 2 muestra los resultados de la interacción entre nanopartículas de oro y CDDP. La coadministración de GnP10 o GnP50 con CDDP aumentó la ALT e indujo daño hepático (Fig. 2a), y la coadministración de GnP10 con CDDP aumentó BUN y Cr, induciendo daño renal (Fig. 2c, d). Luego investigamos la interacción entre GnP y 5-ASA, un antiinflamatorio ampliamente utilizado que causa daño hepático y renal. La coadministración de GnP10 o GnP50 con CDDP aumentó ALT e indujo daño hepático (Fig. 3a), mientras que la coadministración con 5-ASA aumentó BUN y Cr e indujo daño renal (Fig. 3c, d). A continuación, investigamos la interacción entre GnP y PQ, un agroquímico ampliamente utilizado que causa daño hepático y renal. La coadministración de GnP10 y PQ aumentó los niveles de BUN y Cr e indujo daño renal (Fig. 4c, d) pero no daño hepático (Fig. 4a, b). La coadministración de las partículas de oro más pequeñas probadas, GnP10, con CDDP, 5-ASA o PQ resultó en los valores más altos de ALT, BUN y Cr observados en este estudio. Las partículas 10 veces más grandes de GnP100 no causaron daño hepático ni renal cuando se coadministraron con CDDP, 5-ASA o PQ. Estos resultados muestran que GnP es tóxica cuando partículas de menos de 100 nm de diámetro se coadministran con CDDP, 5-ASA o PQ.

La observación renal de hematoxilina y eosina tras la coadministración de GnP10 con CDDP, 5-ASA o PQ (Fig. 5) mostró daño tubular, sugiriendo la inducción de lesión renal aguda. A continuación, medimos IL-6 y TNF-α en suero para investigar la causa subyacente del daño renal agudo inducido por GnP10. La Figura 6 muestra los niveles séricos de IL-6 a las 3 h tras la coadministración de GnP10 con CDDP, 5-ASA o PQ. La IL-6 no se detectó en el grupo solo GnP10, pero se observó un aumento de IL-6 cuando GnP10 se coadministró con CDDP, 5-ASA o PQ. El TNF-α no se detectó en ningún grupo (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la IL-6 está involucrada en el daño renal agudo inducido por GnP10 y CDDP, 5-ASA o PQ.

Investigamos el efecto de la coadministración de nanopartículas de oro y fármacos sobre los efectos secundarios (es decir, daño hepático y renal). La partícula de menor tamaño, GnP10, indujo daño renal y hepático tras coadministración con CDDP, 5-ASA o PQ. También coadministramos GnP10 con paracetamol, estreptomicina o tetraciclina a ratones y no observamos daño hepático ni renal (datos no mostrados). Previamente reportamos que las nanopartículas de sílice inducen daño hepático dependiendo del tamaño de partícula, y las nanopartículas de poliestireno pueden inducir daño hepático tras coadministración con un fármaco, dependiendo del tamaño de partícula. Xia et al. reportaron que nanopartículas de oro más pequeñas son más genotóxicas in vitro. En conjunto, las nanopartículas de oro se vuelven altamente tóxicas debido a interacciones con fármacos a medida que se reduce el tamaño de partícula.

La coadministración de GnP10 con cisplatino, 5-ASA o PQ aumentó los niveles de IL-6 (Fig. 6). La IL-6 no se elevó por administración de GnP10 sola (Fig. 6) ni por administración de CDDP, PQ o 5-ASA sola (datos no mostrados). Previamente se reportó que la IL-6 está involucrada en la inducción de daño hepático y renal agudo. Creemos que GnP10 induce IL-6, que a su vez induce daño hepático y renal, pero el mecanismo subyacente permanece sin clarificar. Bauza et al. reportan que la IL-6 induce daño hepático induciendo factores de transcripción en hepatocitos. Entender la participación de factores de transcripción específicos de tipo celular en el daño hepático y renal inducido por IL-6 requerirá más experimentos sobre el mecanismo detrás de la citotoxicidad de las nanopartículas de oro.

Recientemente, las nanopartículas de oro han atraído atención como biomaterial funcional usado en sistemas de administración de fármacos, y la investigación sobre tratamiento del cáncer usando nanopartículas de oro se está realizando activamente. Por ejemplo, Anselmo et al. reportaron que nanopartículas de sílice-oro recubiertas con PEG aumentaron la temperatura local al absorber luz y disolvieron térmicamente tumores sólidos, mostrando que las nanopartículas de oro son materiales prometedores para tratamiento del cáncer. Sin embargo, encontramos que la interacción entre el fármaco anticancerígeno cisplatino y nanopartículas de oro indujo daño renal (Fig. 2), sugiriendo que el uso de nanopartículas de oro en tratamiento del cáncer requiere estudio de su seguridad cuando se coadministran con el fármaco.

Conclusiones

En resumen, GnP10 causó daño renal tras coadministración con CDDP, PQ o 5-ASA. GnP50 causó daño renal solo cuando se coadministró con 5-ASA, mientras que GnP100 no lo hizo. Demostramos que las nanopartículas de oro pueden causar daño renal y que este efecto puede exacerbarse sinérgicamente como resultado de interacciones con químicos o fármacos. Se requerirán más estudios basados en estos datos para elucidar completamente los perfiles toxicológicos de nanopartículas propuestas para uso diagnóstico o terapéutico.

Materiales y métodos

Materiales

Suspensiones de partículas de oro recubiertas con ligando citrato de 10, 50 y 100 nm de diámetro se obtuvieron de NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, EE. UU.). Las distribuciones de tamaño de las partículas se analizaron usando un Zetasizer (Sysmex Co., Kobe, Japón) y un microscopio electrónico de transmisión TEM JEOL JEM-1011. Los diámetros medios fueron 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 y 87,0 ± 27,1 nm (Fig. 1, Fig. Supl. 1). Suspensiones acuosas (1 mg/mL) se dispersaron completamente por sonicación antes de usar y se diluyeron con agua. La presencia de oro ionizado en las suspensiones de nanopartículas de oro se examinó por ICP-MS, y no se detectó oro ionizado. Volúmenes idénticos de cada suspensión se inyectaron en ratones para cada experimento. Los tamaños geométricos de las partículas se caracterizaron por TEM. Paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), cisplatino y ácido 5-aminosalicílico (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) se disolvieron en suero fisiológico y almacenaron a −20 °C hasta su uso. Todos los reactivos fueron de grado de investigación.

Animales

Ratones machos BALB/c de 8 semanas se compraron de Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Japón). Los animales se mantuvieron en un ambiente controlado (temperatura 23 ± 1,5 °C; ciclo luz/oscuridad 12 h) con acceso libre a alimento estándar para roedores y agua. A los ratones se les dio 1 semana para aclimatar antes de iniciar los experimentos. Los protocolos experimentales se ajustaron a las directrices éticas de la Escuela de Graduados de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad Teikyo Heisei, compiladas a partir de las Directrices para Experimentación Animal de la Asociación Japonesa de Ciencias de Animales de Laboratorio.

Análisis bioquímicos

La alanina aminotransferasa sérica (ALT), aspartato aminotransferasa sérica (AST), nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina (Cr) se midieron usando kits comerciales (Wako Pure Chemical Industries) según los protocolos del fabricante. Brevemente, suero recolectado (10 mL) se combinó con 1 mL de reactivo color A (que contiene ureasa) e incubó a 37 °C por 15 min. Tras la adición de 1 mL de reactivo color B, la muestra se incubó a 37 °C por 10 min. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 570 nm. La interleucina (IL)-6 y TNF-α se analizaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (BioSource International, CA, EE. UU.). Todos los análisis se realizaron estrictamente según las instrucciones del fabricante.

Análisis histológico

A las 24 h post-administración de la dosis, los animales fueron sacrificados y los hígados extraídos y fijados con paraformaldehído al 4%. Tras procesamiento y seccionado, secciones finas de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina para observación histológica.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con los formularios complementarios Statcel, 3rd Excel Software (EMS publication Co., Ltd., Saitama, Japón). Todos los datos se presentan como medias ± error estándar de la media (SEM). Las diferencias significativas entre grupos control y experimentales se determinaron usando la prueba de Dunnett; un valor P menor a 0,05 se consideró significativo.

Disponibilidad de datos y materiales

No aplicable.

Abreviaturas

ALT:

Alanina aminotransferasa

AST:

Aspartato aminotransferasa

BUN:

Nitrógeno ureico en sangre

PQ:

Paraquat

Cr:

Creatinina