La toxicidad de las nanopartículas de oro en ratones debido a la interacción entre nanopartículas y fármacos induce daño renal agudo

Resultados y discusión

Primero medimos los tamaños de partícula de las nanopartículas de oro usando un Zetasizer, luego observamos las partículas usando microscopía electrónica de transmisión (Fig. 1a, b, c). Los diámetros medios de las nanopartículas de GnP10, GnP50 y GnP100 fueron 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 y 97,0 ± 27,1 nm, respectivamente (Fig. 1 complementaria). Además, las nanopartículas de oro se agregan cuando se miden mediante microscopía electrónica, pero no se agregan cuando se administran a ratones. Además, medimos la concentración de iones de oro mediante ICP-MS, pero no se detectaron iones (datos no mostrados). Las superficies de las nanopartículas de oro se modificaron con ácido cítrico para aumentar la afinidad de las nanopartículas por el agua, pero esta modificación no mostró ninguna otra funcionalidad.

Ultraestructuras de nanopartículas de oro. Micrografías electrónicas de GnP10 ( a ), GnP50 ( b ) y GnP100 ( c ) nanopartículas

Examinamos si GnP exhibe hepatotoxicidad y nefrotoxicidad al administrar una dosis máxima de 4 mg / kg a ratones a través de la vena de la cola. No se observó hepatotoxicidad o nefrotoxicidad cuando se administraron nanopartículas de oro solas (Fig. 2). Los valores de ALT y AST de los ratones a los que se les administró GnP10, 50 y 100 solos (Fig. 2a, b) fueron similares a los valores de control, al igual que los valores de BUN y Cr. Una sola administración de GnP a ratones no indujo daño hepático o renal, ni daño cardíaco, pulmonar o bazo (Fig. 2 complementaria), lo que indica que las nanopartículas de oro no son tóxicas cuando se administran solas a ratones.

Efecto de las nanopartículas de oro sobre la toxicidad inducida por cisplatino. Se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal cisplatino (CDDP) a 0 (barras abiertas) o 100 μmol / kg (barras sólidas), junto con una inyección intravenosa de vehículo o nanopartículas de oro (4 mg / kg). 24 h después de la inyección, los niveles séricos de las enzimas hepáticas alanina aminotransferasa (ALT; panel a ) y aspartato aminotransferasa (AST; panel b ) y niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN; panel c ) y creatinina (Cr; panel d ) se determinaron utilizando kits disponibles comercialmente (consulte la sección "Análisis bioquímicos"). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM; n =4). Diferencia significativa (* P <0.05, ** P <0.01) entre los grupos tratados con vehículo y con CDDP

Se ha informado que el daño hepático y renal es inducido por la coadministración de nanopartículas de sílice, nanoarcillas o nanopartículas de poliestireno con fármacos o productos químicos [14, 21, 22]. Por lo tanto, coadministramos nanopartículas de oro con PQ (una toxina hígado-riñón) o los medicamentos CDDP o 5-ASA (que causan efectos nefrotóxicos hepáticos adversos). La Figura 2 muestra los resultados de la interacción entre nanopartículas de oro y CDDP. La coadministración de GnP10 o GnP50 y CDDP aumentó la ALT e indujo daño hepático (Fig. 2a), y la coadministración de GnP10 y CDDP aumentó BUN y Cr, induciendo daño renal (Fig. 2c, d). Luego investigamos la interacción entre GnP y 5-ASA, un fármaco antiinflamatorio ampliamente utilizado que causa daño hepático y renal. La coadministración de GnP10 o GnP50 con CDDP aumentó la ALT e indujo daño hepático (Fig. 3a), mientras que la coadministración con 5-ASA aumentó BUN y Cr e indujo daño renal (Fig. 3c, d). A continuación, investigamos la interacción entre GnP y PQ, un agroquímico ampliamente utilizado que causa daño hepático y renal. La coadministración de GnP10 y PQ aumentó los niveles de BUN y Cr e indujo daño renal (Fig. 4c, d) pero no daño hepático (Fig. 4a, b). La coadministración de las partículas de oro más pequeñas probadas, GnP10, con CDDP, 5-ASA o PQ resultó en los valores más altos de ALT, BUN y Cr observados en este estudio. Las partículas 10 veces más grandes de GnP100 no causaron daño hepático o renal cuando se administraron concomitantemente con CDDP, 5-ASA o PQ. Estos resultados muestran que la GnP es tóxica cuando se coadministran partículas de menos de 100 nm de diámetro con CDDP, 5-ASA o PQ.

Efecto de las nanopartículas de oro sobre la toxicidad inducida por el ácido 5-aminosalicílico. A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) a 0 (barras abiertas) o 500 mg / kg (barras sólidas), junto con una inyección intravenosa de vehículo o nanopartículas de oro (4 mg / kg). 24 h después de la inyección, los niveles séricos de las enzimas hepáticas alanina aminotransferasa (ALT; a ) y aspartato aminotransferasa (AST; B), y niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN; c ) y creatinina (Cr; d ) se determinaron utilizando kits disponibles comercialmente (consulte la sección "Análisis bioquímicos"). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM; n =4). Diferencia significativa (* P <0.05, ** P <0,01) entre los grupos tratados con vehículo y con 5-ASA

Efecto de las nanopartículas de oro sobre la toxicidad inducida por el paraquat. A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal paraquat (PQ) a 0 (barras abiertas) o 50 mg / kg (barras sólidas), junto con una inyección intravenosa de vehículo o nanopartículas de oro (4 mg / kg). 24 h después de la inyección, los niveles séricos de las enzimas hepáticas alanina aminotransferasa (ALT; a ) y aspartato aminotransferasa (AST; b ) y niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN; c ) y creatinina (Cr; d ) se determinaron utilizando kits disponibles comercialmente (consulte la sección "Análisis bioquímicos"). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM; n =4). Diferencia significativa (* P <0.05, ** P <0,01) entre los grupos tratados con vehículo y con PQ

La observación de hematoxilina y eosina renal después de la coadministración de GnP10 con CDDP, 5-ASA o PQ (Fig. 5) mostró daño en los túbulos, lo que sugiere la inducción de una lesión renal aguda. A continuación, medimos IL-6 y TNF-α en suero para investigar la causa subyacente del daño renal agudo inducido por GnP10. La Figura 6 muestra los niveles de IL-6 en suero 3 h después de la coadministración de GnP10 con CDDP, 5-ASA o PQ. No se detectó IL-6 en el grupo de GnP10 solo, pero se observó un aumento de IL-6 cuando se coadministró GnP10 con CDDP, 5-ASA o PQ. No se detectó TNF-α en ningún grupo (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la IL-6 está involucrada en el daño renal agudo inducido por GnP10 y CDDP, 5-ASA o PQ.

Análisis histológico de tejidos renales de ratones tratados con nanopartículas de oro. En las 24 h posteriores a la administración intravenosa de solo GnP10 ( a ), GnP10 con CDDP ( b ), GnP10 con 5-ASA ( c ) y GnP10 con PQ ( d ), los tejidos se recolectaron, se fijaron con paraformaldehído al 4%, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las flechas designan los sitios de daño renal

Niveles de IL-6 en suero, medidos por ELISA. Los ratones recibieron una inyección intravenosa de GnP10 con CDDP, 5-ASA o PQ. Los niveles de citocinas se midieron 3 h después de la administración. Los valores son la media ± error estándar (SE; n =4)

Investigamos el efecto de la coadministración de nanopartículas de oro y fármacos sobre los efectos secundarios (es decir, daño hepático y renal). El tamaño de partícula más pequeño, GnP10, indujo daño renal y hepático tras la coadministración con CDDP, 5-ASA o PQ. También coadministramos GnP10 con acetaminofén, estreptomicina o tetraciclina a ratones y no observamos daño hepático o renal (datos no mostrados). Anteriormente informamos que las nanopartículas de sílice inducen daño hepático, dependiendo del tamaño de partícula [23], y las nanopartículas de poliestireno pueden inducir daño hepático tras la coadministración con un fármaco, dependiendo del tamaño de partícula [24]. Xia y col. informó que las nanopartículas de oro más pequeñas son más genotóxicas in vitro [25]. En conjunto, las nanopartículas de oro se vuelven altamente tóxicas debido a las interacciones con los medicamentos a medida que se reduce el tamaño de las partículas.

La coadministración de Gnp10 con cisplatino, 5-ASA o PQ aumentó los niveles de IL-6 (Fig. 6). La IL-6 no se elevó por la administración de GnP10 sola (Fig. 6) o por la administración de CDDP, PQ o 5-ASA solo (datos no mostrados). Se informó anteriormente que la IL-6 participa en la inducción de daño hepático [26] y renal agudo [27, 28]. Creemos que Gnp10 induce IL-6, que a su vez induce daño hepático y renal, pero el mecanismo subyacente sigue sin estar claro. Bauza y col. informan de que la IL-6 induce daño hepático al inducir factores de transcripción en los hepatocitos [29]. Comprender la participación de los factores de transcripción específicos de las células en el daño hepático y renal inducido por IL-6 requerirá más experimentos sobre el mecanismo detrás de la citotoxicidad de las nanopartículas de oro.

Recientemente, las nanopartículas de oro han atraído la atención como un biomaterial funcional utilizado en sistemas de administración de fármacos [30], y se está llevando a cabo activamente una investigación sobre el tratamiento del cáncer con nanopartículas de oro. Por ejemplo, Anselmo et al. informó que las nanopartículas de sílice-oro recubiertas de PEG aumentaron la temperatura local al absorber la luz y los tumores sólidos disueltos térmicamente [31], lo que demuestra que las nanopartículas de oro son materiales prometedores para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, encontramos que la interacción entre el fármaco contra el cáncer cisplatino y las nanopartículas de oro inducía daño renal (Fig. 2), lo que sugiere que el uso de nanopartículas de oro en el tratamiento del cáncer requiere un estudio de su seguridad cuando se coadministran con el fármaco.

Conclusiones

En resumen, la Gnp10 causó daño renal tras la coadministración con CDDP, PQ o 5-ASA. La GnP50 causó daño renal solo cuando se coadministra con 5-ASA, mientras que la GnP100 no lo hizo. Demostramos que las nanopartículas de oro pueden causar daño renal y que este efecto puede exacerbarse sinérgicamente como resultado de interacciones con sustancias químicas o medicamentos. Se necesitarán más estudios basados ​​en estos datos para dilucidar completamente los perfiles toxicológicos de las nanopartículas propuestas para uso diagnóstico o terapéutico.

Materiales y métodos

Materiales

Se obtuvieron suspensiones de partículas de oro cubiertas con citrato-ligando de 10, 50 y 100 nm de diámetro de NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, EE. UU.). Las distribuciones de tamaño de las partículas se analizaron usando un Zetasizer (Sysmex Co., Kobe, Japón) y un microscopio electrónico de transmisión TEM JEOL JEM-1011. Los diámetros medios fueron 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 y 87,0 ± 27,1 nm (Figura 1, Figura complementaria 1). Las suspensiones acuosas (1 mg / ml) se dispersaron completamente mediante sonicación antes de su uso y se diluyeron con agua. La presencia de oro ionizado en las suspensiones de nanopartículas de oro se examinó mediante ICP-MS y no se detectó oro ionizado. Se inyectaron volúmenes idénticos de cada suspensión en ratones para cada experimento. Los tamaños geométricos de las partículas se caracterizaron por TEM. Se disolvieron paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), Cisplatino y ácido 5-aminosalicílico (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) en solución salina y se almacenaron a -20 ° C hasta su uso. Todos los reactivos fueron de grado de investigación.

Animales

Se adquirieron ratones macho BALB / c de ocho semanas de Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Japón). Los animales se mantuvieron en un ambiente controlado (temperatura 23 ± 1,5 ° C; ciclo de luz / oscuridad de 12 h de luz) con acceso libre a agua y comida estándar para roedores. A los ratones se les dio 1 semana para aclimatarse antes de iniciar los experimentos. Los protocolos experimentales se ajustaron a las pautas éticas de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad Teikyo Heisei, compiladas a partir de las Pautas para la experimentación con animales de la Asociación japonesa de ciencias de los animales de laboratorio.

Análisis bioquímicos

Se midieron la alanina aminotransferasa sérica (ALT), la aspartato aminotransferasa sérica (AST), el nitrógeno ureico en sangre (BUN) y la creatinina (Cr) utilizando kits disponibles comercialmente (Wako Pure Chemical Industries) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Brevemente, el suero recolectado (10 mL) se combinó con 1 mL de reactivo de color A (que contenía ureasa) y se incubó a 37 ° C durante 15 min. Después de la adición de 1 mL de reactivo de color B, la muestra se incubó a 37 ° C durante 10 min. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 570 nm. La interleucina (IL) -6 y el TNF-α se analizaron usando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) (BioSource International, CA, EE. UU.). Todos los análisis se realizaron en estricta conformidad con las instrucciones del fabricante.

Análisis histológico

A las 24 h de la administración de la dosis, se sacrificaron los animales, se extrajeron los hígados y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Después del procesamiento y corte, se tiñeron secciones delgadas de tejido con hematoxilina y eosina para observación histológica.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con los formularios complementarios de Statcel, 3rd Excel Software (publicación EMS Co., Ltd., Saitama, Japón). Todos los datos se presentan como medias ± error estándar de la media (SEM). Las diferencias significativas entre los grupos de control y experimentales se determinaron mediante la prueba de Dunnett; a P un valor inferior a 0,05 se consideró significativo.

Disponibilidad de datos y materiales

No aplica.

Abreviaturas

ALT:

Alanina aminotransferasa

AST:

Aspartato aminotransferasa

BUN:

Nitrógeno ureico en sangre

PQ:

Paraquat

Cr:

Creatinina

Dos efectos de transparencia inducidos por plasma conmutables en un sistema con resonadores de grafeno distintos Síntesis de nanopartículas de oro de varios tamaños mediante el método de reducción química con diferente polaridad del disolvente