Quimioterapia dirigida: Nanopartículas de sílice mesoporosa funcionalizadas con aptámero entregan doxorrubicina directamente a células leucémicas

Introducción

Leucemia linfoblástica aguda (LLA) es tumor maligno heterogéneo que pone en grave riesgo salud humana [1,2,3]. Unos 6000 casos LLA diagnosticados cada año EE. UU., especialmente niños y adolescentes. LLA es cáncer más común entre niños y causa más común muerte cáncer antes edad 20 [4].

Quimiorradioterapia y trasplante células madre hematopoyéticas médula ósea son tratamientos estándar LLA. Radioterapia asociada efectos secundarios sistémicos sustanciales y sitios óptimos exposición inciertos. Trasplante células madre hematopoyéticas a menudo no factible por costo, edad paciente, y falta médula donante. Quimioterapia puede ser efectiva eliminando focos distantes y previniendo recurrencia, pero solo fracción mayoría fármacos anti‑tumor llegan tumores vía circulación. Esto resulta baja biodisponibilidad fármaco y pobre selectividad células enfermas sobre normales, aumentando riesgo reacciones adversas graves y resistencia fármacos.

Sistemas nano‑entrega fármacos pueden proveer entrega mucho más efectiva y dirigida fármacos anti‑tumor que fármacos solos, incluyendo liberación fármaco desencadenada condiciones específicas microambiente tumoral [5, 6]. Entre tales sistemas, nanopartículas sílice mesoporosa (MSN) han atraído atención por su gran superficie modificable; volumen poro ajustable, capaz transportar diferentes cantidades y tipos fármacos; y buena biocompatibilidad [7, 8]. Modificaciones superficie grupos funcionales respuesta permiten crear MSN liberan fármaco condiciones específicas, mientras modificaciones moléculas directoras llevan MSN entregar fármaco selectivamente tejido deseado [9, 10].

Un tipo molécula directora compatible MSN son aptámeros, ADN o ARN monocatenario que actúan como "anticuerpos químicos" unir específicamente y firmemente objetivos. Aptámeros son más pequeños y fáciles preparar y modificar que anticuerpos monoclonales, penetran tejido mejor y muestran menor toxicidad e inmunogenicidad. Por tanto, aptámeros ampliamente usados detección tumor y quimioterapia dirigida [11,12,13]. Método SELEX usado identificar aptámero Sgc8 que une específicamente células CEM leucemia linfocítica aguda T humana [14, 15]. Sgc8 reconoce proteína tirosina quinasa‑7 (PTK‑7) membrana célula CEM. Añadir Sgc8 fármacos quimioterapéuticos y ciertos nanomateriales puede mejorar dirigir y matar células leucémicas [16, 17].

Hemos diseñado sistema nanopartículas sílice fluorescentes modificadas aptámero Sgc8 (Sgc8‑FSNP) detectar células leucémicas alta sensibilidad y especificidad, útil no solo diagnóstico leucemia sino también entrega dirigida fármacos anti‑leucemia [18]. Basado este trabajo, presente estudio encapsulamos doxorrubicina (Dox) en MSN, decoramos con Sgc8 (Fig. 1). Resultantes Sgc8‑MSN/Dox mostraron buena morfología y tamaño entrega fármaco, y nanopartículas internalizadas selectivamente células leucémicas cultivo, llevando muerte efectiva células tumorales. Propósito este estudio revelar que nanopartículas sílice mesoporosa modificadas aptámero no solo pueden dirigir diagnóstico tumores, sino también matar tumores cargando fármacos, proveyendo ideas teranóstica dirigida tumores.

Ilustración esquemática nanopartículas sílice mesoporosa modificadas aptámero Sgc8 para sistema eficiente entrega fármacos dirigido células. Célula CEM, CCRF‑CEM leucemia linfocítica aguda T humana; Dox, doxorrubicina; MSN, nanopartícula sílice modificada; PTK‑7, proteína tirosina quinasa‑7

Materiales y métodos experimentales

Reactivos y materiales

Clorhidrato doxorrubicina (Dox) comprado Beijing Huafeng United Technology (Beijing, China). Tetraetilortosilicato (TEOS) grado analítico y 3‑Trietoxisililpropilamina (APTES) comprados Shanghai Chemical Reagent Factory I (Shanghai, China), y bromuro cetil‑trimetilamonio (CTAB, 99 % pureza) Shanghai Jizhi Biochemical Technology (Shanghai, China). Todos demás reactivos grado analítico. Aptámero Sgc8 modificado carboxilo (5′‑ATCTAACTGCCGCCGCGGGAAAATGTACGGTTAG(T)₁₀‑COOH‑3′)[16] sintetizado Shanghai Bioengineering (Shanghai, China).

Líneas celulares

Siguientes líneas celulares compradas Banco Células Academia China Ciencias (Shanghai, China): línea celular leucemia linfocítica aguda T humana CCRF‑CEM, línea linfoma Burkitt B humana Ramos, línea hepática normal humana L02, y línea renal embrionaria humana 293T. Todas líneas celulares cultivadas 37 °C bajo 5 % CO₂ en DMEM suplementado 10 % suero fetal bovino (FBS, Hyclone) y penicilina‑estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.).

Preparación Sgc8‑MSN/Dox

MSN preparadas como descrito [19] disolviendo 0,50 g CTAB 240 mL agua ultrapura, añadiendo 1,75 ml solución 2 M NaOH, calentando 80 °C baño aceite. Bajo agitación fuerte, 2,50 mL TEOS añadido gota a gota, mezcla agitada continuamente 2 h hasta obtener precipitado blanco. Luego mezcla centrifugada 10 000 rpm 10 min, sobrenadante removido, precipitado lavado tres veces alternadamente agua ultrapura y etanol anhidro, y luego precipitado secado horno vacío 60 °C noche obtener MSN.

Sgc8‑MSN/Dox obtenido mezclando 0,2365 g MSN matraz tres cuellos 23,65 mL etanol absoluto, añadiendo 710 µL APTES gota a gota, y reflujo 24 h. Mezcla lavada tres veces alternadamente solución metanol‑HCl (4:1) y agua desionizada, luego secada obtener MSN‑NH₂. Temperatura ambiente, material MSN‑NH₂ puesto tubo centrífuga 10‑mL dispersado cantidad adecuada tampón fosfato salino (PBS), luego Dox (5 mg/mL) añadido gota a gota, mezcla agitada 24 h. Finalmente, aptámero Sgc8 modificado carboxilo (100 nM/mL) añadido, mezcla agitada 1 h, centrifugada, lavada PBS hasta incolora, resultando Sgc8‑MSN/Dox.

Caracterización Sgc8‑MSN/Dox

Patrones difracción rayos X (XRD) nanopartículas medidos difractómetro XRD D4 (Bruker Inc., Alemania). Isotermas adsorción‑desorción N₂ medidas analizador área superficial específica y tamaño poro (TriStar 3000, GA Inc., EE. UU.). Áreas superficiales BET calculadas gráfico BET. Distribución tamaño poro estimada rama adsorción isotermas método BJH. Tamaño partícula y potencial electrostático medidos analizador dispersión luz dinámica Nano S (Malvern Instruments, Reino Unido). Mediciones triplicadas cada muestra y promediadas. Tamaño partícula y morfología también evaluadas microscopía electrónica transmisión (H‑7650, Tokyo, Japón) voltaje aceleración haz electrones 100 kV. Mientras tanto, conjugación aptámero Sgcía superficie MSN evaluada espectroscopía FT‑IR (Nicolet‑5700, EE. UU.). Para detectar eficiencia aptámero‑modificado MSN/Dox, recogimos sobrenadante lavado proceso preparación Sgc8‑MSN/Dox y medimos valor absorción ultravioleta 260 nm, luego usando método curva estándar determinar cantidad aptámero no unido. Así cantidad modificación aptámero calculada restando cantidad no unido cantidad total añadida.

Liberación Dox desde Sgc8‑MSN/Dox

Liberación Dox desde Sgc8‑MSN/Dox medida in vitro sigue. Sgc8‑MSN/Dox (10 mg) disuelto 10 mL tampón pH 5,0 o 7,4 a 37 °C agitado 100 rpm. Tiempos predeterminados, muestras retiradas, centrifugadas 5000 rpm 10 min, sobrenadante ensayado Dox usando espectrofotometría descrito Thermo Scientific Microplate Reader (81 Wyman Street, Waltham, EE. UU.) 482 nm [9].

Capacidad dirigir Sgc8‑MSN/Dox

Células CEM o Ramos (3 × 10⁶) en PBS añadidas tubos centrífuga 15‑mL y mezcladas con Sgc8‑MSN/Dox o MSN/Dox (concentración aptámero, 200 nM). Tubos incubados 37 °C 20–30 min, luego células recogidas centrifugación, lavadas 3 veces PBS, fijadas 4 % paraformaldehído 30 min, lavadas 3 veces PBS. Células incubadas 5 min 1 mg/ml DAPI, lavadas 3 veces PBS y centrifugadas. Pelota celular resuspendida PBS y colocada portaobjetos análisis microscopía confocal fluorescencia (Nikon DS‑Ri1; Tokyo, Japón).

Experimentos separados, células CEM y Ramos (3 × 10⁵) fase crecimiento logarítmico resuspendidas mezcla 50 µL PBS, 45 µL tampón unión [PBS suplementado 5 mM MgCl₂, 4,5 g/L glucosa y 1 mg/ml albúmina suero bovino (BSA)], y 10 µL FBS [PBS suplementado 1 mg/ml albúmina suero bovino (BSA)] conteniendo materiales indicados concentración aptámero 200 nM. Mezcla agitada oscuridad 30 min 4 °C. Células lavadas tampón lavado, centrifugadas 1000 rpm 5 min, luego lavadas otras 3 veces. Finalmente, células resuspendidas 500 µL tampón lavado y analizadas citometría flujo (Beckman Coulter Epics X L; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EE. UU.).

Citotoxicidad MSN

Citotoxicidad MSN sin Dox o aptámero evaluada método MTT. Células CEM, Ramos, 293T, L‑02 fase crecimiento logarítmico añadidas placas 96‑pozos (1,5 × 10⁴/pozo). MSN (100 µL) añadidas cada pozo, placas cultivadas incubadora 5 % CO₂ 37 °C 24 o 48 h. MTT (20 µL) añadido cada pozo, placas incubadas 37 °C 30 min más, luego placas centrifugadas 1500 rpm 10 min, sobrenadantes cultivo descartados. DMSO (200 µL) añadido cada pozo, placas agitadas oscuridad 10 min, y densidad óptica (OD) 570 nm medida lector microplacas automático. Cada muestra probada seis réplicas, resultados expresados media ± DE.

Muerte celular por Sgc8‑MSN/Dox

Células CEM, Ramos, 293T, L‑02 en placas 96‑pozos (1 × 10⁵ células/pozo) incubadas 24 h con Dox libre, MSN/Dox, o Sgc8‑MSN/Dox concentraciones Dox 1, 5, 10, 15, 20 µg/mL. Para confirmar Sgc8‑MSN/Dox realmente dirigido matar células CEM través receptor aptámero, primero incubamos suficiente aptámero Sgc8 células CEM 2 h, luego incubamos con Sgc8‑MSN/Dox concentración Dox 20 µg/ml 24 h. Viabilidad comparada usando ensayo MTT descrito sección "Citotoxicidad MSN".

Análisis estadístico

Resultados analizados estadísticamente test t Student y análisis varianza unidireccional test diferencia significancia mínima. Todos análisis realizados GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

Resultados y discusión

Caracterización Sgc8‑MSN/Dox

Datos difracción rayos X muestran nanopartículas sintetizadas tienen pico difracción típico poros mesoporosos hexagonales rango X (Fig. 2a), confirmando estructura MSN. Para estudiar área superficial específica, distribución tamaño poro, y parámetros mesoporosos MSN, realizamos test adsorción‑desorción nitrógeno MSN. Isotermas adsorción‑desorción N₂ MSN (Fig. 2b) exhiben isotermas tipo IV característica, indicando características mesoporosas. Área superficial calculada modelo BET 1389 m²/g. Curva BJH muestra distribución tamaño poro partículas estrecha (Fig. 2b, inset). Tamaño poro 5,23 nm, volumen poro 2,51 cm³/g. Gran área superficial específica y volumen poro y ricos mesoporos hacen posible mayor capacidad carga fármaco y potencial excelente portador fármaco. Microscopía electrónica mostró Sgc8‑MSN/Dox buena dispersibilidad y tamaño uniforme, forma esférica o elíptica (Fig. 3a). Potencial zeta promedio MSN/Dox PBS −26,53 mV, disminuyó −33,87 mV Sgc8‑MSN/Dox (Fig. 3b), reflejando carga negativa aptámero Sgc8 [20]. Canales poro observados superficie silicio mesoporoso. PBS, MSN/Dox mostró tamaño partícula hidratación promedio 98,35 nm, aumentó 103,24 nm tras enlazar aptámero Sgc8 formar Sgc8‑MSN/Dox (Fig. 3c,d). Confirmar conjugación exitosa Sgc8‑MSN/Dox, análisis espectroscopía FT‑IR realizado. Espectro infrarrojo mostrado Fig. 3e. Picos 3400 cm⁻¹, 1100 cm⁻¹, 500 cm⁻¹ picos característicos sílice. Pico ~2400 cm⁻¹ pico agente plantilla CTAB. Pico ~1600 cm⁻¹ pico NH₂. Pico apareciendo ~1700 cm⁻¹ considerado pico estiramiento enlace C=O base cluster Dox cargado MSN. Nuevo pico 1650 cm⁻¹ debido base Schiff (–C=N–) generada reacción Sgc8 con NH₂‑MSN/Dox. Estas evidencias prueban sistema entrega fármacos Sgc8‑MSN/Dox preparado exitosamente. Detectar eficiencia aptámero‑modificado Sgc8‑MSN/Dox, usamos espectrofotómetro ultravioleta medir densidad absorción (OD) aptámero 260 nm, y calcular eficiencia modificación aptámero nanopartícula basado cambio valor OD antes y después modificación aptámero superficie nanopartícula. Espectros absorción ultravioleta‑visible (UV‑Vis) solución aptámero y sobrenadante mostrados Fig. 3e. Según cálculo, cantidad modificación aptámero Sgc8 Sgc8‑MSN/Dox ~6,87 nmol mg⁻¹ Sgc8‑MSN/Dox.

a XRD y b isotermas sorción nitrógeno MSN; (inset) Gráficos volumen poro y distribución tamaño poro MSN

Caracterización nanomateriales. a Micrografía electrónica Sgc8‑MSN/Dox. b Diagrama potencial nanopartículas. Distribución tamaño partícula c MSN/Dox y d Sgc8‑MSN/Dox. e Espectros FT‑IR nanomateriales: a MSN, b MSN/Dox, c Sgc8‑MSN/Dox. f Espectros UV‑Vis a solución aptámero Sgc8, b sobrenadante lavado proceso preparación Sgc8‑MSN/Dox

Liberación Dox desde Sgc8‑MSN/Dox in vitro

MSN/Dox y Sgc8‑MSN/Dox liberaron carga fármaco lentamente pH 7,4: no más 50 % fármaco liberado dentro 96 h (Fig. 4). Esto indica MSN pueden soportar liberación fármaco lenta durando 96 h, probablemente porque fármaco se extiende por canales internos silicio mesoporoso. Liberación mucho más rápida pH 5,0, con tasas liberación alcanzando 60 % 48 h y > 80 % 96 h. Curvas liberación Dox casi idénticas Sgc8‑MSN/Dox y MSN/Dox, sugiriendo ligación aptámero no afecta estructura nanopartícula. Mayor liberación pH ácido útil porque células tumorales entorno débilmente ácido y nanopartículas recubiertas Sgc8 internalizadas endosomas [15]. Nuestros resultados apoyan idea silicio mesoporoso puede acelerar liberación fármaco entorno ácido [21, 22].

Liberación doxorrubicina desde Sgc8‑MSN/Dox y MSN/Dox in vitro pH 5,0 o 7,4

Dirección células leucémicas por Sgc8‑MSN/Dox in vitro

Examinamos captación nanopartículas células leucemia linfocítica T CEM como células objetivo y células linfoma B Ramos como células no‑objetivo. Basado citometría flujo, células no‑objetivo internalizaron MSN/Dox extensión similar Sgc8‑MSN/Dox, mientras células objetivo internalizaron nanopartículas recubiertas aptámero mucho mayor extensión MSN/Dox (Fig. 5a). Consistente estos resultados, microscopía confocal fluorescencia mostró fuerte fluorescencia Dox (rojo) dentro células CEM expuestas Sgc8‑MSN/Dox, pero no dentro células Ramos tratadas misma manera (Fig. 5b). Estos reflejan capacidad establecida aptámero Sgc8 dirigir células leucémicas [20]. Sgc8 reconoce PTK‑7 superficie células CEM [18], reclutando nanopartículas superficie y haciendo su captación más eficiente [23]. Nuestros resultados sugieren Sgc8‑MSN/Dox puede dirigir células cancerosas expresan PTK‑7 sitios primarios bien como secundarios o circulación, útil control metástasis. Posible expandir enfoque MSN otros aptámeros otras especificidades dirigir [24, 25].

Dirección in vitro células leucémicas Sgc8‑MSN/Dox analizada usando a citometría flujo y b microscopía fluorescencia. Células CCRF‑CEM y Ramos incubadas MSN/Dox o Sgc8‑MSN/Dox, luego teñidas DAPI (azul). Dox apareció rojo. Barra escala, 100 µm

Citotoxicidad MSN

Dada importancia bioseguridad sistemas nano‑entrega fármacos [25], primero examinamos toxicidad MSN blanco contra CEM, Ramos, 293T, L‑02. Viabilidad todas líneas celulares permaneció > 90 % incluso tras incubación 48 h hasta 100 µg/mL MSN (Fig. 6). Esto sugiere MSN muestran citotoxicidad casi despreciable.

Citotoxicidad in vitro MSN. a CEM, b Ramos, c 293T, d L‑02 células tratadas concentraciones indicadas MSN, viabilidad medida

Luego investigamos capacidad Sgc8‑MSN/Dox matar células tumorales objetivo (CEM) y células no‑objetivo (Ramos, 293T, L‑02). Células incubadas diferentes concentraciones Dox libre, MSN/Dox, o Sgc8‑MSN/Dox 24 h, y viabilidad evaluada ensayo MTT. Contra células objetivo CEM, Dox libre mostró toxicidad ligeramente mayor que dos formulaciones MSN, mientras Sgc8‑MSN/Dox fue significativamente más tóxica MSN/Dox misma concentración fármaco (Fig. 7). Contra Ramos, 293T, L‑02, Dox libre mostró toxicidad significativamente mayor formulaciones MSN, que mostraron toxicidad similar con o sin Sgc8. Confirmar Sgc8‑MSN/Dox realmente dirigido matar células CEM través receptor aptámero PTK‑7, primero incubamos suficiente aptámero Sgc8 células CEM 2 h bloquear sitio unión y luego co‑incubamos con Sgc8‑MSN/Dox. Ensayo MTT mostró aptámero libre sin toxicidad células CEM, y tras suficiente aptámero Sgc8 bloquear sitio unión, Sgc8‑MSN/Dox mostró toxicidad significativamente menor grupo Sgc8‑MSN/Dox libre (Fig. 7e). Estos resultados destacan capacidad aptámero dirigir entrega fármaco y mejorar muerte células objetivo. Tal dirección puede ayudar reducir captación fármaco células no‑objetivo así como permitir uso dosis menores; ambos efectos reducen riesgo efectos secundarios tóxicos [26].

Capacidad Dox libre, MSN/Dox, Sgc8‑MSN/Dox matar a células CEM, b células Ramos, c células 293T, d células L‑02. e Capacidad matar células CEM aptámero libre, bloqueo (células CEM primero incuban suficiente Sgc8 2 h, luego incuban con Sgc8‑MSN/Dox), y Sgc8‑MSN/Dox

Los aptámeros pueden usarse moléculas guía entrega fármacos y varias macromoléculas o nanoportadores células tumorales, a veces aptámero también puede funcionar como terapéutico. Por ejemplo, aptámero AS1411 puede unir nucleolina específicamente, y nucleolina expresada en y superficie células tumorales involucrada diferenciación celular, supervivencia, inflamación, angiogénesis, y desarrollo tumor. Aptámero AS1411 puede inducir inhibición crecimiento modelos xenoinjerto (cáncer renal, pulmón, mama MX1, páncreas) uniéndose nucleolina [27]. Además, liposomas cargados doxorrubicina funcionalizados aptámero AS1411 (Apt‑Dox‑Lip) probados cáncer mama, resultados mostraron gran potencial aplicación [28]. Aptámeros han tenido éxito amplia gama ensayos clínicos debido excelentes propiedades. Primer aptámero aprobado FDA 2005 [29], desde entonces, más aptámeros alcanzado ensayos clínicos. Aptámeros aplicados ensayos clínicos anti‑tumor, incluyendo cáncer próstata [30], pulmón [31], leucemia mieloide aguda [32], etc. No duda estos ensayos clínicos relacionados aptámero dan nueva esperanza cambiar estilo convencional terapia.

Años recientes, aptámeros combinados diferentes nanomateriales terapia dirigida tumores. Puede verse aptámeros tienen capacidades extraordinarias reconocimiento molecular y dirección. Sin embargo, aún algunos problemas no pueden ignorarse desarrollo aplicación aptámeros, como si nucleasa afecta estabilidad aptámeros in vivo, si aptámeros sustancias bajo peso molecular entran cuerpo y son fácilmente eliminados rápido sistema renal, y si rendimiento dirección real in vivo factible. Para explotar pleno potencial nanomateriales basados aptámero dirigidos, más pruebas in vivo y experimentos clínicamente relevantes siguen foco investigación actual. Al mismo tiempo, teranóstica tumores dirección importante desarrollo futuro, y diseño y preparación más materiales biológicos multifuncionales son indudablemente tendencia desarrollo.

Conclusión

Hemos construido sistema entrega MSN modificado aptámero que puede dirigir eficientemente células leucémicas y promover captación Dox. Esta dirección, acoplada con capacidad MSN liberar carga fármaco lenta y preferentemente condiciones ácidas, puede ayudar sistema entrega acumular sitios tumorales y matar células continuamente. Posible dirigir casi cualquier tipo células tumorales con este enfoque MSN seleccionando aptámeros adecuados. Pero no puede ignorarse que Sgc8‑MSN/Dox también puede tener problemas mencionados, y su estabilidad in vivo y dirección aún necesitan más estudio. Próximamente, combinaremos investigación previa cargar sistema entrega fármacos tanto reactivos diagnóstico como fármacos, dándole función teranóstica diagnóstico dirigido y tratamiento dirigido.

Abreviaturas

MSN:

Nanopartículas sílice mesoporosa

Dox:

Doxorrubicina

Sgc8‑MSN/Dox:

Sistema entrega fármacos sílice mesoporosa modificada aptámero

PTK‑7:

Proteína tirosina quinasa‑7

TEOS:

Tetraetilortosilicato

APTES:

3‑Trietoxisililpropilamina

CTAB:

Bromuro cetil‑trimetilamonio

CEM:

Células CCRF‑CEM

PBS:

Salino fosfato tamponado