Un sistema eficiente de administración de fármacos dirigido a células basado en nanopartículas de sílice mesoporosa modificadas con aptámero

Materiales y métodos experimentales

Reactivos y materiales

El clorhidrato de doxorrubicina (Dox) se adquirió en Beijing Huafeng United Technology (Beijing, China). Se adquirieron tetraetilortosilicato de grado analítico (TEOS) y 3-trietoxisililpropilamina (APTES) de Shanghai Chemical Reagent Factory I (Shanghai, China), y bromuro de cetil-trimetilamonio (CTAB, 99% de pureza) de Shanghai Jizhi Biochemical Technology (Shanghai, China) . Todos los demás reactivos fueron de calidad analítica. Aptámero Sgc8 modificado con carboxilo (5′-ATCTAACTGCCGCCGCGGGAAAATGTACGGTTAG (T) ₁₀ -COOH-3 ′) [16] fue sintetizado por Shanghai Bioengineering (Shanghai, China).

Líneas celulares

Las siguientes líneas celulares se compraron en el Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China):la línea celular de leucemia de linfocitos T aguda humana CCRF-CEM, la línea celular de linfoma B de Burkitt humano de Ramos, la línea de células hepáticas normales humanas L02 , y la línea celular de riñón embrionario humano 293T. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C bajo 5% de CO ₂ en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, Hyclone) y penicilina-estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.).

Preparación de Sgc8-MSN / Dox

Los MSN se prepararon como se describe [19] disolviendo 0,50 g de CTAB en 240 ml de agua ultrapura, añadiendo 1,75 ml de una solución de NaOH 2 M y calentando a 80ºC en un baño de aceite. Con fuerte agitación, se añadieron lentamente gota a gota 2,50 ml de TEOS y la mezcla se agitó continuamente durante 2 h hasta que se obtuvo un precipitado blanco. Luego se centrifugó la mezcla a 10,000 rpm por 10 min, se removió el sobrenadante, se lavó el precipitado tres veces alternativamente con agua ultrapura y etanol anhidro, y luego se secó el precipitado en un horno de vacío a 60 ° C durante la noche para obtener MSNs.

Se obtuvo Sgc8-MSN / Dox mezclando 0.2365-g MSNs en un matraz de tres bocas con 23.65 mL de etanol absoluto, agregando 710-μL APTES gota a gota, y refluyendo durante 24 h. La mezcla se lavó tres veces alternativamente con una solución de metanol-HCl (4:1) y agua desionizada, luego se secó para producir MSNs-NH ₂ . A temperatura ambiente, el material MSNs-NH2 se colocó en un tubo de centrífuga de 10 ml y se dispersó en una cantidad adecuada de solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego se añadió gota a gota Dox (5 mg / ml) y la mezcla se agitó durante 24 h. Finalmente, se añadió aptámero de Sgc8 modificado con carboxilo (100 nM / ml) y la mezcla se agitó durante 1 h, se centrifugó y se lavó con PBS hasta que se volvió incolora, produciendo Sgc8-MSN / Dox.

Caracterización de Sgc8-MSN / Dox

Los patrones de difracción de rayos X (XRD) de las nanopartículas se midieron con un difractómetro XRD D4 (Bruker Inc., Alemania). Las isotermas de adsorción-desorción de N2 se midieron mediante un analizador de área de superficie específica y tamaño de poro (TriStar 3000, GA Inc., EE. UU.). Las áreas de superficie BET se calcularon a partir del gráfico BET. La distribución del tamaño de los poros se estimó a partir de la rama de adsorción de la isoterma mediante el método BJH. El tamaño de partícula y el potencial electrostático se midieron utilizando el analizador de dispersión de luz dinámica Nano S (Malvern Instruments, Reino Unido). Las mediciones se tomaron tres veces para cada muestra y se promediaron. El tamaño y la morfología de las partículas también se evaluaron mediante microscopía electrónica de transmisión (H-7650, Tokio, Japón) a un voltaje de aceleración del haz de electrones de 100 kV. Mientras tanto, la conjugación del aptámero Sgc8 a la superficie de MSN se evaluó mediante espectroscopía FT-IR (Nicolet-5700, EE. UU.). Para detectar la eficiencia de MSN / Dox modificado por aptámeros, recolectamos el sobrenadante de lavado en el proceso de preparación Sgc8-MSN / Dox y medimos el valor de absorción ultravioleta a 260 nm, y luego usamos el método de curva estándar para determinar la cantidad de aptámero libre. Por lo tanto, la cantidad de modificación del aptámero se puede calcular restando la cantidad de no consolidado de la cantidad total agregada.

Lanzamiento de Dox de Sgc8-MSN / Dox

Se midió la liberación de Dox de Sgc8-MSN / Dox in vitro como sigue. Se disolvió Sgc8-MSN / Dox (10 mg) en 10 ml de tampón a pH 5,0 o 7,4 a 37ºC y se agitó a 100 rpm. En momentos predeterminados, se retiraron las muestras, se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 min y se analizó la Dox en el sobrenadante utilizando espectrofotometría como se describe en Thermo Scientific Microplate Reader (81 Wyman Street, Waltham, EE. UU.) A 482 nm [9].

Capacidad de orientación de Sgc8-MSN / Dox

Células CEM o Ramos (3 × 10 ⁶ ) en PBS se añadieron a tubos de centrífuga de 15 ml y se mezclaron con Sgc8-MSN / Dox o MSN / Dox (concentración de aptámero, 200 nM). Los tubos se incubaron a 37 ° C durante 20-30 min, y luego las células se recolectaron por centrifugación, se lavaron 3 veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 min y se lavaron 3 veces con PBS. Las células se incubaron durante 5 min con 1 mg / ml de DAPI, se lavaron 3 veces con PBS y se centrifugaron. El sedimento celular se resuspendió en PBS y se colocó en portaobjetos para su análisis mediante microscopía confocal de fluorescencia ((Nikon DS-Ri1; Tokio, Japón).

En experimentos separados, las células CEM y Ramos (3 × 10 ⁵ ) en fase de crecimiento logarítmico se resuspendieron en una mezcla de 50 μL de PBS, 45 μL de tampón de unión [PBS suplementado con MgCl2 5 mM, 4,5 g / L de glucosa y 1 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA)] y 10 μL de FBS [PBS suplementado con 1 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA)] que contiene los materiales indicados a una concentración de aptámero de 200 nM. La mezcla se agitó en la oscuridad durante 30 min a 4ºC. Las células se lavaron en tampón de lavado, se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min y luego se lavaron otras 3 veces. Finalmente, las células se resuspendieron en 500 μL de tampón de lavado y se analizaron mediante citometría de flujo (Beckman Coulter Epics X L; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EE. UU.).

Citotoxicidad de MSN

La citotoxicidad de los MSN sin Dox o aptámero se evaluó mediante el método MTT. Se agregaron células CEM, Ramos, 293T y L-02 en fase de crecimiento logarítmico a placas de 96 pocillos (1,5 × 10 ⁴ /bien). Se agregaron MSN (100 μL) a cada pocillo y las placas se cultivaron en un 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C durante 24 o 48 h. Se agregó MTT (20 μL) a cada pocillo, las placas se incubaron a 37 ° C durante otros 30 min, luego las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 min y se descartaron los sobrenadantes del cultivo. Se añadió DMSO (200 μl) a cada pocillo, las placas se agitaron en la oscuridad durante 10 minutos y luego se midió la densidad óptica (DO) a 570 nm utilizando un lector de microplacas automático. Cada muestra se analizó con seis repeticiones y los resultados se expresaron como media ± DE.

Eliminación de células por Sgc8-MSN / Dox

Células CEM, Ramos, 293T y L-02 en placas de 96 pocillos (1 × 10 ⁵ células por pocillo) se incubaron durante 24 h con Dox, MSN / Dox o Sgc8-MSN / Dox libres a concentraciones de Dox de 1, 5, 10, 15 o 20 μg / ml. Para confirmar aún más que Sgc8-MSN / Dox fue efectivamente dirigido a matar células CEM a través del receptor aptámero, primero incubamos suficiente aptámero Sgc8 con células CEM durante 2 h, luego incubamos con sgc8-MSN / Dox a una concentración de Dox de 20 μg / ml durante 24 h. La viabilidad se comparó mediante el ensayo MTT como se describe en la sección "Citotoxicidad de MSN".

Análisis estadístico

Los resultados se analizaron estadísticamente utilizando la t de Student prueba y análisis de varianza unidireccional con la prueba de diferencia de menor significación. Todos los análisis se realizaron con GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

Resultados y discusión

Caracterización de Sgc8-MSN / Dox

Los datos de difracción de rayos X muestran que las nanopartículas sintetizadas tienen un pico de difracción típico de mesoporos hexagonales en el rango X (Fig. 2a), lo que confirma la estructura de MSN. Para estudiar más a fondo el área de superficie específica, la distribución del tamaño de los poros y los parámetros mesoporosos de MSN, realizamos una prueba de adsorción-desorción de nitrógeno en MSN. Las isotermas de adsorción-desorción de N2 de MSN (Fig. 2b) exhiben una característica de isoterma de tipo IV, lo que indica características mesoporosas. La superficie calculada por el modelo BET es 1389 m ² /gramo. La curva BJH muestra que la distribución del tamaño de los poros de las partículas es estrecha (figura 2b, recuadro). El tamaño de los poros es de 5,23 nm y el volumen de los poros es de 2,51 cm ³ /gramo. La gran superficie específica y el volumen de poros y los ricos mesoporos hacen posible tener una capacidad de carga de fármaco más fuerte y tienen el potencial de ser un excelente portador de fármacos. La microscopía electrónica mostró que Sgc8-MSN / Dox tenía buena dispersabilidad y tamaño uniforme, con forma esférica o elíptica (Fig. 3a). El potencial zeta promedio de MSN / Dox en PBS fue -26,53 mV, que disminuyó a -33,87 mV en Sgc8-MSN / Dox (Fig. 3b), reflejando la carga negativa en el aptámero Sgc8 [20]. Se observaron canales de poros en la superficie del silicio mesoporoso. En PBS, MSN / Dox mostró un tamaño de partícula de hidratación promedio de 98,35 nm, que aumentó a 103,24 nm después de unir el aptámero Sgc8 para producir Sgc8-MSN / Dox (Fig. 3 c, d). Para confirmar aún más la conjugación exitosa de Sgc8-MSN / Dox, se realizó un análisis de espectroscopía FT-IR. El espectro de infrarrojos se muestra en la Fig. 3 e. Picos de 3400 cm ⁻¹ , 1100 cm ⁻¹ y 500 cm ⁻¹ son picos característicos de la sílice. El pico alrededor de 2400 cm ⁻¹ es el pico del agente de plantilla CTAB. El pico alrededor de 1600 cm ⁻¹ es NH ₂ cima. El pico aparece alrededor de 1700 cm ⁻¹ se considera como el pico característico de estiramiento del enlace C =0 de la base del clúster de Dox cargado en los MSN. El nuevo pico a 1650 cm ⁻¹ se debe a la base de Schiff (–C =N–) generada por la reacción de Sgc8 con NH2-MSN / Dox. Estas pruebas demuestran que el sistema de administración de fármacos Sgc8-MSN / Dox se ha preparado con éxito. Para detectar la eficiencia del aptámero modificado Sgc8-MSN / Dox, utilizamos un espectrofotómetro ultravioleta para medir la densidad de absorbancia (DO) del aptámero a 260 nm, y calculamos la modificación del aptámero a la eficiencia de las nanopartículas en función del cambio en el valor de DO. antes y después de la modificación del aptámero en la superficie de la nanopartícula. Los espectros de absorción ultravioleta (UV-Vis) de la solución de aptámero y el sobrenadante se muestran en la Fig. 3e. Según el cálculo, la cantidad de modificación del aptámero Sgc8 a Sgc8-MSN / Dox fue de aproximadamente 6,87 nmol mg ^–1 Sgc8-MSN / Dox.

un XRD y b isotermas de sorción de nitrógeno de MSN; (recuadro) Gráficas de distribución de tamaño de poro y volumen de poro de MSN

Caracterización de nanomateriales. un Micrografía electrónica de Sgc8-MSN / Dox. b Diagrama de potencial de nanopartículas. Distribución del tamaño de partícula de c MSN / Dox y d Sgc8-MSN / Dox. e Espectros FT-IR de nanomateriales: a MSN, b MSN / Dox y c Sgc8-MSN / Dox. f Espectros UV – Vis de a Solución aptámero sgc8, b sobrenadante de lavado en el proceso de preparación Sgc8-MSN / Dox

Lanzamiento de Dox de Sgc8-MSN / Dox In Vitro

MSN / Dox y Sgc8-MSN / Dox liberaron su carga de fármaco lentamente a pH 7,4:no se liberó más del 50% del fármaco en 96 h (Fig. 4). Esto indica que los MSN pueden soportar la liberación lenta del fármaco durante 96 h, probablemente porque el fármaco se propaga a través de los canales internos del silicio mesoporoso. La liberación fue mucho más rápida a pH 5,0, con tasas de liberación que alcanzaron el 60% a las 48 hy> 80% a las 96 h. Las curvas de liberación de Dox fueron casi idénticas para Sgc8-MSN / Dox y MSN / Dox, lo que sugiere que la ligadura de aptámeros no afecta la estructura de las nanopartículas. La mayor liberación a pH ácido es útil porque las células tumorales se encuentran en un entorno débilmente ácido y las nanopartículas recubiertas de Sgc8 se internalizan en los endosomas [15]. Nuestros resultados apoyan la idea de que el silicio mesoporoso puede acelerar la liberación de fármacos en un ambiente ácido [21, 22].

Liberación de doxorrubicina de Sgc8-MSN / Dox y MSN / Dox in vitro a pH 5,0 o 7,4

Orientación de células leucémicas por Sgc8-MSN / Dox In Vitro

Examinamos la captación de nanopartículas por células de leucemia de linfocitos T CEM como células diana y células de linfoma B de Ramos como células no diana. Según la citometría de flujo, las células no diana internalizaron MSN / Dox en un grado similar a Sgc8-MSN / Dox, mientras que las células diana internalizaron las nanopartículas recubiertas de aptámeros en una extensión mucho mayor que MSN / Dox (Fig. 5a). De acuerdo con estos resultados, la microscopía confocal de fluorescencia mostró una fuerte fluorescencia Dox (roja) dentro de las células CEM expuestas a Sgc8-MSN / Dox, pero no dentro de las células Ramos tratadas de la misma manera (Fig. 5b). Estos resultados reflejan la capacidad establecida del aptámero Sgc8 para apuntar a las células leucémicas [20]. Sgc8 reconoce PTK-7 en la superficie de las células CEM [18], reclutando nanopartículas en la superficie y haciendo así su absorción más eficiente [23]. Nuestros resultados sugieren que Sgc8-MSN / Dox puede apuntar a las células cancerosas que expresan PTK-7 en sitios primarios y secundarios o en la circulación, lo que lo hace útil para controlar la metástasis. Puede ser posible expandir nuestro enfoque de MSN a otros aptámeros con otras especificidades de orientación [24, 25].

Se analizó la focalización in vitro de células leucémicas por Sgc8-MSN / Dox usando a citometría de flujo y b microscopio fluorescente. Las células CCRF-CEM y Romas se incubaron con MSN / Dox oSgc8-MSN / Dox, y luego se tiñeron con DAPI (azul). Dox parecía rojo. Barra de escala, 100 μm

Citotoxicidad de MSN

Dada la importancia de la bioseguridad para los sistemas de administración de nanofármacos [25], primero examinamos la toxicidad de los MSN en blanco contra las células CEM, Ramos, 293T y L-02. La viabilidad de todas las líneas celulares se mantuvo por encima del 90% incluso después de 48 h de incubación con hasta 100 μg / ml de MSN (Fig. 6). Esto sugiere que los MSN muestran una citotoxicidad casi insignificante.

Citotoxicidad in vitro de MSN. un CEM, b Ramos, c 293T y d Las células L-02 se trataron con las concentraciones indicadas de MSN y se midió la viabilidad celular

A continuación, investigamos la capacidad de Sgc8-MSN / Dox para matar células tumorales diana (células CEM) y células no diana (células Ramos, 293T y L-02). Las células se incubaron con diferentes concentraciones de Dox, MSN / Dox o Sgc8-MSN / Dox libres durante 24 h, y luego se evaluó la viabilidad mediante el ensayo MTT. Contra las células CEM diana, Dox libre mostró una toxicidad ligeramente mayor que las dos formulaciones de MSN, mientras que Sgc8-MSN / Dox fue significativamente más tóxico que MSN / Dox a la misma concentración de fármaco (Fig. 7). Contra las células Ramos, 293T y L-02, el Dox libre mostró una toxicidad significativamente mayor que las formulaciones de MSN, que mostraron una toxicidad similar con o sin Sgc8. Para confirmar aún más que Sgc8-MSN / Dox fue efectivamente dirigido a matar células CEM a través del receptor aptámero PTK-7, primero incubamos suficiente aptámero Sgc8 con células CEM durante 2 h para bloquear el sitio de unión y luego co-incubamos con el Sgc8 -MSN / Dox. El ensayo MTT mostró que el aptámero libre no tenía toxicidad para las células CEM, y después de que suficiente aptámero Sgc8 bloqueara el sitio de unión, Sgc8-MSN / Dox mostró significativamente menos toxicidad que el grupo Sgc8-MSN / Dox libre (Fig. 7e). Estos resultados destacan la capacidad del aptámero para dirigirse a la administración de fármacos y mejorar la destrucción de las células diana. Tal dirección puede ayudar a reducir la absorción del fármaco por las células no diana, así como permitir el uso de dosis más bajas; ambos efectos pueden reducir el riesgo de efectos secundarios tóxicos [26].

Capacidad de DOX, MSN / Dox y Sgc8-MSN / Dox gratuitos para matar a Células CEM, b Células de Ramos, c Células 293T y d Células L-02. e Las células CEM eliminan la capacidad de aptámero libre, bloquean (las células CEM primero incuban suficiente Sgc8 durante 2 h, luego se incuban con sgc8-MSN / Dox) y Sgc8-MSN / Dox

Los aptámeros se pueden utilizar como moléculas de guía para la administración de fármacos y diversas macromoléculas o nanoportadores a las células tumorales; a veces, los aptámeros también pueden funcionar como terapéuticos. Por ejemplo, el aptámero AS1411 puede unirse específicamente a la nucleolina, y la nucleolina se expresa en y sobre la superficie de las células tumorales implicadas en la diferenciación celular, supervivencia, inflamación, angiogénesis y desarrollo tumoral. El aptámero AS1411 puede inducir la inhibición del crecimiento de modelos de xenoinjerto (cáncer renal, cáncer de pulmón, cáncer de mama MX1 y cáncer de páncreas) mediante la unión con nucleolina [27]. Además, se probaron liposomas cargados con doxorrubicina, funcionalizados con aptámero AS1411 (Apt-Dox-Lip) en cáncer de mama, y ​​los resultados mostraron un gran potencial de aplicación [28]. Los aptámeros han tenido éxito en una amplia gama de ensayos clínicos debido a sus excelentes propiedades. El primer aptámero fue aprobado por la FDA en 2005 [29], desde entonces, cada vez más aptámeros han llegado a los ensayos clínicos. Los aptámeros se aplicaron a ensayos clínicos antitumorales, incluidos el cáncer de próstata [30], el cáncer de pulmón [31], la leucemia mieloide aguda [32], etc. No hay duda de que estos ensayos clínicos relacionados con aptámeros brindan una nueva esperanza de cambiar el estilo convencional de terapia.

En los últimos años, se han combinado aptámeros con diferentes nanomateriales para la terapia dirigida de tumores. Se puede ver que los aptámeros tienen capacidades extraordinarias de reconocimiento y focalización molecular. Sin embargo, todavía existen algunos problemas que no se pueden ignorar en el desarrollo de la aplicación de aptámeros, como si la nucleasa afecta la estabilidad de los aptámeros in vivo, si los aptámeros de sustancias moleculares pequeñas ingresan al cuerpo y son fáciles de eliminar rápidamente por parte del cuerpo. sistema renal, y si es factible el rendimiento real de la focalización in vivo. Con el fin de explotar todo el potencial de los nanomateriales dirigidos basados ​​en aptámeros, más pruebas in vivo y experimentos clínicamente relevantes siguen siendo el foco de la investigación actual. Al mismo tiempo, la teranóstica de los tumores es una dirección importante para el desarrollo futuro, y el diseño y la preparación de materiales biológicos funcionales más multifuncionales son sin duda la tendencia de desarrollo.

Conclusión

Hemos construido un sistema de administración de MSN modificado por aptámeros que puede apuntar de manera eficiente a las células leucémicas y promover la absorción de Dox. Este direccionamiento, junto con la capacidad de los MSN para liberar la carga de fármacos de forma lenta y preferentemente en condiciones ácidas, puede ayudar a que el sistema de administración se acumule en los sitios del tumor y destruya las células de forma continua. Puede ser posible apuntar a casi cualquier tipo de células tumorales con este enfoque de MSN seleccionando aptámeros adecuados. Pero no se puede ignorar que el Sgc8-MSN / Dox también puede tener los problemas mencionados anteriormente, y su estabilidad y orientación in vivo aún necesitan más estudios. En el siguiente, combinaremos la investigación anterior para cargar el sistema de administración de fármacos con reactivos de diagnóstico y fármacos, dándole la función teranóstica del diagnóstico y el tratamiento dirigidos.

Abreviaturas

MSN:

Nanopartículas de silicio mesoporosas

Dox:

Doxorrubicina

Sgc8-MSN / Dox:

Sistema de administración de fármacos de sílice mesoporoso modificado con aptámero

PTK-7:

Proteína tirosina quinasa-7

TEOS:

Ortosilicato de tetraetilo

APTES:

3-trietoxisililpropilamina

CTAB:

Bromuro de cetil-trimetilamonio

CEM:

CCRF-CEMcells

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

Modulación de reflexión óptica eficiente mediante el acoplamiento de la transición entre bandas del grafeno a la resonancia magnética en metamateriales Síntesis, caracterización y evaluación de nanopartículas de oligosacárido de quitosano sensibles a redox recubiertas con ficocianina para la administración de fármacos