Síntesis, caracterización y evaluación de nanopartículas de oligosacárido de quitosano sensibles a redox recubiertas con ficocianina para la administración de fármacos

Materiales y métodos

Materiales

CUR se adquirió de Zhanyun Chemical Co., Ltd. (Shanghai, China). COS se adquirió de Shandong Weikang Biomedical Science and Technology Co., Ltd. El PC se obtuvo de Zhejiang Binmei Biotechnology Co., Ltd. El ácido 3.3-ditiodipropiónico se obtuvo de Adamas Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). El clorhidrato de carbodiimida carbonizado (EDCI), dimetilamino piridina (DMAP), tetrahidrofurano (THF), cloruro de oxalilo y biotina se adquirieron de Aladdin Chemistry Co., Ltd. L-glutatión (GSH) y Hoechst 33342 se adquirieron de Sigma-Aldrich (Shanghai , China). Las bolsas de diálisis (MWCO 300 Da) se obtuvieron de Beijing Biotopped Technology Co., Ltd. La formamida fue preparada por Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. El agua desionizada se fabricó por cuenta propia en el laboratorio.

Se eligió una línea celular A549 (células de carcinoma de pulmón humano) (Colección de cultivos Bena (Beijing, China)) para evaluar la citotoxicidad del nuevo nanoportador. Las células A549 se cultivaron en DMEM (Saiersi Biotechnology Co., Ltd. (Shangdong, Yantai, China)). El suero fetal bovino (FBS) se obtuvo de Hyclone (Logan, UT, EE. UU.). Se adquirieron penicilina y estreptomicina de Sigma-Aldrich (Shanghai, China). El bromuro de 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolio (MTT) también se adquirió de Sigma-Aldrich (Shanghai, China).

Síntesis de CUR-BCSC @ PC

Las rutas sintéticas utilizadas para preparar CUR-BCSC @ PC se muestran en la Fig. 2. Los procedimientos experimentales detallados se describen a continuación.

Ruta sintética de COS-S-S-CUR, BCSC y Biotin-COS

Síntesis de COS-S-S-CUR

El COS funcionalizado con ácido 3.3-ditiodipropiónico se sintetizó mediante esterificación catalizada por cloruro de ácido mediante una reacción de dos pasos.

Etapa 1:Se cargaron ácido 3,3-ditiodipropiónico (42,05 mg, 0,25 mmol) y THF seco (4 ml) en un matraz de fondo redondo marrón, con un agitador para disolver el ácido. Luego, se añadió cloruro de oxalilo (0,3 mmol) diluido con THF a un matraz y se colocó en un baño de hielo. La reacción se mantuvo a 35 ° C. Después de agitar durante 3 h, el cloruro de oxalilo sin reaccionar se eliminó mediante evaporación rotatoria. El producto 1 se preparó mediante los pasos anteriores. Se disolvió CUR en 3 mL de THF, conteniendo 34 μL de trietilamina, que se añadió gota a gota al matraz que contenía el producto 1 en condiciones de baño de hielo y luego se agitó durante 15 min. Posteriormente, la mezcla se agitó a 50 ° C bajo una atmósfera de nitrógeno durante 6 h. El producto obtenido se sometió a destilación rotatoria para eliminar trietilamina y THF y luego se purificó por cromatografía en columna para adquirir el producto puro HOOC-S-S-CUR.

Etapa 2:El producto puro HOOC-S-S-CUR se activó con EDCI (1,2 eq) y DMAP (1,2 eq) en formamida durante 2 h. Posteriormente, se añadió COS disuelto en 4 mL de formamida y se agitó a 55 ° C durante 12 h. Una vez completada la reacción, la solución se dializó con una bolsa de diálisis (MWCO 300 Da) y se liofilizó durante 12 h.

Síntesis de BCSC y Biotin-COS

En resumen, se disolvieron biotina, EDCI y DMAP en 3 ml de formamida y se transfirieron a un matraz marrón de fondo redondo. Después de agitar durante 2 ha 30ºC, se disolvió COS-S-S-CUR en 3 ml de formamida y se añadió gota a gota al matraz. La reacción se mantuvo a 45 ° C durante 2 días. Los productos finales se dializaron (MWCO 300 Da) en agua desionizada y se sometieron a centrifugación y liofilización para obtener BCSC sensibles a redox. Además, la síntesis de biotina-COS se realizó mediante el mismo método para unir la biotina a las cadenas COS.

¹ Se midieron H-NMR de COS-S-S-CUR, BCSC y biotina-COS usando una mezcla de DMSO-D ₆ y D ₂ O como disolvente.

Preparación de micelas BCSC cargadas con CUR (CUR-BCSC)

Los CUR-BCSC se prepararon mediante el método de autoensamblaje. Se disolvieron diez miligramos de BCSC en 4 mL de formamida y luego se mezclaron con 1 mL de solución de CUR (1 mg / mL) que se disolvió en formamida. La solución mixta se dializó usando una bolsa de diálisis (MWCO 300 Da) en agua desionizada durante 24 h y el agua desionizada se cambió cada 2 h. Las CUR-BCSC se filtraron utilizando membranas millipore de 800 nm, 450 nm y 220 nm.

Preparación de CUR-BCSC @ PC

Las CUR-BCSC preparadas se mezclaron con una solución acuosa de PC (1.0 mg / mL) y se incubaron durante 30 min a 4 ° C. Posteriormente, se eliminó el PC utilizando un filtro centrífugo de 100 kDa y se enjuagó con agua tres veces. El producto final (CUR-BCSC @ PC) se almacenó a 4 ° C en la oscuridad para su posterior estudio.

Caracterizaciones

Se llevaron a cabo mediciones de dispersión dinámica de láser (DLS) en un analizador de partículas Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) para observar el tamaño de partícula, el potencial zeta y el índice de polidispersidad (PI). La morfología de CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC se confirmó mediante mediciones de microscopía electrónica de transmisión (TEM, H-600; Hitachi, Tokio, Japón).

Eficiencia de encapsulación (EE) y capacidad de carga de fármacos (DL)

Se utilizó HPLC (Agilent 1260GB12C) para determinar la EE y DL de las nanopartículas. Primero, se mezclaron 2 mL de CUR-BCSCs o CUR-BCSC @ PCs con 3 mL de acetonitrilo y se demulsificaron por ultrasonido, en el cual luego se añadió acetonitrilo a 10 mL. Antes de la medición, la temperatura de la columna Phenomenex C18 (250 mm × 4 . 6 mm, 5 um) se ajustó a 25 ° C, mientras que el caudal de la fase móvil se ajustó a 1,0 mL · min ^{- 1} . La relación de 0,5% de ácido acético glacial a acetonitrilo fue 40:60 (v / v). En el proceso de detección, con una longitud de onda de detección de 425 nm, se inyectaron 20 μL de muestras [30]. Se utilizó la siguiente fórmula para calcular el EE y el DL:

Prueba de estabilidad in vitro

Se preparó solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía GSH (0, 20 μM, 10 mM) y se trató con CUR-BCSC @ PC durante 4 h para observar los cambios en el tamaño de partícula bajo diferentes concentraciones de glutatión a 37 ° C. Además, se investigó el diámetro hidrodinámico de CUR-BCSC @ PC en solución de PBS utilizando un analizador de partículas Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) a 37 ° C en diferentes puntos de tiempo (4, 8, 12 y 24 h).

Liberación de CUR in vitro de CUR-BCSC @ PC

Los comportamientos de liberación de CUR in vitro de CUR-BCSC @ PC se investigaron utilizando el método de diálisis. Se prepararon soluciones de PBS que contenían glutatión (GSH:20 μmol / L, 1 mmol / L, 5 mmol / L, 10 mmol / L) y se añadió Tween 80 al 0,5%. Se añadió tampón PBS (45 ml), que contenía diferentes concentraciones de GSH, a tubos de centrífuga de 50 ml; luego, se colocó una bolsa de diálisis que contenía 1 mL de CUR-BCSC @ PCs en cada tubo de centrífuga, el cual se agitó a 37 ° C. En diferentes puntos de tiempo (0.2, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h), se recolectaron 2 mL de medio de liberación y se agregó medio de liberación reciente del mismo tipo para mantener su volumen sin cambios. Se usó HPLC para determinar la concentración de CUR en el medio de liberación recolectado.

Cultivo celular

Las células A549 de carcinoma de pulmón humano se cultivaron en DMEM, que incluía FBS al 10% y penicilina-estreptomicina al 1%, y se incubaron a 37 ° C en CO ₂ al 5%. atmósfera [31, 32].

Inhibición de la proliferación celular in vitro

La citotoxicidad in vitro de CUR, micelas BCSC (BCSC), CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC contra la línea celular A549 se evaluó utilizando un ensayo MTT estándar [33]. Las células A549 se sembraron en placas de 96 pocillos (5000 células por pocillo) durante 24 h para adherirse a la pared. Se descartó el medio original, y luego se descartaron 100 μL de medio fresco que contenía CUR, BCSC, CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC libres (0.1, 1, 5, 10, 15 y 20 μg / mL basado en CUR). añadido y cultivado durante 24 h. Los pocillos sin administración se utilizaron como controles en blanco. Las células se sometieron a ensayo de MTT retirando el medio y añadiendo 20 μL de solución de MTT (5 mg / mL). Después de la incubación durante otras 4 ha 37 ° C en 5% de CO ₂ atmósfera, la solución de MTT se reemplazó con 150 μL de DMSO para disolver el MTT-formazán púrpura. Posteriormente, se utilizó un lector de microplacas (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) para medir la absorbancia de cada pocillo a 570 nm.

Captación y localización de células in vitro

La capacidad de absorción celular de CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC se investigó con un microscopio de fluorescencia (FM, Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokio, Japón). Se sembraron células A549 en placas de 24 pocillos a 4 × 10 ⁴ células por pocillo y se co-incubaron con CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC (concentración de CUR:20 μg / ml) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO ₂ durante 1, 2 y 4 h. Las células A549 se lavaron con PBS tres veces después de eliminar el medio de cultivo que contenía fármacos. Luego, se añadió PBS que contenía paraformaldehído al 4% durante 20 min y se lavó con PBS tres veces más. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst 33342 durante 15 min y se observaron usando un microscopio de fluorescencia invertido.

Análisis estadístico

Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces y se expresaron como medias ± DE. Las pruebas estadísticas se analizaron utilizando la t de Student prueba. P <0.05 se estableció como estadísticamente significativo y P <0,01 se consideró muy significativo.

Resultados y discusión

Caracterización de COS, COS-S-S-CUR, Biotin-COS y BCSC

Las principales resonancias características de CUR y CH ₂ -S-S-CH ₂ apareció en el ¹ Espectro de H-NMR de COS-S-S-CUR, que demuestra la conjugación exitosa de CUR con las cadenas COS. En comparación con los picos de COS en la Fig.3 (A), las señales características de CUR presentadas en la Fig.3 (B) se observaron en la región entre 6.7 y 7.5 ppm y en 3.75 ppm (−OCH ₃ ), mientras que la resonancia de CH ₂ -S-S-CH ₂ a 2,5 ppm no se modificó. Como se muestra en (Fig. 3 (C), a, b), los picos de biotina en el ¹ El espectro de H-NMR de Biotina-COS fue de 0,99 ppm (-CH ₂ -) y 3,39 ppm (−CH – S–). ¹ El espectro de H-NMR de BCSC se muestra en la Fig. 3 (D). Las resonancias de CUR (Fig. 3 (D), a, e) se observaron en las posiciones correspondientes, y el pico característico de CH ₂ -S-S-CH ₂ (Fig. 3 (D), b) se observó de nuevo a 2,5 ppm. Además, la aparición de señales en pico 0.09 ppm y 3.39 ppm (Fig. 3 (D), c, d) verificó la existencia de biotina ligada a las cadenas COS-S-S-CUR. Las resonancias características de CUR, CH ₂ -S-S-CH ₂ , y la biotina como se muestra en la Fig. 3 (D) son consistentes con los de la Fig. 3 (B) y la Fig. 3 (C), lo que indica que el material anfifílico BCSC se sintetizó con éxito.

El ¹ Espectros de H-NMR de COS ( A ), COS-S-S-CUR ( B ), Biotina-COS ( C ) y BCSC ( D )

Caracterización de CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC

Las morfologías de CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC se estudiaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Fig. 4 (A, B)). Los CUR-BCSC mostraron una forma esférica suave (Fig.4 (A), a) bajo microscopía electrónica, mientras que los CUR-BCSC @ PC poseían una forma aproximadamente esférica con la capa floreciente que rodeaba los CUR-BCSC @ PC (Fig.4 (B) ), B). Esto indicó que la PC formó una estructura de corona proteica al cubrir las superficies de las CUR-BCSC. Se observó un claro efecto Tyndall de CUR-BCSC @ PC debido a la existencia de generosas nanopartículas (Fig. 4 (C)). El tamaño de partícula, PI, potencial zeta, DL (%) y EE (%) de CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC se ilustran en la Tabla 1. En la Fig. 5, el tamaño promedio de CUR-BCSC y CUR- BCSC @ PC fue 97,8 ± 4,2 nm y 160,3 ± 9,0 nm, respectivamente. Mientras tanto, los valores de PI de CUR-BCSCs y CUR-BCSC @ PCs fueron 0.181 ± 0.014 y 0.114 ± 0.024, respectivamente, que son menores a 0.2, lo que indica la uniformidad de sus tamaños. Los potenciales zeta de CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC fueron 21,57 ± 0,53 y 12,90 ± 1,93 mV, respectivamente. Debido al recubrimiento de PC electronegativo, el potencial zeta de las CUR-BCSC era mayor que el de las CUR-BCSC @ PC. El EE de CUR-BCSC @ PC fue mayor que el de CUR-BCSC.

A Las imágenes TEM de CUR-BCSC y un solo CUR-BCSC. B Las imágenes TEM de CUR-BCSC @ PC y un solo CUR-BCSC @ PC. C Efecto Tyndall y la fotografía de CUR-BCSC @ PC en el agua

un La distribución de tamaño y el potencial zeta de las CUR-BCSC; b La distribución de tamaño y el potencial zeta de CUR-BCSC @ PC

Estabilidad de CUR-BCSC @ PC

Como se muestra en la Fig.6a, debido a la naturaleza reductora del enlace disulfuro, el enlace se escindió en PBS que contenía GSH 10 mM, y los CUR-BCSC @ PC se desintegraron en fragmentos de polímero, que se aglomeraron para aumentar el tamaño de partícula de las nanopartículas. . Sin embargo, en PBS que contiene 20 μM de GSH, los cambios en el tamaño de las partículas fueron menores, lo que mostró un resultado similar al PBS sin GSH. Como se ilustra en la Fig. 6b, el tamaño de partícula se midió en diferentes momentos para estudiar la estabilidad de CUR-BCSC @ PC en PBS, y los resultados mostraron que el tamaño de partícula de CUR-BCSC @ PC aumentó lentamente con el tiempo [14].

La estabilidad de CUR-BCSC @ PC. un Cambios de tamaño de CUR-BCSC @ PC a diferentes concentraciones de GSH. b Cambios de tamaño de CUR-BCSC @ PC en PBS en diferentes momentos

Respuesta de reducción de CUR-BCSC @ PC

Está bien establecido que los enlaces disulfuro son inestables en un entorno reductor de tumores. Los investigadores han utilizado enlaces disulfuro para conectar polímeros hidrófilos y fármacos hidrófobos para preparar fragmentos anfifílicos, que pueden autoensamblarse en agua para formar nano-micelas. Luego, de acuerdo con las diferencias en el entorno fisiológico y el entorno del tumor, los enlaces disulfuro se rompen en el sitio del tumor para liberar fármacos [34]. En el presente estudio, se llevó a cabo la liberación de fármacos in vitro para verificar si los CUR-BCSC @ PC podrían presentar una propiedad de liberación esperada. Se investigó la capacidad de respuesta de reducción de CUR-BCSC @ PC que contienen enlaces disulfuro después de la activación de GSH. Como se muestra en la Fig.7, la liberación de CUR de CUR-BCSC @ PC en el medio con GSH 20 μM a pH 7,4, que simulaba el entorno extracelular, fue extremadamente lenta en comparación con un entorno con GSH 10 mM a pH 7,4. Además, en comparación con el medio GSH 20 μM, el GSH 1, 5 y 10 mM mostraron diferencias significativas en el comportamiento de liberación. Con el aumento en la concentración de GSH, también se promovió la liberación de CUR de CUR-BCSC @ PC, lo que indica que la liberación del fármaco fue en respuesta a la concentración de GSH.

Liberación acumulativa de CUR de CUR-BCSC @ PC en diferentes condiciones de GSH

Citotoxicidad in vitro

El ensayo MTT se realizó para investigar los efectos citotóxicos de CUR, BCSC, CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC libres en líneas celulares A549 [35]. Los datos de viabilidad celular se resumen en la Fig. 8. Todas las preparaciones de CUR mostraron dependencia de la dosis en términos de inhibición de la proliferación celular. Como se muestra en la Fig. 8, la CUR libre tenía una capacidad ligeramente menor para inhibir la proliferación celular contra todas las células A549 en comparación con las CUR-BCSC @ PC y CUR-BCSC, después de la incubación durante 24 h. Para las células A549, la actividad anticancerígena de CUR-BCSC @ PC fue mejor que la de BCSC y CUR-BCSC, lo que probablemente se debió a una excelente captación celular. Además, las CUR-BCSC @ PC mostraron una propiedad de citotoxicidad más alta que las CUR-BCSC, lo que indica que la PC tiene un efecto inhibidor potencial sobre la proliferación de células A549.

Citotoxicidad in vitro de diferentes formulaciones a las 24 h en células A549

Estudio de absorción celular in vitro

Como se muestra en la Fig.8, las señales de fluorescencia de CUR se observaron en células A549 tratadas con CUR-BCSCs y CUR-BCSC @ PCs (CUR:20 μg / mL) a 1, 2 y 4 h, usando el microscopio de fluorescencia invertido . CUR, como sonda de fluorescencia verde, también era un fármaco contra el cáncer, que se utilizaba con frecuencia como fármaco modelo hidrófobo para desarrollar sistemas de administración de fármacos nuevos y eficientes. Como se ilustra en la Fig. 9a, tanto las CUR-BCSC como las CUR-BCSC @ PC se absorbieron en las líneas celulares A549, y la eficiencia de absorción dependía del tiempo. Debido a los receptores de biotina sobreexpresados ​​en la superficie de las células cancerosas, las nano-micelas cargadas con biotina tenían afinidad por las células A549. Las señales de fluorescencia de CUR-BCSC @ PC fueron altas a las 4 h, lo que indica una alta tasa de absorción celular de CUR-BCSC @ PC. Las señales de fluorescencia de CUR-BCSC @ PC fueron mayores a las 4 h que a las 1 ho 2 h; esto demostró que la captación celular dependía del tiempo.

un Imágenes fluorescentes de la captación celular de CUR-BCSC y CUR-BCSC @ PC en diferentes momentos. b La ubicación de la celda de CUR-BCSC @ PC a 1 hy 4 h

Los núcleos de las células A549 se tiñeron con Hoechst 33342. Como se muestra en la Fig. 9b, se observaron señales de fluorescencia verde en el citoplasma del grupo de 1 h de CUR-BCSC @ PC, y la fluorescencia se produjo gradualmente en los núcleos de 4 h grupo de CUR-BCSC @ PC, que demostró captación celular a través de endocitosis mediada por caveolas.

Conclusiones

En este estudio, se preparó un tipo de nanopartícula COS funcionalizada con proteínas a través de reacciones de condensación, comportamiento de autoensamblaje y la interacción entre PC y CUR-BCSC. Después de la investigación preliminar, los materiales portadores anfifílicos (BCSC) con sensibilidad redox se sintetizaron con éxito y se verificaron utilizando ¹ H-NMR. Las superficies de las CUR-BCSC se modificaron con una capa de ficocianina corona, que podría mejorar la eficiencia de absorción celular y proteger a las CUR-BCSC @ PC de la adsorción de proteínas plasmáticas. El análisis de captación y citotoxicidad celular indicó que las CUR-BCSC @ PC podrían transportar CUR a las células A549 y tiene una excelente propiedad antiproliferativa. Teniendo en cuenta el efecto PDT de PC y CUR, evaluaremos las propiedades fotodinámicas y la actividad anticancerígena de CUR-BCSC @ PC bajo fototerapia en la siguiente fase de esta investigación. Este estudio allanó el camino para la mejora de la eficacia de los medicamentos contra el cáncer y la introducción de una corona proteica funcional. En resumen, el biomaterial portador de nanomedicina de CUR-BCSC @ PCs basado en COS con múltiples funciones ha proporcionado una nueva estrategia para el tratamiento de tumores y exhibido grandes perspectivas de aplicación.

Disponibilidad de datos y materiales

Las conclusiones de este manuscrito se basan en los datos que se presentan y se muestran en este documento.

Abreviaturas

BCSC:

Biotina-quitosano oligosacárido-ácido ditiodipropiónico-curcumina

COS:

Oligosacárido de quitosano

COS-S-S-CUR:

Citosano oligosacárido-ácido ditiodipropiónico-curcumina

CUR:

Curcumina

CUR-BCSC @ PC:

Micelas de biotina-quitosano oligosacárido-ácido ditiodipropiónico-curcumina funcionalizadas con ficocianina y cargadas con curcumina

CUR-BCSC:

Micelas de curcumina-oligosacárido de biotina-quitosano-oligosacárido-ácido ditiodipropiónico cargadas con curcumina

EPR:

Permeabilidad y retención mejoradas

PC:

Ficocianina

PDT:

Terapia fotodinámica

Un sistema eficiente de administración de fármacos dirigido a células basado en nanopartículas de sílice mesoporosa modificadas con aptámero Dicroísmo circular sintonizable gigante de matrices nanocrescentes de metales quirales extrínsecos de área grande