Uso de nanopartículas GaN/Fe para guiar magnéticamente células endoteliales in vitro

Resumen

Informamos la síntesis y captación celular de nanopartículas multifuncionales GaN/Fe y demostramos su utilidad como guías magnéticas para células endoteliales. Las partículas se producen mediante el crecimiento de una capa de GaN sobre núcleos ZnO/Fe₂O₃ mediante epitaxia en fase de vapor de hidruro (HVPE), seguida de la descomposición del núcleo a alta temperatura. La microscopía electrónica de transmisión confirma que las células endoteliales aórticas porcinas internalizan las nanopartículas GaN/Fe en vesículas sin comprometer la viabilidad celular. Estas partículas inertes y magnéticamente responsivas pueden utilizarse para dirigir células en campos magnéticos externos, ofreciendo una nueva estrategia para la administración dirigida de células y la ingeniería de tejidos.

Antecedentes

La nanotecnología ha surgido como una herramienta poderosa en oncología, principalmente a través de nanoportadores de fármacos basados en nanopartículas. Sin embargo, el recubrimiento con ligandos, la encapsulación de fármacos y la unión covalente pueden limitar la eficiencia de administración y plantear preocupaciones de seguridad. Una estrategia alternativa implica el uso de nanopartículas como moduladores biológicos directos, dirigiendo y guiando las propias células. Por ejemplo, las nanopartículas magnéticas pueden dirigir células endoteliales a sitios de lesión arterial cuando se exponen a un campo magnético externo. Más allá de aplicaciones terapéuticas, estas células guiadas pueden ayudar en la clasificación celular in vitro y la funcionalización de andamios. Aquí presentamos la primera evidencia de que las células endoteliales pueden internalizar nanopartículas GaN/Fe y que esta captación permite el posicionamiento espacial controlado de las células.

Métodos

Síntesis de nanopartículas

Se cultivaron capas delgadas de GaN sobre nanopartículas de ZnO aleadas con Fe₂O₃ mediante un proceso HVPE de dos pasos. Se depositó una capa de nucleación inicial a 600 °C durante 5 min, seguida de una fase de crecimiento a 800 °C durante 10 min para descomponer el núcleo de ZnO y mejorar la calidad cristalina del GaN. El proceso empleó galio metálico, NH₃, HCl e H₂ como gases portadores a caudales de 20, 600 y 3500 sccm, respectivamente.

Cultivo celular

Las células endoteliales aórticas porcinas primarias se aislaron mediante raspado suave de la pared aórtica y se cultivaron en EGM™-2 (Lonza) a 37 °C, 5% CO₂. Se utilizaron pasajes 3-8 y las células se transdujeron con GFP mediante lentivirus. El desprendimiento celular para los experimentos se realizó con TrypLE™Select (1X) (Gibco®).

Ensayo XTT

La viabilidad celular se evaluó 24 h después de añadir las nanopartículas. El reactivo XTT (0,1 ml en 5 ml de XTT) se mezcló con medio EGM2 fresco (2:1) e incubó durante 4 h a 37 °C, 5% CO₂. La absorbancia se midió en un lector de placas multimodo Paradigm.

Conteo celular

Tras 48 h de exposición a nanopartículas, las células se fijaron en formaldehído al 4%, se lavaron con PBS y se tiñeron con DAPI (1:7500). Se capturaron imágenes de seis pocillos por condición mediante microscopio de fluorescencia Zeiss y se cuantificaron con DotCount v1.2.

Microscopía electrónica de transmisión

Las células incubadas durante 24 h con 50 µg/ml de nanopartículas GaN/Fe se fijaron en glutaraldehído al 2%/formaldehído al 2%, post-fijaron en OsO₄ al 1%, deshidrataron y se incluyeron en EPON. Secciones ultrafinas (~50 nm) se tiñeron con acetato de uranilo al 4% y citrato de plomo, y se examinaron en un FEI Tecnai 20 (200 kV).

Resultados y discusión

Las nanopartículas GaN/Fe se diseñaron recubriendo núcleos ZnO/Fe₂O₃ con GaN, seguido de la eliminación del núcleo. Las partículas resultantes exhiben una capa de GaN (~20-100 nm) con Fe incrustado, confiriendo capacidad de respuesta magnética mientras conservan la piezoelectricidad del GaN. Los análisis SEM, TEM, XRD, Raman y EDX confirman la descomposición del núcleo, el crecimiento de GaN y un contenido de Fe de ~50%.

Al incubarse con células endoteliales aórticas porcinas, las nanopartículas se internalizaron predominantemente en vesículas, sin localización citoplasmática ni nuclear. La captación ocurrió vía vías clásicas: macropinocitosis, endocitosis mediada por clatrina y caveolina, probablemente dominada por caveolas en células endoteliales. Los ensayos de viabilidad revelaron una reducción moderada, dependiente de la concentración, en la actividad metabólica a 50 µg/ml, mientras que dosis menores (<10 µg/ml) mantuvieron >90% de viabilidad.

Dada la alta carga de Fe, las partículas exhiben fuerte ferromagnetismo, mientras que la capa de GaN preserva la piezoelectricidad. Estas propiedades duales permiten la actuación remota mediante polarización inducida por ultrasonido y manipulación magnética. Para validar la guía magnética, células endoteliales cargadas con 50 µg/ml de GaN/Fe se desprendieron, resuspendieron y sembraron en EGM™-2. Cuando la placa de cultivo se posicionó bajo imanes permanentes, las células mostraron una distribución altamente no aleatoria que coincidió con el mapa del campo magnético, mientras que las células control mostraron colocación aleatoria. Esto demuestra que las nanopartículas GaN/Fe pueden usarse para dirigir células de manera predecible.

Conclusiones

Hemos establecido que las nanopartículas GaN/Fe son internalizadas de forma segura por células endoteliales y almacenadas en vesículas. Su capacidad de respuesta magnética permite el posicionamiento preciso de las células impulsado por campos, abriendo vías para la administración dirigida de células y la fabricación de tejidos diseñados. Además, la piezoelectricidad intrínseca del GaN ofrece una plataforma para la estimulación eléctrica remota de funciones celulares. El trabajo en curso explorará aplicaciones in vivo y la integración de activación piezoeléctrica para modulación terapéutica.

Abreviaturas

EDX:

Análisis de rayos X por dispersión de energía

EGM™-2:

Medio de crecimiento endotelial 2

Fe:

Hierro

Fe₂O₃:

Óxido de hierro (III)

GaN:

Nitruro de galio

GFP:

Proteína fluorescente verde

H₂:

Hidrógeno

HCl:

Cloruro de hidrógeno

NH₃:

Amoníaco

OsO₄:

Tetróxido de osmio

PBS:

Salina fosfatada tamponada

SEM:

Microscopía electrónica de barrido

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

XRD:

Difracción de rayos X

ZnO:

Óxido de zinc