Dirigirse a las células endoteliales con nanopartículas multifuncionales de GaN / Fe

Métodos

Síntesis de nanopartículas

Se cultivaron capas delgadas de GaN en nanopartículas de ZnO aleadas con Fe ₂ O ₃ por HVPE en dos pasos. Inicialmente, la capa de nucleación se depositó a 600 ° C durante 5 min. Posteriormente, se aumentó la temperatura a 800 ° C y se mantuvo a esta temperatura durante 10 min. El segundo régimen de temperatura es necesario para la descomposición del núcleo de ZnO y la mejora de la calidad cristalina de GaN. El crecimiento de GaN ha sido descrito en detalle por nuestro grupo anteriormente [5, 6]. En resumen, usamos galio metálico, amoníaco (NH ₃ ) gas, gas cloruro de hidrógeno (HCl) e hidrógeno (H ₂ ) como gases portadores. En el proceso de crecimiento de GaN, el HCl, NH ₃ y H ₂ los caudales fueron de 20, 600 y 3500 sccm, respectivamente.

Cultivo celular

Las células endoteliales aórticas porcinas se aislaron de las aortas raspando suavemente la capa de células endoteliales con un bisturí. Las células se cultivaron en una incubadora estándar a 37 ° C con 5% de CO ₂ en EGM ™ -2 (Medio 2 del factor de crecimiento endotelial, Lonza). La división de células se realizó con TrypLE ™ Select (1X) (Gibco®). Para todos los experimentos, se utilizaron células entre los pases 3 y 8. Las células se marcaron con proteína de fluorescencia verde (GFP) mediante transducción lentiviral como se describe en otra parte [7].

Ensayo XTT

El ensayo XTT se inició 24 h después del cambio de medio cuando se agregó un nuevo medio suplementado con nanopartículas. A continuación, el medio de cultivo se reemplazó con medio EGM2 reciente con reactivo XTT en una proporción de 2:1. El reactivo XTT consta de 0,1 ml de reactivo de acoplamiento de electrones en 5 ml de XTT. Después de 4 h de incubación a 37 ° C con 5% de CO ₂ , la absorbancia se midió en un lector de placas multimodo Paradigm.

Recuento de células

Después de 2 días de incubación de células con diferentes concentraciones de nanopartículas, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 min, se lavaron con PBS y se tiñeron con DAPI (1:7500 diluido en PBS) durante 10 min. Se fotografió un campo de visión aleatorio de seis pozos independientes con una cámara de alta resolución instalada en un microscopio de fluorescencia (Zeiss). Se utilizó el software asistido por computadora DotCount v1.2 [8] para cuantificar el número relativo de células en cada pocillo y compararlo con el control.

Microscopía electrónica de transmisión

La microscopía electrónica de transmisión se realizó después de la incubación de las células con nanopartículas durante 1 día. Después de que las células alcanzaron un 50% de confluencia, el medio de cultivo se reemplazó con medio suplementado con 50 μg / ml de nanopartículas de GaN / Fe y las células se incubaron durante otras 24 h. Después, las células se lavaron con PBS, se fijaron en glutaraldehído al 2% y formaldehído al 2% a temperatura ambiente durante 2 h, y luego se incubaron durante la noche a 4ºC. Las muestras se lavaron en cacodilato de sodio 0,1 M y se fijaron posteriormente en OsO ₄ al 1%. en cacodilato de sodio 0,1 M durante 1 h. Después de la fijación, las muestras se deshidrataron en una serie de acetona graduada y se incrustaron en EPON. La polimerización se realizó durante 2 días a 60 ° C. Se recogieron secciones delgadas de ~ 50 nm de espesor en rejillas de ranuras de cobre recubiertas de formvar y se tiñeron con acetato de uranilo al 4% y citrato de plomo. Las secciones celulares se investigaron en detalle utilizando un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai 20 a un voltaje de aceleración de 200 kV.

Resultados y discusión

Se han fabricado nanopartículas magnéticas multifuncionales cultivando una capa de GaN en nanopartículas de sacrificio de ZnO aleadas con Fe ₂ O ₃ . Después del crecimiento de la capa de GaN usando epitaxia en fase de vapor de hidruro (HVPE), el núcleo de ZnO se descompone. Las nanopartículas químicamente estables resultantes consisten principalmente en una capa de GaN con propiedades magnéticas atribuibles a la difusión de átomos de hierro en el GaN depositado, así como a la presencia de átomos de Fe en la película delgada de ZnO aleado con Fe _{2 O 3 en la superficie interior de la carcasa de GaN. Estas nanopartículas se investigaron mediante microscopía electrónica. Después del proceso de crecimiento de HVPE de GaN, las nanopartículas monocristalinas con tamaños transversales que van de 20 a 100 nm permanecen espacialmente separadas (Fig. 1). Los resultados de la difracción de rayos X y la caracterización por espectroscopía Raman (Fig. 1c, d) de las nanopartículas antes y después del crecimiento de GaN demuestran la descomposición del núcleo de ZnO y la formación de nanopartículas de GaN. Los análisis químicos de las nanopartículas realizados mediante análisis de rayos X de dispersión de energía (EDX) confirman el crecimiento de la capa de GaN y la descomposición del núcleo de ZnO (Fig. 1e, f). Tenga en cuenta que el material resultante muestra una concentración relativamente alta (aproximadamente 50%) de Fe en comparación con las nanopartículas iniciales.}

Análisis de nanopartículas. un Imagen SEM de nanopartículas de GaN cultivadas en nanopartículas de sacrificio de ZnO aleadas con Fe ₂ O ₃ . b Imagen TEM de las nanopartículas de GaN / Fe resultantes. c Patrón XRD de ZnFe ₂ inicial O ₄ nanopartículas y GaN / ZnFe ₂ resultantes O ₄ nanopartículas. d Espectros Raman de las nanopartículas iniciales y resultantes después del crecimiento de GaN. e Análisis EDX de ZnO aleado con Fe ₂ O ₃ nanopartículas. f Análisis EDX de nanopartículas resultantes después del crecimiento de la capa de GaN

Se incubaron nanopartículas basadas en GaN / Fe con células endoteliales aórticas porcinas primarias. Como se demostró anteriormente, las células endoteliales toleran las nanopartículas de GaN en concentraciones inferiores a 100 μg / ml [5]. Durante el proceso de incubación, las células endoteliales absorben la mayoría de las nanopartículas en el medio de cultivo circundante mientras mantienen la migración y proliferación celular. Sin embargo, notamos cierta disminución en el número de células viables con un aumento en la concentración de nanopartículas en los medios de cultivo. Esta tendencia se ve confirmada por los resultados del ensayo XTT presentados en la Fig. 2.

Impacto de las nanopartículas en la viabilidad celular. Reducción de XTT dependiente de la concentración medida después de 1 día de incubación de células con diferentes concentraciones de nanopartículas. El número de células contadas al final del ensayo XTT se expresa en relación con las células no tratadas. Los valores se expresan como media ± desviación estándar de dos experimentos independientes con seis repeticiones

Para comprender cómo las nanopartículas de GaN / Fe interactúan con las células e identificar su localización dentro de las células, realizamos un análisis morfológico completo mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Después de la incubación de células endoteliales aórticas porcinas con nanopartículas de 50 μg / ml durante 1 día, las nanopartículas demostraron estar localizadas en vesículas dentro de las células (Fig. 3a). No se encontraron nanopartículas en el citoplasma ni en el núcleo celular. El proceso de absorción de nanopartículas se presenta en la Fig. 3b – d. La mayoría de las nanopartículas son captadas por las células a través de una de las vías de captación clásicas, a saber, a través de la micropinocitosis, la endocitosis mediada por clatrina o la endocitosis mediada por caveolina [9]. El proceso de internalización depende del tipo de célula y del entorno celular local, así como de las propiedades fisicoquímicas de la propia partícula (p. Ej., Tamaño, forma, carga superficial). En el caso de las células endoteliales, se informó que la endocitosis mediada por caveolina tiene una mayor influencia en la absorción de nanopartículas que otros mecanismos debido a la abundancia de caveolina en este tipo de células [10, 11].

Imágenes TEM tomadas de una sola célula endotelial incubada con nanopartículas de GaN / Fe. un Distribución de nanopartículas dentro de vesículas celulares. b - d El proceso de captación de nanopartículas en vesículas. Flechas rojas indican nanopartículas que parecen más oscuras en TEM debido a la alta densidad atómica en comparación con los medios biológicos

Debido a la incorporación antes mencionada de una gran cantidad de Fe, las nanopartículas resultantes exhiben ferromagnetismo, junto con piezoelectricidad inherente al material semiconductor de GaN [12, 13]. Estas dos propiedades fundamentales se pueden utilizar para la activación remota de algunos procesos en las nanopartículas y / o su guiado controlado y distribución espacial en medios relevantes. Las propiedades piezoeléctricas se pueden utilizar para inducir la polarización eléctrica en nanopartículas de GaN mediante, por ejemplo, un campo de ultrasonidos aplicado. De esta forma, se pueden transmitir señales eléctricas a las células para activar o inhibir procesos celulares específicos. En cuanto a las propiedades magnéticas conferidas por el contenido de Fe, permiten alcanzar la visualización dinámica y el control de la posición espacial de las células. Para demostrar experimentalmente esta última posibilidad, las células endoteliales se incubaron en medio EGM ™ -2 complementado con 50 μg / ml de nanopartículas de GaN / Fe durante 3 días (hasta una confluencia celular del 70-80%). Posteriormente, las células se separaron de la superficie y se resuspendieron en EGM ™ -2. Tenga en cuenta que el desprendimiento de células con TrypLE ™ Select y la centrifugación no han afectado la viabilidad celular ni han provocado la liberación de nanopartículas de las células (datos no mostrados). Inmediatamente después de la siembra, las células se incubaron en una incubadora estándar a 37 ° C bajo 5% de CO ₂ , donde se colocó la placa de cultivo sobre imanes permanentes. La Figura 4 muestra la distribución de células endoteliales cargadas de nanopartículas en presencia y ausencia de un campo magnético. La Figura 4a representa células cargadas de nanopartículas incubadas en ausencia de un campo magnético, mientras que en la Figura 4b, las células endoteliales sin nanopartículas se incuban en un campo magnético. Estas imágenes muestran una distribución aleatoria de celdas en ambos casos. La incubación de células cargadas de nanopartículas en un gradiente de campo magnético conduce a una distribución prediseñada de células en ciertas áreas, de acuerdo con el mapa de campo magnético. La Figura 4c representa células en la placa de cultivo después de 1 día de incubación en el campo magnético generado por siete imanes circulares de neodimio de tierras raras con un diámetro de 5 mm y un espesor de 1 mm. La Figura 4d ilustra la distribución de las células después de la incubación en el campo magnético generado por un único imán en forma de anillo con un diámetro de 7 mm y un grosor de 1 mm. En ambos casos, los imanes se colocaron debajo de la placa de cultivo.

Guiado de células endoteliales cargadas de nanopartículas mediante un campo magnético. El grupo de control muestra la distribución espacial de a células endoteliales dirigidas con nanopartículas e incubadas en ausencia de campo magnético y b células endoteliales libres de nanopartículas incubadas en campo magnético. c , d La distribución de las células endoteliales dirigidas con nanopartículas después de 1 día de incubación en un campo magnético

Conclusiones

Hemos demostrado por primera vez que las nanopartículas basadas en GaN / Fe que presentan propiedades magnéticas son absorbidas por las células endoteliales y almacenadas dentro de las vesículas. Las células endoteliales cargadas de nanopartículas de GaN / Fe pueden guiarse de forma controlada utilizando campos magnéticos aplicados. Estos resultados abren nuevas posibilidades para diseñar tejidos tridimensionales in vitro o para dirigir células in vivo a sitios de lesión tisular. Junto con esto, la presencia en las células de nanopartículas de GaN con propiedades piezoeléctricas inherentes allana el camino para la estimulación eléctrica remota de los procesos biológicos celulares. Este enfoque prometedor está siendo investigado en nuestros laboratorios.

Abreviaturas

EDX:

Análisis de rayos X de energía dispersiva

EGM ™ -2:

Medio de factor de crecimiento endotelial

Fe:

Hierro

Fe ₂ O ₃ :

Óxido de hierro (III)

GaN:

Nitruro de galio

GFP:

Proteína de fluorescencia verde

H ₂ :

Hidrógeno

HCl:

Cloruro de hidrógeno

NH ₃ :

Amoníaco

OsO ₄ :

Tetróxido de osmio

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

SEM:

Microscopía electrónica de barrido

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

XRD:

Difracción de rayos X

ZnO:

Óxido de zinc

Nanocables de silicio amorfo cultivados en película de óxido de silicio mediante recocido Nanohelices de oro depositadas oblicuamente en superficies de nanosembrado preparadas sin litografía