Optimización de la captación de nanopartículas núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au para endocitosis dirigida en células de cáncer colorrectal

Resumen

Las nanopartículas (NP) núcleo-cáscara de magnetita (Fe₃O₄)-oro (Au) poseen propiedades magnéticas y ópticas únicas. Combinadas con moieties biológicos, estas NP ofrecen nuevas estrategias para aplicaciones biomédicas como administración de fármacos y dirección de cáncer. Aquí presentamos un método eficaz para la captación celular controlable de sistemas NP magnéticos núcleo-cáscara combinados con moieties biológicos. La vimentina, proteína estructural, ha sido confirmada bioquímicamente para afectar potentemente la fagocitosis. Además, la vimentina afecta la internalización de materiales exógenos en células incluso bajo múltiples inhibiciones de moieties biológicos. En este estudio, demostramos el rendimiento de internalización celular de NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au con modificación superficial usando combinación de moieties biológicos. La fotofluorescencia de NP etiquetadas con vimentina permaneció inalterada bajo pruebas de inhibición múltiple, indicando que las NP fueron mínimamente influenciadas por nistatina, dynasore, citochalasina D e incluso anticuerpo anti-Muc1 (Ab). Consecuentemente, este resultado indica que el Ab anti-Muc1 puede dirigir moléculas específicas y controlar endocitosis específica. Además, mostramos la posibilidad de controlar endocitosis específica en células de cáncer colorrectal.

Introducción

Los nanomateriales han abierto nuevas vías para diagnósticos y terapéutica clínica. Especialmente, las nanopartículas (NP) son herramientas importantes usadas en biosensores, diagnósticos y sistemas de administración de fármacos dirigidos. Para aplicaciones biomédicas, las NP generalmente se componen de materiales orgánicos rodeando materiales de núcleo. Los materiales de núcleo, consistidos de materiales magnéticos, semiconductores u otros, tienen propiedades fisicoquímicas útiles, y la superficie orgánica externa proporciona estabilidad química y funcionalidad a las NP. Para sistemas de dirección biológica, no solo las propiedades fisicoquímicas sino también la superficie orgánica externa, biofuncionalizada para dirección, son parámetros críticos. Ejemplos de moieties de dirección para funcionalización son anticuerpos o ligandos específicos para un objetivo. Dependiendo de los materiales biofuncionalizados en la superficie externa, se determinan los mecanismos de endocitosis de NP. El mecanismo que permite a NP entrar en células ha sido tema de muchos trabajos recientes por su importancia en nanomedicina.

En particular, NP magnéticas se han usado ampliamente en aplicaciones de dirección a sitios específicos, incluyendo separación celular, MRI, aislamiento de ADN, administración de fármacos, tratamiento de hipertermia y dirección de cáncer. Entre varias NP magnéticas, nanocristales de magnetita se han usado más en aplicaciones biomédicas por su biocompatibilidad y estabilidad química. Aunque muchos esfuerzos se han dedicado a aplicaciones biomédicas usando NP magnéticas, persisten problemas críticos como buena dispersibilidad en solución acuosa, funcionalidad y biocompatibilidad. Para superar estos problemas, muchos estudios se han centrado en modificación superficial de NP usando grupos funcionales (ej. carboxilo y amina). Sin embargo, la unión de grupos funcionales a superficie de NP de magnetita es un proceso lento y laborioso. Dado esto, NP magnéticas núcleo-cáscara recubiertas de Au son atractivas porque la superficie de Au puede enlazarse fácilmente a biomoléculas y materiales orgánicos.

Especialmente, las propiedades magnéticas de NP núcleo magnético-cáscara Au permiten separación magnética, aumentan resolución en imagen MRI y pueden aplicarse a terapia de hipertermia. Además, las superiores propiedades de enlace químico del oro son ventajosas para construir sistemas de administración mediada por receptores para dirección específica de cáncer.

En las últimas décadas, muchos investigadores han reportado sistemas de administración mediada por receptores para dirección de cáncer. La dirección mediada por receptores de células cancerosas es una forma de dirección activa. La elección del objetivo es clave para dirección activa eficaz, y los objetivos deben sobreexpresarse en membrana extracelular. La mayoría de investigadores han usado anticuerpos monoclonales para tratamiento de cáncer, y el efecto terapéutico aumenta grandemente cuando terapias con anticuerpos monoclonales se combinan con quimioterapia convencional. A pesar del éxito, los anticuerpos monoclonales presentan limitaciones en dirección de cáncer: su gran tamaño (~150 kDa) obstaculiza penetración tumoral, y su baja estabilidad y solubilidad limitan su uso generalizado. La dirección inhomogénea de su unión al vector de dirección también se considera obstáculo para unión inespecífica. Para producir anticuerpos con mejor penetración tumoral, se han diseñado y probado diversos formatos de anticuerpos. Aparte de anticuerpos clásicos, un formato único está presente en especies de la familia Camelidae: anticuerpos de cadena pesada (HCAb) que ocurren naturalmente en sangre periférica y leche. Los fragmentos de unión a antígeno de tales HCAb están compuestos por un solo dominio, el dominio variable de cadena pesada (VH) del HCAb camelido (VHH). El VHH, obtenido recombinanteamente tras clonación y expresión en bacterias u hongos, se llama nanocuerpo. Tiene peso molecular 11-15 kDa y es el anticuerpo más pequeño entre todos los mAb. No solo su tamaño pequeño los hace potencialmente adecuados como sondas de dirección contra antígenos en ubicaciones aisladas, sino también su extremo terminal fácilmente modificable es atractivo para aplicaciones en dirección de cáncer.

La entrega eficiente de NP con dirección adecuada e internalización celular son también factores importantes en el sistema de administración. Se ha reportado que la vimentina actúa como componente importante de vías de adhesión de patógenos y entrada intracelular. El silenciamiento de expresión génica de vimentina inhibe fagocitosis, mientras vimentina escindida es señal que aumenta significativamente fagocitosis. Por tanto, neutralizar la resistencia a fagocitosis celular causada por vimentina en superficie celular es importante para entrega eficiente de nanopartículas.

En este estudio, investigamos las vías de endocitosis de NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au etiquetadas con nanocuerpo modificadas con espaciadores PEG (polietilenglicol) de diferentes longitudes. La vimentina, conocida por tener fuerte efecto en fagocitosis por experimentos bioquímicos, se comparó como control, confirmando que actúa eficazmente en internalización celular de NP. Además, Muc1, glicoproteína de superficie celular sobreexpresada en varios cánceres (pancreático, mama, pulmón, estómago), se utilizó como biomarcador de dirección de cáncer. Confirmamos la internalización eficiente de NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au y métodos de dirección controlable a células cancerosas vía vía de endocitosis mediada por receptor Muc1 en células colónicas.

Materiales y métodos

Materiales

Acetato de oro (III) (Au(OOCCH₃)₃, 99,9 %) de Alfa Aesar. Otros químicos: acetilacetonato de hierro (III) (Fe(acac)₃, 99,9 %), 1,2-hexadecanodiol (C₁₄H₂₉CH(OH)CH₂(OH), 90 %), poli(glicol etileno)-bloque-poli(glicol propileno)-bloque-poli(glicol etileno) (PEG-PPG-PEG), y éter octílico (C₈H₁₇OC₈H₁₇, 99 %) de Sigma-Aldrich. Éster succinimidilo de alfa-piridil-2-disulfuro-omega-carboxi poli(glicol etileno) (OPSS-PEG-NHS) (2K, 5K, 10K) de Nanocs. Bicarbonato de sodio, WST-1, clorpromazina, nistatina, citochalasina D, dynasore, brefeldina A (BFA), monensina, azul tripano de Sigma-Aldrich. Cy3 y Cy7.5 de Lumiprobe. Anticuerpo anti-Muc1 de Abcam Inc. (Cambridge, MA). Salina fosfato amortiguada (PBS), medio Dulbecco's modified Eagle's y suero bovino fetal de Invitrogen Corp.

Síntesis de NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au

Las NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au se sintetizaron mediante método de nanoemulsión. El proceso consta de dos pasos: (1) formación de NP núcleo Fe₃O₄ y (2) recubrimiento de cáscara Au sobre NP magnéticas. En el primer paso, NP Fe₃O₄ se prepararon de solución mixta de Fe(acac)₃ (0,1766 g o 0,5 mmol), 1,2-hexadecandiol (0,6468 g o 2,5 mmol) y copolímero de bloques (PEO-PPO-PEO) (0,4-1,2 g) en éter octílico. La solución se calentó a 300 °C para reducir precursor Fe. La formación de NP núcleo Fe₃O₄ se completó enfriando la solución calentada. El segundo proceso se realizó continuamente sin purificación tras formación del núcleo magnético. Precursores Au (0,2338 g o 0,62 mmol) y 1,2-hexadecandiol (0,88 g, 3,4 mmol) se añadieron a la emulsión consistente en NP Fe₃O₄, y la mezcla se calentó a 230 °C. Tras enfriar a temperatura ambiente, la emulsión se precipitó por centrifugación y las NP núcleo-cáscara se separaron.

Construcción del vector de expresión recombinante anti-Muc1-VHH 5-24 K10

Se realizó reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebador forward 5'-CCGAATTCGCCGATGTGCAGCTGACCGAG-3' y cebador reverse 5'-CGG CTCGAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3'. El producto PCR se digirió con EcoRI y XhoI y purificó en gel usando QIA quick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). El producto purificado se clonó en pET-23a digerido con EcoRI/XhoI (Novagen, Darmstadt, Alemania). Escherichia coli (E. coli) DH5α (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) se transformó con el constructo resultante por choque térmico y seleccionó en placas agar LB con 100 μg/ml ampicilina (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Bajos).

Expresión y purificación de proteína recombinante

Para expresar y purificar proteína recombinante anti-Muc1-VHH 5-24 K10, E. coli BL21 (RBC Bioscience, Xindian, Taiwan) se transformó con pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10. Bacterias crecieron en caldo LB con ampicilina (100 μg/ml). Expresión proteica se indujo con isopropil β-d-tiogalactósido (IPTG) (Duchefa Biochemie) a concentración final 0,4 mM por 5 h a 37 °C. Pellets bacterianos se resuspendieron en buffer de lisis (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0; 300 mM NaCl) seguido de sonicación en hielo 10 min. Lisados sonicados se centrifugaron a 20.000×g 20 min a 4 °C y sometieron a resina Ni-NTA His·Bind (Peptron, Daejeon, Corea). Proteínas His-tagged unidas a resina se eluyeron con buffer de elución (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0; 300 mM NaCl; 150 mM imidazol). Proteína purificada se separó en gel SDS-PAGE 15 %.

Modificación de NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au

OPSS-PEG-NHS a varias longitudes (2, 5, 10 K) se disolvió en bicarbonato de sodio 0,1 M para activación de grupos tiol. OPSS-PEG-NHS activado se añadió a solución de NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au sintetizadas y agitó 12 h a 4 °C. Los grupos tiol de OPSS-PEG-NHS activado se enlazaron covalentemente a superficie Au de NP núcleo-cáscara. Luego, solución de nanocuerpo (0,25 mg/ml) se añadió a NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-AU PEGiladas por 12 h a 4 °C. Los grupos amina de las diez colas lisina (K) en el terminal se enlazaron covalentemente a grupos NHS de OPSS-PEG-NHS a pH 8,3. Cy3 y Cy7.5 se etiquetaron a grupos amina residuales del nanocuerpo.

Curva de internalización

Células CT26 se sembraron a 5×10³ células/pozo en placa 96 pozos fondo transparente e incubaron en 250 μl medio de cultivo 24 h a 37 °C, 5 % CO₂ en oscuridad. Se retiró medio y se añadieron 250 μl medio fresco con 50 μg/ml NP Fe₃O₄-Au etiquetadas con Cy3 y NP etiquetadas PEG-Cy3 o PEG-nanocuerpo-Cy3. Las células incubaron por diferentes períodos (0, 10, 20, 30, 60, 120, 360 min). Luego se lavaron tres veces con PBS para eliminar NP libres, y la fluorescencia de cada pozo se midió con azul tripano como quencher de fluorescencia impermeable a membrana por SpectraMAX GEMINI (Molecular Devices, CA, USA). Cada experimento se realizó con igual cantidad de NP (50 μg/ml) y se repitió tres veces.

Prueba de inhibición

Células CT26 se sembraron a 5×10³ células/pozo en placa 96 pozos fondo transparente e incubaron 24 h a 37 °C, 5 % CO₂ en oscuridad. Se retiró medio y se añadieron 250 μl medio fresco conteniendo 20 μg/ml clorpromazina (CPZ), 50 μg/ml nistatina, 20 μg/ml citochalasina D, 25 μg/ml dynasore, 20 μg/ml BFA, 140 μg/ml monensina, o 5 μM anti-Muc1 Ab, incubando 1 h. Se retiró medio nuevamente y se añadieron 250 μl medio con 50 μg/ml NP Fe₃O₄-Au etiquetadas Cy3, NP PEG-Cy3, NP PEG-nanocuerpo-Cy3, o NP vimentina-Cy3. Tras 1 h a 37 °C y 5 % CO₂, células se lavaron tres veces con PBS y fluorescencia se midió con azul tripano por SpectraMAX GEMINI. Cada experimento con igual cantidad NP (50 μg/ml) se repitió cuatro veces.

Resultados y discusión

Las NP núcleo-cáscara se sintetizaron por método publicado. Observaciones de microscopía electrónica de transmisión (TEM) en Fig. 1a,b muestran NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au esféricas con diámetro promedio 13,5 nm y distribución estrecha de tamaño. El aumento desde ~8,5 nm del núcleo NP (Fe₃O₄) proviene del recubrimiento de cáscara Au ~2,5 nm en superficie del núcleo. Imagen TEM de alta resolución con análisis de transformada rápida de Fourier (FFT) de NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au se incluye en Información Suplementaria Fig. S1.

El producto fabricado en solvente orgánico se purificó por separación magnética y transfirió a agua. Las NP núcleo-cáscara estuvieron bien dispersas y estables en agua sin modificación superficial, debido a copolímeros de bloques residuales presentes en NP. Fig. 1c,d muestran NP en solución acuosa antes y tras aplicar campo magnético externo. Bajo campo magnético externo, NP núcleo-cáscara cambiaron rápidamente de dispersión homogénea (Fig. 1c) a solución clara y transparente (Fig. 1d).

La banda de absorción de NP núcleo-cáscara se investigó por espectrometría UV-Vis. Como muestra Fig. 1e, pico de absorbancia apareció a ~530 nm, indicando presencia de Au en superficie de NP (Información Suplementaria Fig. S2 incluye resultado de datos EDX para NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au). Al haber sido purificada la muestra, los resultados ópticos demostraron formación de estructura núcleo-cáscara.

Bucles de histéresis magnética se obtuvieron de mediciones de muestra vibrante para investigar propiedades magnéticas de núcleo Fe₃O₄ y NP núcleo-cáscara. Ambas NP mostraron comportamiento superparamagnético con coercitividad cerca 0 Oe a temperatura ambiente (Fig. 1f). Como se reportó en trabajos previos, la susceptibilidad de NP núcleo-cáscara fue mayor que NP de magnetita, atribuible parcialmente a efectos de proximidad y configuraciones espaciales únicas. Las magnetizaciones de saturación de NP núcleo y NP núcleo-cáscara son ~37 emu/g y ~21 emu/g a 10 kOe respectivamente. La diferencia en Ms proviene de componente no magnético (Au) en NP núcleo-cáscara.

El gen VHH 5-24 K10 se clonó en marco para producir pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 tras amplificación PCR (Fig. 2a). La proteína recombinante se expresó en E. coli BL21 transformado con pET-23a-anti-Muc1-VHH 5-24 K10 tras inducción con IPTG y purificación por resina Ni-NTA His·Bind. La proteína recombinante anti-Muc1-VHH 5-24 K10 se expresó fácilmente en E. coli como proteína soluble 18 kDa. De cultivo 1 L, se obtuvo 1±0,5 mg de proteína recombinante purificada.

La proteína purificada se verificó en gel SDS-PAGE 15 %. Tinción azul Coomassie reveló pureza >95 % (Fig. 2b). Las NP Fe₃O₄-Au sintetizadas se modificaron en tres pasos: PEGilación, etiquetado de anticuerpo y etiquetado de tinte (Fig. 2c). Tras cada paso, se midió potencial zeta para confirmar modificación exitosa. Tabla 1 muestra efecto de modificación en potenciales zeta correspondientes. El potencial zeta de NP núcleo-cáscara sin modificar fue -19,8±6,68 mV. La PEGilación se realizó usando OPSS-PEG-NHS. Para producir serie de nanocomplejos con diferentes tamaños, se usó OPSS-PEG-NHS de varias longitudes (2K, 5K, 10K).

Tras PEGilación, potenciales zeta se redujeron (-44,9±8,19 mV, -40,7±7,88 mV, -39,6±8,74 mV para 2K, 5K, 10K respectivamente). Interesantemente, tras etiquetado nanocuerpo, potenciales zeta aumentaron claramente (-38,5±5,61 mV, -23,3±8,61 mV, -31,8±7,37 mV para 2K, 5K, 10K respectivamente). Tras etiquetado tinte, potenciales zeta también aumentaron (-12,5±7,25 mV, -17,7±3,94 mV, -10,6±4,72 mV para 2, 5, 10K respectivamente).

El potencial zeta de NP Fe₃O₄-Au sin modificar fue -19,8±6,68 mV. Tras PEGilación, se redujo a ~-40 mV, indicando que moléculas PEG se enlazaron covalentemente a cáscara Au porque PEG tiene grupos funcionales N-hidroxisuccinimida cargados negativamente. Mientras, potencial zeta aumentó tras etiquetado tinte al nanocuerpo (-38,5±5,61 mV para NP-PEG2K-nanocuerpo y -12,5±7,25 mV para NP-PEG2K-nanocuerpo-tinte). Esto es razonable porque nanocuerpo recombinante tiene diez colas lisina en extremo terminal. Cada tipo de nanocuerpo se categorizó por medición de potencial zeta, y para determinar unión de anticuerpo al nanocuerpo, medimos fluorescencia para cada tipo.

Como muestra Fig. 3, confirmamos que todos los tipos de NP y nanocuerpos tienen buena captación e internalización celular en ausencia de inhibidores. Curva de internalización celular se obtuvo de células incubadas con 50 μg/ml NP Fe₃O₄-Au etiquetadas Cy3, NP PEG-Cy3, y NP PEG-nanocuerpo-Cy3 por diferentes períodos (0-360 min) tras retirar medio, lavar NP libres, y medir fluorescencia total con azul tripano (Fig. 3). Según medición de intensidad fluorescente, NP se internalizaron en células dentro de 1 h (Fig. 3a). Intensidad fluorescente de NP alcanzó máximo en 1 h y disminuyó gradualmente tras alcanzar estado estable. Aunque hay ligera diferencia temporal según presencia de Ab, intensidad fluorescente por tiempo de cultivo no difirió significativamente de NP sin modificar (Fig. 3b). Como muestra Fig. 3c, efecto de Ab, usando Ab heterogéneos de Muc1 y vimentina, fue despreciable en captación e internalización celular de NP.

Con ensayo WST-1, viabilidad (%) de células CT26 mucinas según concentración y modificación superficial de NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au se estimó tras varios tiempos de exposición (Fig. 4a,b). Viabilidad de células CT26 no mostró diferencias significativas tras 24 h y 48 h exposición, ni con dosis variables ni tras modificación superficial de NP. Viabilidad celular >90 % tanto en NP Fe₃O₄-Au sin modificar (Fig. 4a) como en NP modificadas (Fig. 4b).

Fig. 5 indica que NP entraron en células CT26 mucinas vía varias vías de endocitosis (mediada por clatrina, caveolae, fagocitosis/macropinocitosis). Interesantemente, Fig. 5b muestra que anti-Muc1 Ab también afectó principalmente endocitosis de NP PEG-nanocuerpo-Cy3. Para entender vía de internalización NP, intentamos inhibir vías de endocitosis con inhibidores químicos específicos (Fig. 5). Vías de endocitosis se dividen en tres tipos: mediada por clatrina, caveolae, y macropinocitosis/fagocitosis.

En este estudio, inhibidores se usaron como primer enfoque para investigar internalización de NP etiquetadas con nanocuerpo. CPZ (inhibidor endocitosis mediada por clatrina), nistatina (inhibidor endocitosis mediada por caveolae), dynasore (inhibidor dinamina), citochalasina D (inhibidor fagocitosis/macropinocitosis), BFA (destructor aparato Golgi), monensina (inhibidor lisosoma), o anti-Muc1 Ab (competidor específico receptor/transportador) incubaron con células 1 h. CPZ, nistatina, dynasora y citochalasina D afectaron endocitosis de NP (Fig. 5a).

El moiety de dirección es clave para éxito de dirección de cáncer, excepcionalmente importante en terapia de cáncer. Para dirección, modificación superficial eficaz es muy importante para aumentar eficiencia terapéutica y limitar efectos secundarios. NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au etiquetadas con nanocuerpo se hicieron exitosamente de NP sintetizadas y nanocuerpo recombinante. Tabla 1 muestra claramente que cada paso de modificación se realizó exitosamente.

Viabilidad celular es elemento esencial para aplicación biológica de nanomateriales. Viabilidades >90 % en NP núcleo-cáscara sin modificar y modificadas (Fig. 4a,b) implican que NP Fe₃O₄-Au sin modificar y modificadas no causaron citotoxicidad significativa dependiente de concentración y modificación, y NP modificadas son adecuadas para aplicación biológica.

Los estudios de eficiencia de internalización y efecto inhibidor de NP proveen información importante para entender mecanismos por los que NP entran en células. NP PEGiladas se internalizaron relativamente lento comparado con NP sin modificar, pero NP etiquetadas con nanocuerpo se internalizaron ligeramente más rápido que NP sin modificar (Fig. 3a,b). Como PEGilación es método conocido de modificación superficial para prevenir internalización de NP, la tendencia de internalización de NP PEGiladas se explica fácilmente. Además, nanocuerpo indujo endocitosis de NP. Para comprobar especificidad del nanocuerpo, confirmamos tasa de internalización de NP etiquetadas con Ab vimentina. Interesantemente, NP etiquetadas con Ab vimentina no promovieron internalización celular (Fig. 3c).

Estos resultados indican que nanocuerpo puede inducir eficazmente internalización de nanomateriales en células CT26 mucinas e implican que tendencia de internalización puede controlarse con modificación específica de membrana externa de NP. Además, mecanismos de endocitosis de NP etiquetadas con nanocuerpo se mostraron claramente vía pruebas de inhibición y microscopía confocal. Fotofluorescencia de NP etiquetadas con nanocuerpo y NP sin etiquetar mostraron valores decrecientes similares cuando cultivadas con CPZ, nistatina o dynasore (Fig. 5a,b). CPZ, nistatina y dynasore inhiben respectivamente endocitosis mediada por clatrina, caveolae, y dinamina (GTPasa grande implicada en gemación y escisión de vesículas nascentes de membranas parentales). Así, valores de fotofluorescencia en ambos casos disminuyeron rápidamente porque dinamina está estrechamente relacionada con producción de vesículas para endocitosis mediada por clatrina y caveolae. Como muestra Fig. 5a, tanto NP sin etiquetar (Fig. 5a) como NP etiquetadas con nanocuerpo (Fig. 5b) mostraron disminuciones rápidas de fotofluorescencia.

En particular, NP etiquetadas con nanocuerpo mostraron valores de fotofluorescencia significativamente menores en CPZ, nistatina y dynasore. Además, confirmamos que NP sin etiquetar fueron más afectadas que NP etiquetadas con nanocuerpo al aplicar citochalasina D, toxina permeable que bloquea polimerización de filamentos actina para fagocitosis. Estos resultados implican que NP sin etiquetar se internalizaron mediante múltiples mecanismos: endocitosis mediada por clatrina, caveolae y fagocitosis. Consecuentemente, internalización celular de NP etiquetadas con nanocuerpo depende de endocitosis mediada por clatrina y caveolae. Además, cantidad de captación celular de NP etiquetadas con nanocuerpo se redujo considerablemente cuando células cultivadas con anticuerpo Muc1 (Fig. 5b). Esto indica que Ab Muc1 libre actúa como competidor del nanocuerpo en NP modificadas uniéndose a membrana CT26 y que Ab Muc1 juega papel importante en internalización celular de NP modificadas. Peculiarly, NP etiquetadas con Ab vimentina mostraron diferencias obvias vs NP etiquetadas con nanocuerpo en capacidad de inhibición. Fotofluorescencia de NP etiquetadas con vimentina permaneció inalterada bajo pruebas de inhibición múltiple, indicando que NP fueron mínimamente influenciadas por nistatina, dynasore, citochalasina D e incluso Ab Muc1. Este fenómeno podría ser evidencia de eficacia de vimentina, confirmada bioquímicamente para afectar potentemente fagocitosis. Consecuentemente, este resultado indica que Ab Muc1 puede dirigir moléculas específicas y controlar endocitosis específica.

Como muestra Fig. 6, resultados análogos se obtuvieron tratando células con NP núcleo-cáscara sin modificar etiquetadas Cy7.5 y NP PEG-nanocuerpo etiquetadas, indicando captación celular similar en ausencia de inhibición dynasore. Inhibición dynasore indujo internalización celular distintamente menor de NP PEG-nanocuerpo etiquetadas vs NP sin modificar (Fig. 6b, fila inferior). Esto implica dos mecanismos de endocitosis: endocitosis no específica de NP sin modificar y endocitosis restringida de NP etiquetadas con nanocuerpo vía molécula dinamina. Una vez nanocuerpo se une a membrana celular externa, NP etiquetadas con nanocuerpo pasan fácilmente membrana por activación simultánea de mecanismos mediados por clatrina y caveolae. Por tanto, suponemos que mecanismos principales son ambos endocitosis mediadas por clatrina y caveolae para internalización de NP etiquetadas con nanocuerpo en células CT26 mucinas.

Conclusiones

Nanomateriales para dirección de cáncer e inserción controlable de materiales exógenos (fármacos, genes, péptidos) son avances críticos en aplicaciones biomédicas. Estos conceptos familiares pero creativos ofrecen estrategias para nuevos métodos terapéuticos. En este artículo, demostramos captación celular mejorada de NP núcleo-cáscara Fe₃O₄-Au tras PEGilación con anticuerpo Muc1. Los principales mecanismos de endocitosis de NP etiquetadas con nanocuerpo se demostraron, mostrando posibilidad de endocitosis específica controlable en células de cáncer colorrectal. Estos hallazgos proveen insight sobre dirección entre NP etiquetadas con nanocuerpo y células de cáncer colorrectal para diseñar vectores de dirección de alta eficiencia.