Captura dependiente de la forma de nanoestructuras de oro en células de glioblastoma: De la síntesis a la interacción celular

Resumen

Las nanoestructuras de oro (Au NS) con tamaño y forma controlados emergen como herramientas versátiles para la nanomedicina. Sin embargo, el destino celular de diferentes geometrías permanece poco comprendido, particularmente en cánceres agresivos como el glioblastoma. Aquí sintetizamos cinco Au NS distintas —nanobarras (NR), tetrahexaedros (THH), bipirámides (BP), partículas esféricas (SP) y una forma novedosa denominada nano-makura (NM)— usando crecimiento mediado por semillas con surfactantes binarios y una ruta de Turkevich modificada. Todas las partículas se funcionalizaron superficialmente con PEG-SH y ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA) para impartir carga negativa y estabilidad estérica. Ensayos de citotoxicidad (LIVE/DEAD) en células de glioblastoma U-87 MG revelaron efectos dependientes de la forma: NM exhibió la mayor muerte celular (~20 % a 2 mg mL⁻¹) mientras que SP y BP permanecieron mayormente no tóxicas. Microscopía electrónica de transmisión mostró que NM entra en las células vía endocitosis mediada por receptores en 2 h y posteriormente desencadena macropinocitosis, llevando a acumulación vesicular y eventual desprendimiento celular. Estos hallazgos demuestran que la morfología de la partícula, más que el tamaño, gobierna las vías de captación celular y los resultados citotóxicos, posicionando a NM como candidato prometedor para terapia fototérmica dirigida y administración de fármacos en glioblastoma.

Antecedentes

Las nanoestructuras de oro son apreciadas por sus propiedades ópticas y electrónicas dependientes de forma y tamaño, permitiendo aplicaciones desde biosensores hasta terapia fototérmica. La resonancia de plasmones de superficie localizada (LSPR) en la región visible-infrarrojo cercano (NIR) hace que partículas anisotrópicas, especialmente nanobarras de alto aspecto, sean excelentes agentes de contraste para tomografía computarizada e imagen fotoacústica. Nanoestructuras más pequeñas exhiben absorción superior, mejorando la eficiencia fototérmica. Además, formas anisotrópicas pueden autoensamblarse en superestructuras que generan campos electromagnéticos intensos, ventajosos para dispersión Raman mejorada en superficie y administración dirigida de fármacos.

El crecimiento mediado por semillas, a menudo suplementado con iones de plata y mezclas de surfactantes (ej. CTAB con ácido oleico o DDAB), se ha vuelto el método preferido para adaptar Au NS, ya que permite control preciso sobre la relación de aspecto y el crecimiento de facetas. A pesar de avances en síntesis, los estudios sistemáticos sobre cómo diferentes geometrías interactúan con células —particularmente glioblastoma, un tumor cerebral altamente proliferativo e invasivo— son limitados. Comprender estas interacciones es esencial para diseñar nanomedicinas que seleccionen células cancerosas minimizando efectos fuera de blanco.

El glioblastoma multiforme (GBM) sigue siendo el tumor cerebral primario más letal, con supervivencia media menor a 15 meses a pesar de terapia agresiva. Las células de glioblastoma-astrocitoma U-87 MG proliferan rápidamente (tiempo de duplicación ~32 h) e internalizan fácilmente partículas extrañas, lo que las hace ideales para estudios de captación. Aquí presentamos una comparación exhaustiva de cinco formas de Au NS, centrándonos en síntesis, funcionalización superficial, citotoxicidad y mecanismos de captación en células U-87 MG.

Experimental

Materiales

Todos los reactivos (ácido oleico, nitrato de plata, CTAB, HAuCl₄·3H₂O, ácido ascórbico, NaBH₄, PEG-SH, MUA, etc.) se adquirieron de Sigma-Aldrich o Merck y se usaron sin purificación adicional. Las soluciones se prepararon con agua ultrapura (18,2 MΩ cm).

Síntesis de Au NS anisotrópicas

Partículas semilla (~5 nm) se prepararon reduciendo HAuCl₄ con NaBH₄ en CTAB. Para nanobarras, tetrahexaedros y bipirámides, una solución de crecimiento conteniendo CTAB, un co-surfactante (ácido oleico o DDAB), AgNO₃ y ácido ascórbico se calentó a 80 °C. Tras enfriar, se añadieron solución semilla y HAuCl₄, y la mezcla se agitó a 35 °C durante 24 h. Ajustar la relación ácido oleico/CTAB produjo la morfología deseada: bajas relaciones generaron nanobarras en forma de hueso de perro, relaciones más altas dieron tetrahexaedros elongados, y la combinación CTAB/DDAB produjo bipirámides. Para la novedosa forma nano-makura, se empleó un crecimiento en dos pasos: una reacción inicial mediada por semilla fue seguida por una segunda etapa de crecimiento usando la solución intermedia, produciendo una partícula tridimensional irregular que se asemeja a una almohada (almohada = makura en japonés).

Síntesis de Au NS esféricas

Las SP se fabricaron por un método de Turkevich modificado: una solución de citrato sódico 10 mM (10 mL) se calentó a 70 °C, seguida de adición gota a gota de 1,5 mM HAuCl₄ (10 mL). La mezcla se tornó rojo-púrpura tras ~8 min y se enfrió a temperatura ambiente antes de centrifugar (14 500 rpm, 10 min).

Funcionalización superficial

Las partículas se incubaron primero con PEG-SH (1 mg mL⁻¹) durante 2 h para reemplazar CTAB y proveer estabilización estérica. Tras centrifugación, las NS pegiladas se trataron con MUA (250 µL 10 mM en EtOH/H₂O) durante 1 h a 55 °C, logrando eliminación completa de CTAB e impartiendo carga superficial negativa. Tamaño y potencial zeta se monitorizaron por DLS; XPS confirmó la eliminación de bromo de la superficie.

Cultivo celular y ensayo de viabilidad

Células U-87 MG se mantuvieron en EMEM suplementado con 10 % FBS, 2 mM L-glutamina, 1 % NEAA, 1 mM piruvato sódico y 1,25 % gentamicina. Para citotoxicidad, células al 70 % de confluencia se incubaron con Au NS a 100, 200, 500 µg mL⁻¹ y 2 mg mL⁻¹ durante 24 h. La muerte celular se cuantificó por ensayo LIVE/DEAD (calceína AM y etidio homodímero-1) y tinción nuclear Hoechst, imagenadas en microscopio Zeiss Axiovert 200 M. Se analizaron tres pozos independientes por concentración.

Estudio de captación dependiente del tiempo (NM)

Células se expusieron a 2 mg mL⁻¹ NM durante 2, 6, 12 y 24 h. Tras incubación, las células se fijaron con 2 % paraformaldehído y 2,5 % glutaraldehído, post-fijadas con tetróxido de osmio (± ferrocianuro potásico), deshidratadas y embebidas para secciones ultrafinas (70 nm) de TEM. Las imágenes TEM se usaron para rastrear localización y morfología de NM dentro de compartimentos celulares.

Caracterización

STEM de campo claro y HRTEM (JEOL 2100, 200 kV) evaluaron morfología y cristalinidad. Espectros UV-Vis (200-800 nm) se registraron en Shimadzu UV-2401PC. Dispersión dinámica de luz y potencial zeta se midieron en Malvern Zetasizer Nano-ZS. XPS se realizó con espectrómetro Kratos Axis Ultra DLD (Al Kα, 1486,6 eV).

Resultados y Discusión

Síntesis y caracterización de Au NS anisotrópicas

El crecimiento mediado por semillas con surfactantes binarios produjo nanobarras de alto rendimiento (~20 nm × 50 nm), tetrahexaedros (~50 nm longitud de arista) y bipirámides (~200 nm). Las partículas nano-makura mostraron una morfología única tridimensional irregular, confirmada por TEM en múltiples orientaciones. HRTEM reveló núcleos monocristalinos con facetas lisas para NR, mientras que NM mostró superficies irregulares y una banda LSPR más ancha, reflejando su polidispersidad. Los espectros UV-Vis exhibieron picos de plasmón longitudinal y transversal distintos: NR (516, 679, 796 nm), THH (≈568 nm), BP (≈593 nm), NM (≈557 y 760 nm). SP mostró un solo pico a 520 nm.

Resultados de la funcionalización superficial

Medidas DLS mostraron aumentos incrementales de tamaño tras recubrimiento con PEG-SH y MUA, excepto para BP donde se observó una ligera disminución debido a empaquetamiento más denso. El potencial zeta cambió de positivo (recubierto con CTAB) a negativo (recubierto con MUA), confirmando el intercambio de ligando exitoso. Los espectros XPS mostraron bromo despreciable, indicando eliminación casi completa de CTAB. Los espectros ópticos permanecieron prácticamente inalterados, con solo un leve ensanchamiento de picos para formas anisotrópicas, atribuible a aumento de tamaño y rugosidad superficial.

Citotoxicidad dependiente de la forma

Los ensayos LIVE/DEAD revelaron que NM indujo la mayor muerte celular (~20 % a 2 mg mL⁻¹), mientras que SP y BP permanecieron <5 % citotóxicas en todas las concentraciones. NR, a pesar de su alta relación de aspecto y carga superficial positiva, no aumentaron la muerte celular respecto a otras formas, sugiriendo que la medición de carga superficial por potencial zeta puede no reflejar con precisión la carga local real en partículas anisotrópicas. En general, el tamaño jugó un papel menor; tanto SP de 15 nm como BP de 650 nm mostraron captación y toxicidad comparables.

Mecanismos de captación de nano-makura

TEM resuelto en tiempo mostró NM asociándose con la membrana plasmática tras 2 h, seguida de internalización vía endocitosis mediada por receptores. A 12 h, vesículas conteniendo NM indicaron un cambio a macropinocitosis, probablemente debido a agregación y adsorción de proteínas. NM se localizó preferentemente en la periferia de endosomas, alineándose con la membrana vesicular, y traficó hacia la región perinuclear. A 24 h, la acumulación vesicular extensa correlacionó con cambios morfológicos: las células perdieron filopodios, se redondearon y se desprendieron del sustrato, indicando disrupción del citoesqueleto y apoptosis.

Discusión

Estos resultados destacan la influencia crítica de la morfología de la partícula en las vías de captación celular. Mientras que formas anisotrópicas pueden mejorar propiedades ópticas y fototérmicas, su geometría irregular también puede aumentar la formación de corona proteica, promoviendo macropinocitosis y citotoxicidad. Las partículas nano-makura, con su estructura similar a almohada, lograron internalización eficiente y muerte celular significativa, convirtiéndolas en candidatos atractivos para terapia de glioblastoma. Futuros estudios deben explorar biodistribución in vivo y eficacia terapéutica, así como funcionalización con ligandos dirigidos para mejorar la selectividad.

Conclusiones

Sintetizamos cinco nanoestructuras de oro de formas y tamaños distintos, las funcionalizamos uniformemente con PEG-SH y MUA para obtener partículas estables y cargadas negativamente. La forma, más que el tamaño, dictó la captación celular y citotoxicidad en células de glioblastoma U-87 MG. La novedosa forma nano-makura demostró internalización superior, conduciendo a muerte celular significativa vía endocitosis mediada por receptores y posterior macropinocitosis. Estos hallazgos posicionan a nano-makura como una plataforma prometedora para terapia fototérmica combinada y administración de fármacos en tumores cerebrales agresivos.

Abreviaturas

AgNO₃

Nitrato de plata

Au

Oro

BF

Campo claro

BP

Bipirámides

CTAB

Bromuro de cetiltrimetilamonio

DDAB

Bromuro de didodecildimetilamonio

DLS

Dispersión dinámica de luz

EMEM

Medio Mínimo Esencial de Eagle

EthD-1

Etidio homodímero-1

GBM

Glioblastoma multiforme

HAuCl₄

Ácido cloroáurico

HRTEM

Microscopía electrónica de transmisión de alta resolución

IR

Infrarrojo

LSPR

Resonancia de plasmón de superficie localizada

MUA

Ácido 11-mercaptoundecanoico

Na-citrato

Citrato sódico dihidratado

NM

nano-makura

NR

Nanobarras

NS

Nanoestructura

OA

Ácido oleico

PEG-SH

O-[2-(3-mercaptopropionilamino)etil]-O-etilpolietilenglicol

STEM

Microscopía electrónica de transmisión de barrido

TEM

Microscopía electrónica de transmisión

THH

Tetrahexaedros

UV-Vis

Espectroscopía ultravioleta-visible

XPS

Espectroscopía de fotoelectrones de rayos X