Nanopartículas biogénicas Au@Ag core-shell sintetizadas con extracto de Rumex hymenosepalus para aplicaciones antimicrobianas

Resumen

En este trabajo, se utilizó un método de síntesis secuencial para nanopartículas bimetálicas oro-plata con estructura core@shell (Au@AgNPs). El extracto de raíz de Rumex hymenosepalus (Rh), que presenta alto contenido en catequinas y estilbenos, se usó como agente reductor en la síntesis de nanopartículas. La distribución de tamaño obtenida por Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) da un diámetro medio de 36 ± 11 nm para Au@AgNPs, 24 ± 4 nm para nanopartículas de oro (AuNPs) y 13 ± 3 nm para nanopartículas de plata (AgNPs). Las formas geométricas de las NPs fueron principalmente cuasi-esféricas. El grosor de la capa de plata sobre AuNPs es de alrededor de 6 nm y está cubierta por biomoléculas activas en la superficie. La caracterización de nanopartículas incluyó imágenes de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF) registradas con un microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM), Espectroscopía de Rayos X Dispersiva en Energía (EDS), Difracción de Rayos X (DRX), Espectroscopía UV-Vis, Potencial Zeta y Dispersión Dinámica de Luz (DDL). El Espectrómetro de Transformada de Fourier Infrarroja (FTIR) y la Espectroscopía de Fotoelectrones de Rayos X (XPS) muestran que las nanopartículas están estabilizadas por moléculas del extracto. Se realizó un estudio de cinética de crecimiento usando el modelo de Gompertz para microorganismos expuestos a nanomateriales. Los resultados indican que AgNPs y Au@AgNPs afectan la fase de latencia y la tasa de crecimiento de Escherichia coli y Candida albicans de manera dependiente de la dosis, con una mejor respuesta para Au@AgNPs.

Introducción

En los últimos 25 años, se han estudiado varios métodos químicos para la síntesis de nanomateriales; sin embargo, la mayoría de estos métodos usan sustancias que son dañinas para el medio ambiente y usan altas temperaturas o equipos costosos. En este trabajo, realizamos la síntesis de nanoestructuras oro-plata usando el método de síntesis verde. Este método minimiza la contaminación desde el principio. Usando procesos "limpios", evitando la mayoría de los residuos y el uso de contaminantes peligrosos en el desarrollo de nanomateriales "limpios" que no representan una amenaza para la salud o el medio ambiente.

La síntesis verde de nanopartículas metálicas busca una influencia positiva de la interacción con sistemas biológicos, lo que significa que las nanopartículas y su auto-funcionalización con moléculas de polifenoles generan interacciones biológicas compatibles con sistemas como células y macromoléculas. En general, estas interacciones biológicas se usan como nanomedicina para enfermedades como cáncer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas. La síntesis de plata (capa) y AuNPs como sistema core-shell tiene aplicaciones como sensores ópticos de diagnóstico, sensores moleculares [1, 2], terapias fototérmicas, antimicrobianos y mejora el proceso catalítico [3,4,5,6] comparado con NPs monometálicas.

En particular, métodos secuenciales o simultáneos en diferentes reactores, métodos químicos y físicos [7] se usan para la síntesis bimetálica: pirólisis por pulverización ultrasónica [8], método sonquímico [5], chip microfluídico [9], nanoprecipitación nanofluídica secuencial [10, 11], microemulsiones [12], liposomas [13], los agentes reductores usados son de tipo químico o químico verde.

Materiales secos se usan en síntesis de nanopartículas como óxidos metálicos [14], nanotubos de carbono [15, 16], otros usan dispositivos electrónicos suaves impresos [17]. Húmedos, nanopartículas usadas en sistemas biológicos [18,19,20], transportadores de fármacos [21, 22], antimicrobianos [23, 24], aplicaciones de sensado [25] y la nanotecnología computacional es una clasificación moderna [26] usada para definir usos.

Khatami et al. revisaron la síntesis verde usando plantas de nanopartículas tipo core@shell, en particular se usaron Antigonon leptopus, Diopyros kaki, Azadirachta indica, Potamogeton pectinatus, Anacadium oceidentale para la síntesis de nanopartículas Au@Ag con tamaño entre 5 y 500 nm (a), se probaron para diferentes aplicaciones (no antibacterianas), y extracto de raíz de Asparagus racemosus se usó para síntesis de nanopartículas de aleación Au-Ag encontrando una CMI a 480 µg/mL probada en Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus [27]. Au@Ag NPs obtenidas por síntesis química tienen aplicaciones como antibacterianas, y la CMI reportada es alrededor de 2,5 µg/mL para contenido de plata (capa) [28], Lu et al. reportaron una síntesis química de Au/AgNPs@Van preparadas usando NaBH₄ y adición de Vancomicina y la CMI fue 60 nmol/mL para nanopartículas bimetálicas probadas en bacterias gram-positivas y negativas [29].

Las propiedades antibacterianas de nanomateriales bimetálicos [30,31,32,33,34] mejoran en función de la concentración de Ag. En contraste, un incremento en la concentración de Au disminuye las propiedades antibacterianas pero reduce el efecto citotóxico, es decir, el material bimetálico se vuelve más biocompatible [35]. Comparando el efecto de materiales monometálicos Au y Ag con materiales bimetálicos [36,37,38,39,40], se ha demostrado que ocurre un efecto sinérgico [41] entre materiales bimetálicos, generando efectos bifuncionales [28, 42].

La funcionalización de nanomateriales tiene interés particular ya que el entorno químico [43,44,45] (pH, presencia de azufre, moléculas biocompatibles, etc.) alrededor del sistema tendrá efectos en la interacción con células o microorganismos; por tanto, el énfasis en generar biomateriales usando química verde [46,47,48,49,50,51,52,53,54,55].

La composición química de las partículas bimetálicas [56,57,58] será un factor determinante en sus propiedades ópticas [41, 59], debido al efecto sinérgico de nanoestructuras monometálicas [60].

En este trabajo, nanopartículas de oro y plata se sintetizaron usando como agente reductor un extracto de Rumex hymenosepalus, que es una planta que contiene moléculas de estilbenos y catequinas que actúan como potentes antioxidantes en la reducción de iones metálicos. Nanopartículas de oro se usaron como núcleos para obtener nanopartículas bimetálicas tipo core@shell de Au@Ag a través de un método de síntesis secuencial. La caracterización de nanomateriales involucra las técnicas de HAADF-STEM, MET con EDS y HRTEM.

Con los diferentes tipos de nanopartículas sintetizadas, se realizó un estudio comparativo sobre la dinámica de crecimiento de las bacterias E. coli y S. aureus y la levadura Candida albicans.

Sección Experimental

Materiales

Las raíces de Rumex hymenosepalus se adquirieron en un establecimiento comercial local. Ambos precursores HAuCl₄ y AgNO₃ para síntesis de nanopartículas se compraron de Sigma-Aldrich con pureza del 99 %. Caldo Brain Heart Infusion (BHI) y Caldo Dextrosa de Papa (PDB) usados para ensayos de microorganismos se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Etanol (99 % puro) usado en el proceso de limpieza de nanopartículas se adquirió de Fermont, y agua ultrapura (milli-Q) se usó en los experimentos.

Extracto de Rumex hymenosepalus

Para la preparación del extracto, 150 g de raíz cortada en rodajas y previamente deshidratada se maceraron en 1000 mL de una mezcla etanol/agua 70/30 V/V. La maceración se realizó a temperatura ambiente en un recipiente de vidrio con tapón hermético y protegido de la luz. La absorbancia de la solución obtenida se monitoreó durante 21 días hasta que no hubo cambios en su valor. En este momento, el proceso de maceración se consideró finalizado. El extracto obtenido se filtró sucesivamente con filtros de papel Whatman con tamaños de poro de 8 µm y 2 µm y finalmente con un filtro acrodisc de 0,22 µm. El etanol se eliminó por rotavaporación, y el extracto acuoso concentrado se congeló a -80 °C para liofilización (Labconco, FreeZone 1L). Los polvos obtenidos se almacenaron en recipientes estériles protegidos de la luz a temperatura ambiente hasta su uso.

Síntesis de AuNPs

Primero, se preparó una solución acuosa de Rumex hymenosepalus a 10 mg/mL a partir del extracto liofilizado. Luego, 16 mL de solución de Rumex se mezclaron con 32 mL de agua ultrapura, manteniendo agitación a 1000 rpm y se añadieron lentamente 16 mL de HAuCl₄ (0,01 M). La reacción se mantuvo durante una hora bajo condiciones de iluminación de laboratorio y a temperatura ambiente. La intensidad de resonancia de plasmon de superficie (λSPR = 540 nm) se evaluó por espectroscopía UV-Vis a lo largo del tiempo; cuando no se observó cambio, la síntesis se consideró completa. El producto obtenido se centrifugó a 12 000 rpm, el sobrenadante se reemplazó por agua ultrapura y se aplicó un proceso de sonicación durante 1 h para redispersar nanopartículas. El procedimiento se repitió tres veces más. Agua se usó como disolvente en las dos primeras ocasiones y etanol en la última. Finalmente, la dispersión etanólica se centrifugó y los precipitados se secaron en horno de convección a 40 °C para preparar una dispersión acuosa de AuNPs a 2300 µg/mL.

Síntesis de Au@AgNPs

Para la síntesis de Au@AgNPs, 2 mL de la dispersión acuosa de AuNPs (2300 µg/mL), 0,8 mL de AgNO₃ (0,1 M) y 0,8 mL de solución de Rumex hymenosepalus (10 mg/mL) se depositaron en un tubo de cultivo de vidrio estéril. La mezcla se sonicó durante 3 h en un baño ultrasónico (Branson, Modelo 2510). Luego, el contenido se centrifugó a 12 000 rpm durante una hora, los sólidos obtenidos se redispersaron en agua ultrapura por sonicación para obtener una concentración de 1000 µg/mL.

Síntesis de AgNPs

Para producir AgNPs, 16 mL de solución de extracto (10 mg/mL) se mezclaron con 64 mL de agua ultrapura y 8 mL de AgNO₃ 0,1 M. La reacción se llevó a cabo durante una hora bajo condiciones de iluminación de laboratorio a 25 °C, y la resonancia de plasmon de superficie (λSPRᴬᵍ = 440 nm) se monitoreó por espectroscopía UV-Vis a lo largo del tiempo para evaluar la formación. El producto se centrifugó a 12 000 rpm, el sobrenadante se reemplazó por agua ultrapura y se aplicó sonicación durante 1 h. El procedimiento se repitió tres veces más. Agua se usó como disolvente en las dos primeras ocasiones y etanol en la última. La dispersión etanólica se centrifugó y los precipitados se secaron en horno de convección a 40 °C. Finalmente, el polvo de AgNPs obtenido se redispersó en agua ultrapura por sonicación para generar una dispersión coloidal a concentración de 2000 µg/mL.

Caracterizaciones

Los espectros de absorción UV-Vis se obtuvieron en un espectrómetro PerkinElmer Lambda 45 de doble haz. Se empleó una rendija de 0,5 nm y los espectros se registraron a una velocidad de 480 nm/min en un rango entre 200 y 900 nm. Para las nanopartículas, se usaron 50 µL de muestra y solo 5 µL para el extracto. El volumen final se completó a 3 mL en cubetas de cuarzo usando agua ultrapura como disolvente.

El potencial zeta (ζ) de AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs se midió usando un Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK). Cada muestra se midió a temperatura ambiente (25 °C) por triplicado y en función de la concentración a 1, 10, 50 y 100 µg/mL para cada muestra.

DDL para AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs se midieron usando un Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK) equipado con láser He-Ne de 633 nm. Cada muestra se midió a temperatura ambiente (25 °C) por triplicado y en función de la concentración a 1, 10, 50 y 100 µg/mL para cada muestra. El Índice de Polidispersidad (PDI) se determinó a partir de experimentos DDL usando software Malvern mediante la definición PDI = (σ/D̄)², donde D es el diámetro promedio y σ es la desviación estándar de D. Valores PDI con 0,10 o menos se consideran altamente monodispersos [62].

La banda prohibida óptica Eg se calculó para AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs, usando la ecuación de Tauc para determinar una banda prohibida en materiales mediante la siguiente relación:

α = (c/hν)(hν - Eg)^(1/n) (1)

donde α es el coeficiente de absorción del material (α = 2,303 A/d donde A es absorbancia y d es el ancho de la celda) y donde Eg es la energía de banda prohibida óptica y hν es la energía del fotón obtenida trazando una línea entre (αhν)ⁿ y energía del fotón hν. El número índice n se toma como 2 para transiciones permitidas directas de banda a banda en muestras [63] y puede evaluarse fácilmente con un ajuste lineal [64]. Depende del tipo de transición que puede tener valores 1/2, 2, 3/2 y 3 correspondientes a transiciones permitidas directas, permitidas indirectas, prohibidas directas y prohibidas indirectas, respectivamente [65].

Muestras AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs y Rh se analizaron mediante absorción infrarroja usando un FTIR (PerkinElmer, Inc., Waltham, Spectrum Two). Los parámetros de adquisición fueron: resolución 4 cm⁻¹, 16 barridos y rango de longitud de onda entre 4000 y 900 cm⁻¹.

Los ensayos de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X se realizaron en un PerkinElmer modelo PHI 5100, que contiene una fuente dual de Mg/Al, 300 W, 15 kV. La línea de emisión Mg Kα con energía de 1253,6 eV se usó para AgNPs, AuNPs, Ag@AuNPs y Rh. Todos los experimentos se realizaron bajo condiciones de vacío de 2 × 10⁻⁹ Torr [66]. Los datos se analizaron usando software Multipak. Para la caracterización XPS, las diferentes dispersiones de nanopartículas y la solución de extracto de Rumex hymenosepalus se depositaron en cubreobjetos limpios de la siguiente manera. Se añadieron 30 µL de la muestra al cubreobjetos permitiendo que se secara completamente para el siguiente depósito. El proceso se repitió al menos 5 veces hasta que se formó una película delgada y luego se caracterizó por XPS.

La Microscopía Electrónica de Transmisión de Barrido de Campo Oscuro Anular de Alto Ángulo (HAADF-STEM) puede considerarse un modo de operación poderoso en microscopía electrónica, que proporciona gran cantidad de información complementaria que dilucida la estructura de un nanomaterial. HAADF-STEM corregido de aberraciones puede determinar con resolución atómica las posiciones de átomos de diferente naturaleza química. Esto se debe a HAADF-STEM corregido de aberraciones, conocido por su sensibilidad química y alta resolución espacial [67]. En este modo de operación, la imagen incoherente es dominante con una contribución insignificante de contraste de difracción [68]. Así, el contraste de número atómico (contraste Z) en HAADF-STEM corregido de aberraciones nos permite determinar los detalles estructurales de nanoestructuras con gran precisión.

Para análisis STEM, las muestras se analizaron en un microscopio electrónico JEOL-JEMARM200 operando a 200 kV, con corrector CEOS para la lente condensadora. Imágenes STEM de contraste Z se registraron simultáneamente en modos BF y HAADF. Las imágenes se registraron con apertura de lente condensadora de 40 micras (ángulo de convergencia 32-36 mrad) y tamaño de punto de 9 pA.

Para análisis de microscopía electrónica, una gota (10 µL) de suspensión de Au@AgNPs se depositó en una rejilla de carbono gruesa de 300 mallas, se secó a temperatura ambiente y se colocó en una cámara de vacío durante 24 h.

Las nanopartículas se analizaron por MET en aparato Jeol 2010F (resolución 1,9 Å) a 200 kV. El análisis EDS se realizó usando un espectrómetro de rayos X QUANTAX 200-TEM (Bruker) con detector XFlash 4010. Para análisis HRTEM, las micrografías MET se registraron en magnificaciones mayores a 100 000X. Los espaciados interplanares de planos cristalinos se determinaron por análisis de micrografía digital (3.0 Gatan Version). La preparación de muestra fue similar a la descrita arriba para análisis STEM.

Los datos se recopilaron usando un sistema difractómetro Bruker D8 QUEST equipado con monocromador de espejos multicapa y tubo sellado de microfoco Cu Kα (λ = 1,54178 Å). Los frames se recopilaron a T = 300 K vía barridos ω/φ y luego se procesaron para obtener difractogramas de Intensidad vs 2Theta. El software High Score Plus se usó para tratamiento de datos brutos y la base de datos de difracción de polvos ICSD asociada con el software se implementó para análisis de identificación de fase search-match.

Ensayo de actividad antibacteriana

Los microorganismos probados fueron bacterias Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 5538P) y levadura Candida albicans aislada de orina infectada recolectada de un paciente adulto masculino con infección del tracto urinario (nuestro estudio sigue los principios de la Declaración de Helsinki). Caldo Brain Heart Infusion (BHI) y Caldo Dextrosa de Papa (PDB) se usaron para preparar inóculo de bacterias y levadura, respectivamente. Los cultivos se incubaron a 37 °C durante la noche. La concentración en unidades formadoras de colonias (UFC/mL) por mililitro de suspensión se determinó midiendo la densidad óptica por UV-Vis a 540 nm para bacterias, 600 nm para levadura. Suspensiones que contenían 4 × 10⁸, 7,8 × 10⁸ y 2,5 × 10⁶ UFC/mL se usaron para E. coli, S. aureus y C. albicans, respectivamente. La actividad antimicrobiana se probó en placas de 96 pocillos, usando medio de cultivo líquido añadido con nanopartículas y microorganismo a 37 °C. Todas las pruebas se realizaron por triplicado. La absorbancia se midió en un lector de placas multimodo Synergy HTX Biotek, usando software Gen 5. Todas las curvas de crecimiento microbiano se realizaron usando software Origin Lab 8.0. Como primer paso, 70 µL de medio de cultivo fresco (BHI o PDB, según microorganismos estudiados) mezclado con nanopartículas a la concentración requerida se añadieron a los pocillos. Luego, 30 µL de suspensión de microorganismo se añadieron a los pocillos y homogeneizaron con el medio. El volumen final en cada pocillo fue 100 µL. Tras dispensar el inóculo, las placas de 96 pocillos se leyeron en el espectrofotómetro descrito. Las placas se mantuvieron a 37 °C durante 24 h, con agitación circular antes de cada lectura con un período de 15 min cada una. La tasa de crecimiento de microorganismos se determinó por medición de densidad óptica (DO) en la longitud de onda mencionada.

Curvas de crecimiento analizadas por el modelo de Gompertz

Es bien conocido en la literatura que el modelo de crecimiento de Gompertz describe bien el crecimiento de poblaciones de microorganismos. Este modelo nos permite entender dos parámetros críticos en la descripción del crecimiento de la población de microorganismos: la fase adaptativa (fase de latencia) y la tasa de crecimiento de la población. En particular, estudiar el comportamiento de la fase de latencia en tratamientos inhibitorios de microorganismos es relevante porque proporciona información sobre las respuestas adaptativas del microorganismo al tratamiento e incluso puede dar indicaciones sobre el desarrollo de resistencia del microorganismo al tratamiento evaluado [69].

El modelo de Gompertz modificado ha sido descrito por Zwietering et al. [70] y adaptado por Li et al. [69] y otros autores [71,72,73,74,75,76,77,78] como un modelo que ajusta las curvas de crecimiento y

y = A exp{-exp[(μe/A)(λ - t) + 1]} (2)

donde A es el número de células expresado como DO₅₄₀ (S. aureus y E. coli) y DO₆₀₀ (C. albicans), μ es la tasa de crecimiento en la fase exponencial y e es la exponencial e¹, λ es la fase de latencia. Hemos ajustado nuestra cinética de crecimiento usando software Origin 9.1 para analizar los efectos sobre S. aureus, E. coli y C. albicans de los tres agentes AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs.

Efecto de nanopartículas sobre el crecimiento de E. coli, S. aureus y C. albicans

Escherichia coli y Staphylococcus aureus se inocularon en medio BHI, y C. albicans se inoculó en caldo PD. Todos los cultivos se incubaron durante la noche a 36 °C. Tras la incubación, los tres cultivos se ajustaron a absorbancia de 1, 0,7 y 1, respectivamente (λ = 540 nm). AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs se ajustaron a una concentración de 50 µg/mL. En una placa de 96 micropocillos, los cultivos ajustados se expusieron a nanopartículas en una relación 7:3, alcanzando un volumen final de 200 µL cada micropocillo. También, los cultivos ajustados se expusieron a agua esterilizada como condición de control en las mismas condiciones descritas anteriormente. Otros controles usados para este experimento fueron medio fresco y cada solución de nanopartículas sin microorganismos. Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans se expusieron a AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs, respectivamente. La placa de micropocillos se incubó a 36 °C, y se obtuvo una muestra de cada microorganismo en condiciones de tratamiento y control a 1, 7, 13 y 19 h. Las muestras recolectadas se diluyeron en serie 1:10 en solución salina y se extendieron sobre la superficie de placas Müeller-Hinton. Las placas inoculadas se incubaron a 36 °C durante 24 h. Tras la incubación, las UFC/mL se calcularon usando conteo directo.

Determinación de la Concentración Bactericida Mínima (CBM)

Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans se inocularon cada uno en caldo Müeller-Hinton incubado durante la noche a 36 °C y ajustados a 0,5 Nefelómetro McFarland. Una vez ajustados los inóculos para determinación de concentración inhibitoria mínima (CIM), se realizó una prueba de microdilución. Brevemente, se usó una placa de 96 pocillos para este propósito. 160 µL de un cultivo ajustado de cada microorganismo se vertieron en 5 pocillos. Se prepararon soluciones de AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs de 1000 µg/mL. Las soluciones previas se usaron para preparar soluciones de 750, 500 y 250 µg/mL. Agua esterilizada pura se usó como 0 µg/mL de nanopartículas, y 40 µL de cada solución previa se añadieron a 160 µL de cultivos ajustados. De esta manera, cada cultivo se expuso a una concentración final de 200, 150, 100, 50 y 0 µg/mL de cada nanopartícula probada. La microplaca se incubó a 36 °C durante 24 h. Tras eso, una muestra de cada pocillo se inoculó en una superficie de Müeller-Hinton e incubó en las mismas condiciones descritas anteriormente. Tras la incubación, las placas Müeller-Hinton se observaron buscando cualquier señal de crecimiento. La concentración donde no se observaron señales de crecimiento se registró como valor CBM.

Resultados y Discusiones

Caracterización

La Figura 1a muestra los espectros de absorción UV-vis de los nanomateriales sintetizados. Las absorbancias se han normalizado para el máximo de resonancia de plasmon de superficie localizada (RPSL) correspondiente a cada sistema de nanopartículas.

El espectro de absorción de Au@AgNPs en Fig. 1a tiene una sola banda centrada en 474 nm, que se encuentra entre la RPSL de AgNPs (445 nm) y la RPSL de AuNPs (544 nm). La ausencia de un pico de absorción tipo oro en Au@AgNPs sugiere que los nanomateriales obtenidos por síntesis secuencial son estructuras core@shell. No es posible detectar ninguna banda de absorción asociada con Au que pertenezca al núcleo. Algunos autores asumen que para sistemas core@shell, los espectros de absorción están compuestos por dos bandas asociadas con cada uno de los metales para grosores de capa entre 3 y 4 nm. La absorción asociada con el núcleo metálico desaparece para mayores grosores, obteniendo una sola banda de absorción donde la ubicación del máximo depende de la relación grosor/tamaño del núcleo de la partícula bimetálica [79, 80].

Samal et al. [81] sintetizaron nanopartículas core@shell (Au@Ag) controlando los tamaños de núcleos y añadiendo capas de diferentes grosores. En particular, nuestro resultado UV-vis para Au@AgNPs coincide con el reportado por Samal et al. para núcleos de oro de 32 nm y grosor de plata mayor a 15 nm, donde los espectros se caracterizan por una sola banda de absorción (~450 nm) y se observa la supresión de plasmones de superficie de Au.

Adicionalmente, en Fig. 1a, absorción centrada en 280 nm (región resaltada en azul) puede observarse, correspondiente a moléculas del extracto de Rumex hymenosepalus usado como agente reductor en nuestra síntesis de nanopartículas. Archivo adicional 1: Figura S1 corresponde al espectro de absorción de solución acuosa de Rumex hymenosepalus. Se observa una banda característica centrada en 278 nm, asociada con transiciones electrónicas de anillos aromáticos conjugados con grupos carbonilo de compuestos polifenólicos [82]. Esta banda de absorción en los espectros UV-Vis de nanopartículas indica que los productos finales contienen moléculas del extracto que permanecen en ellos. Rivero-Cruz et al. han reportado cuatro estilbenoides, dos flan-3-oles y tres antraquinonas aislados de R. hymenosepalus [83] y Rodríguez-León et al. han realizado un estudio de resonancia magnética nuclear para determinar que Rumex hymenosepalus contiene moléculas importantes como glicósido de estilbeno y epicatequina galato y epigalocatequina galato [61]. Estas moléculas participan como agentes reductores en la síntesis de nanopartículas. El proceso involucra la desprotonación de algunos grupos -OH de anillos fenólicos para formar grupos =CO. Las moléculas polifenólicas se oxidan y los electrones liberados se transfieren a iones Ag⁺ y Ag³⁺ para formar Au⁰ y Ag⁰.

La Figura 1b muestra los valores de potencial zeta correspondientes a AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs en concentraciones de 1, 10, 50 y 100 µg/mL. Las nanopartículas están dispersas en agua ultrapura y la medición se realizó por triplicado a 25 ℃. En general, a lo largo del rango de concentración, las nanopartículas exhiben valores de potencial zeta más negativos que -30 mV, alcanzando valores de -40 mV a una concentración de 100 µg/mL para AuNPs y Au@AgNPs y -38 mV para AgNPs. Estos valores altamente negativos de potencial zeta indican que las nanopartículas experimentan interacciones repulsivas entre ellas que previenen su agregación y permiten la estabilidad a largo plazo de coloides metálicos [84,85,86]. Correlacionando los resultados de espectroscopía UV-Vis con los valores de potencial zeta obtenidos, podemos establecer que los valores altamente negativos pueden deberse al complejamiento de moléculas polifenólicas del extracto sobre la superficie de la nanopartícula [87].

Para aplicaciones biológicas, es valioso obtener población de nanopartículas con tamaños monodispersos [88], por lo que la Fig. 1c y d muestra los valores DDL correspondientes a diámetro medio e índice de polidispersidad (PDI) para AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs en concentraciones de 1, 10, 50 y 100 µg/mL. El diámetro medio de Au@AgNPs es alrededor de 250 nm y se mantiene constante en función de la concentración, de manera similar para nanopartículas monometálicas con diámetro medio alrededor de 122 y 135 nm para AuNPs y AgNPs, respectivamente. En el mismo caso se observa que valores PDI es alrededor de 0,3 para nanopartículas monometálicas y 0,2 para Au@AgNPs. Estos resultados, donde los tamaños no varían con la concentración, indican que los diferentes sistemas de nanopartículas tienen buena estabilidad presentando una polidispersidad moderada de tamaños (0,3 ≥ PDI ≥ 0,2).

La banda prohibida óptica del gráfico de Tauc se calculó (Archivo adicional 1: Figura S2). La banda de conducción por materiales semiconductores tienen valores Eg < 3 eV, como referencia el germanio tiene Eg < 0,7 eV y el silicio es Eg = 1,1 eV [89]. En nuestro caso, la banda prohibida para Au@AgNPs, AuNPs y AgNPs es 1,93 eV, 2,03 eV y 2,33 eV, respectivamente. Esto significa que estos materiales se consideran como semiconductores, y esta característica se obtuvo por efectos de confinamiento cuántico que producen un aumento en la brecha de energía, por lo que los nanomateriales pueden usarse como sensores, baterías y dispositivos optoelectrónicos [64].

Para establecer si compuestos orgánicos están presentes en nanopartículas, estos nanomateriales se caracterizaron por XPS y FTIR. La Figura 2a muestra los espectros de sondeo del extracto de planta y nanopartículas. Como se puede ver, todos los sistemas de nanopartículas presentan las señales características asociadas con los elementos carbono (C 1s, 284,6 eV) y oxígeno (O 1s, 532,2 eV) del extracto de Rumex hymenosepalus. Este resultado confirma que moléculas orgánicas del extracto están presentes en nanomateriales obtenidos. Adicionalmente, se obtuvieron espectros XPS de alta resolución para analizar los estados de oxidación de plata y oro en las nanopartículas (Archivo adicional 1: Figura S3). Para AgNPs (Archivo adicional 1: Figura S3A), las señales en energías de enlace de 373,76 eV y 367,76 eV (ΔBE = 6,0 eV) correspondientes a la línea espectral 3d3/2 y 3d5/2 pueden asociarse con Ag⁰ (plata metálica). Para AuNPs (Archivo adicional 1: Figura S3B), el pico asociado con acoplamiento spin-orbital 4f5/2 está ubicado en energía de enlace 87,65 eV. Para 4f7/2, pico de acoplamiento spin-orbital está ubicado en 83,98 eV. La relación de intensidades (I4f7/2 > I4f5/2), ubicación y separación entre picos (ΔBE = 3,67 eV) confirman que iones de oro (Au³⁺) se reducen completamente a oro metálico Au⁰ [90]. Para Au@AgNPs, los espectros XPS de alta resolución correspondientes a plata y oro se muestran en Archivo adicional 1: Figura S3C y Figura S3-D, respectivamente. Estos espectros muestran el mismo comportamiento que sus contrapartes monometálicas. Esto indica que tanto la plata como el oro son de valencia cero en la presentación core@shell.

FTIR en Fig. 2e muestra a 3296 cm⁻¹ grupos hidroxilo, 2974 cm⁻¹ (C-H) enlace del anillo aromático, 1689 cm⁻¹ asociado con estiramiento de grupo carbonilo (C=O), y 1689-1400 cm⁻¹ debido a enlace carboxilato (C-O) y estiramiento de enlace carbono-carbono y 1212 cm⁻¹ asociado con estiramiento C-O de fenol conjugado con AuNPs, 1049 cm⁻¹ modo de estiramiento C-O del grupo éster de catequina [88,89,90] y 799 cm⁻¹ la flexión fuera del plano en el fenol, flexión C-H reportada en 964,4 y 829,39 cm⁻¹ característica de resveratrol [91] desplazada en extracto Rh a 1031 y 867 cm⁻¹, respectivamente, y AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs también se desplazan lo que es indicativo de complejación de moléculas polifenólicas de extracto Rh con nanopartículas.

La Figura 3a corresponde a una micrografía STEM de campo claro representativa del sistema Au@AgNPs a baja magnificación (barra de escala 100 nm). Se puede ver un conjunto de nanopartículas sin aglomeración y con geometría principalmente cuasi-esférica. La misma región se muestra en campo oscuro (HAADF) en Fig. 3b, y la estructura core@shell puede observarse, donde podemos distinguir el núcleo Au se ve más intenso que la capa Ag, debido a la diferencia en número atómico. La Figura 3c y d corresponde a micrografía STEM de mayor magnificación (barra de escala 20 nm) de un grupo de nanopartículas del sistema core@shell en campo claro y oscuro, respectivamente. Se puede apreciar con claridad el brillante núcleo Au y la capa Ag ligeramente contrastada. Estas imágenes muestran que el grosor de la capa Ag varía entre 3 y 5 nm. Archivo adicional 1: Figura S4 corresponde a una galería de imágenes individuales donde se puede observar uniformidad de la capa Ag.

La Figura 4a, c y e corresponde a micrografía MET de sistemas representativos de nanopartículas AuNPs, AgNPs y Au@AgNPs, respectivamente. En todos los casos, las nanopartículas tienen morfología tipo esfera y se muestran bien separadas entre sí. Esto puede explicarse por las moléculas del extracto sobre las superficies de nanopartículas, actuando como espaciadores entre ellas. La Figura 4b, d y f muestra histogramas correspondientes a distribución de tamaño obtenida por MET y realizada con 500 nanopartículas recolectadas de 15 a 20 micrografías para cada nanomaterial. El histograma presenta distribución gaussiana con tamaño medio de 24 ± 4 nm (AuNPs), 13 ± 3 nm (AgNPs) y 36 ± 11 nm (Au@AgNPs). La discrepancia en valores entre mediciones DDL y MET con gráfico de distribución de tamaño se debe a condiciones microambientales alrededor de las nanopartículas, mientras DDL muestra un diámetro para un sistema que incluye metal, recubrimiento hidratado y disolvente, por comparación en mediciones MET es un sistema seco donde la medición es solo sobre metal, en particular, en DDL las moléculas usadas para complejación de nanopartículas (agentes reductores y estabilizadores) son dispersantes que inducen errores en medición de tamaño y desplazan sus resultados a valores mayores [91].

La Figura 5 corresponde a las micrografías HAADF-STEM de Au@AgNPs. Una sola nanopartícula se muestra en Fig. 5a con un núcleo de oro y cubierta de plata perfectamente delimitada, el número atómico (Z) cambia a través de la interfaz Au@Ag, las variaciones de intensidad pueden cuantificarse por HAADF-STEM [67].

La región del cuadrado rojo se amplifica para obtener una micrografía HRTEM de la porción de la capa (Fig. 5b), y luego para verificar la estructura cristalina de la capa, la región periférica de la nanopartícula se analizó (cuadrado discontinuado) con el software Digital Micrograph 3.0 (Gatan). Se obtuvo la imagen de Transformada Rápida de Fourier (FFT) del área seleccionada (Fig. 5c). Usando la Transformada Rápida de Fourier Inversa fue posible estimar distancias interplanares de 2,3 Å, 2,0 Å y 1,4 Å en Fig. 5d. Estas distancias pueden asignarse, respectivamente, a los planos cristalinos (111), (200) y (220) de plata cúbica centrada en caras (fcc) según la Base de Datos de Estructura Cristalina Inorgánica (ICSD) en el Instituto FIZ Karlsruhe-Leibniz para Infraestructura de Información, Alemania o el software de cristalografía electrónica Jems (V 4-5430, JEMS-SAAS, Suiza) [92]. Un análisis similar de estructura cristalina por HRTEM se realizó para nanopartículas monometálicas como se ilustra en Archivo adicional 1: Figuras S5 (para AuNPs) y S6 (AgNPs). En ambos casos, la estructura cristalina corresponde a cúbica centrada en caras (fcc).

El análisis químico EDS muestra la presencia de ambos metales para un grupo de Au@AgNPs bimetálicas observadas por MET (Fig. 6a) en proporciones del porcentaje atómico en peso 77 % de Ag (capa) y 23 % de Au (núcleos) (Fig. 6b). En comparación, una sola bimetálica (Fig. 6c) Au@AgNPs tiene proporciones alrededor de 80 % de Ag (capa) y 20 % de Au (núcleo) (Fig. 6d). Para estimar el porcentaje atómico de oro y plata en nanopartículas core@shell (Au@Ag), se consideró una aproximación de geometría cuasi-esférica de la morfología de nanopartículas. El diámetro promedio de AuNPs obtenido de la distribución de tamaño por MET (D̄_Au = 24 nm) se usó para estimación del volumen del núcleo (V_Au), y el diámetro promedio de Au@AgNPs (D̄_Au@Ag = 36 nm) para estimación del volumen core@shell (V_Au@Ag). Así, el volumen de la capa se determina como V_Ag = V_Au@Ag - V_Au. El contenido atómico total de Au y Ag se calculó considerando una estructura cristalina fcc (4 átomos por celda unitaria) para ambos metales donde los parámetros de red de Au y Ag son 4,0783 Å y 4,0862 Å, respectivamente [93]. La estimación de contenido atómico por este procedimiento es 70 % para Ag (Capa) y 30 % Au (Núcleo), lo que difiere en 10 % respecto a la medición obtenida por EDS. La Figura 7 muestra una estimación teórica del contenido de plata y oro y cómo varía al aumentar el grosor de la capa manteniendo constante el tamaño del núcleo (D̄_Au = 24 nm). Se observa que para Au@AgNPs con diámetro mayor a 30,2 nm, el contenido atómico de plata supera el contenido de oro. En Material Suplementario, se realiza una descripción detallada del cálculo para obtener porcentajes de contenidos atómicos. Estimaciones similares de porcentajes atómicos se realizaron considerando otros diámetros de núcleo Au y variando el diámetro de Au@AgNPs (Archivo adicional 1: Figura S7A-B).

La Figura 8 corresponde a los patrones de DRX para AuNPs y AgNPs así como Au@AgNPs bimetálicas. Todos los productos sintetizados tienen estructura cristalina fcc como se reportó previamente en la caracterización por microscopía electrónica. Los picos para Au@AgNPs están ubicados en ángulos de difracción 2θ de 38,25°, 44,4°, 64,9°, 77,85° y 81,25°. Como se puede apreciar en la figura, los picos de difracción de AgNPs y AuNPs se encuentran en las mismas posiciones mencionadas con una diferencia de ±0,5°. Esto es porque Au y Ag tienen constantes de red muy similares, por lo que sus patrones de difracción para estructura cristalina fcc son casi idénticos [94,95,96]. De esta manera, los picos de difracción en Fig. 8 se asignan, respectivamente, a los planos cristalinos (111), (200), (220), (311) y (222) de la estructura fcc de oro y plata por JCPDS: 4-0783 y 4-0784 [97].

Actividad antimicrobiana

Materiales monometálicos (AgNPs, AuNPs) y bimetálicos (Au@AgNPs) se probaron en cuatro concentraciones diferentes: 1, 10, 50 y 100 µg/mL. Los microorganismos seleccionados para evaluar la actividad antimicrobiana fueron levadura Candida albicans, bacterias Gram-positivas S. aureus y bacterias Gram-negativas E. coli. Las curvas de cinética de crecimiento en un lapso de 24 h se muestran en Fig. 9.

Candida albicans

AuNPs no muestran efecto en la cinética de crecimiento hasta 10 h (Fig. 9a), variando de manera dependiente de la dosis la absorbancia alcanzada a 24 h. Interesantemente, con 50 µg/mL o más, la cinética de crecimiento muestra una pendiente negativa pronunciada desde 10 h hasta alcanzar una reducción del 45 % a 24 h, lo que sugiere un efecto antifúngico de estos materiales. Esto puede atribuirse a la capacidad de las nanopartículas de oro para interactuar con proteínas relevantes presentes en hongos como H⁺-ATPasa, afectando la actividad de la bomba de protones. Esto atrofia la capacidad de la levadura para incorporar nutrientes causando su muerte [61]. En Fig. 9b y c se observó que AgNPs y Au@AgNPs inhiben el crecimiento de la levadura Candida albicans desde 10 µg/mL. La determinación de la concentración CIM₅₀ para ambos materiales se estimó a partir de la curva dosis-respuesta mostrada en Archivo adicional 1: Figura S8. CIM₅₀ se define como la concentración de nanopartículas que produce una disminución del 50 % en absorbancia respecto al control (levadura sin tratamiento). Para AgNPs y Au@AgNPs, CIM₅₀ fueron 2,21 µg/mL y 2,37 µg/mL, respectivamente.

Sin embargo, según los resultados EDS (Fig. 9b), el contenido de plata en Au@AgNPs es 64,85 % en masa. Así, la concentración de plata en Au@AgNPs para CIM₅₀ es 1,53 µg/mL, 30 % menor que en el caso de AgNPs. Padmos et al. han demostrado que las nanopartículas de plata poseen importantes características antibacterianas, pero son citotóxicas para células de mamíferos; este efecto se ha reducido usando nanopartículas bimetálicas, especialmente usando oro en el núcleo de nanopartículas bimetálicas [35].

Escherichia coli

En Fig. 9d, AuNPs no muestran inhibición significativa (< 15 %) ni afectan la cinética de crecimiento de E. coli. Para AgNPs (Fig. 9e) en concentraciones bajas, la fase de latencia permanece inalterada, pero hay una marcada disminución en la razón de crecimiento indicada por el decremento de la pendiente. A 50 µg/mL, la fase de latencia dura hasta 16 h y la viabilidad alcanza un máximo de 20 % a 24 h. Para 100 µg/mL, no se observa un desprendimiento aparente de la fase de crecimiento del microorganismo. En Au@AgNPs (Fig. 9f), las dos primeras concentraciones no muestran cambios en su fase de crecimiento, pero se observa un retraso de fase de hasta 2 h comparado con el control. Es interesante notar que la fase de latencia dura hasta 21 h para la concentración de 50 µg/mL, finalmente no hay comportamiento de crecimiento explícito para la concentración de 100 µg/mL.

Staphylococcus aureus

Un análisis comparativo de regeneración de fase de latencia ocurrió después de 12 h para Au (Fig. 9g), Ag (Fig. 9h) y Au@AgNPs (Fig. 9i) en el caso de S. aureus a 50 µg/mL. Para la concentración más alta a 100 µg/mL, no hay crecimiento de la bacteria. Adicionalmente, observamos cambios en la pendiente respecto al control para Au, Ag y Au@AgNPs a 1 y 10 µg/mL.

La interacción de AuNPs con estas bacterias Gram-positivas podría deberse a la superficie cargada que causa una interacción electrostática, desestabilizando la estructura de la membrana. Resultados similares, pero con concentraciones mayores de NPs, se reportan para AuNPs sintetizados usando extracto de fruta Ananas comosus como agente reductor [98] y proteína de alga verde-azul Spirulina platensis [99]. Yang et al. muestran CIM > 500 µg/mL para S. aureus (CMCC(B)26003), nuestros AuNPs han mostrado inhibición con 10 veces menos concentración; en este caso, existe una sinergia crítica con moléculas de polifenoles en el recubrimiento y estabilización de la superficie de la nanopartícula [100]. ROS se genera de menor a mayor intensidad [101] por AuNPs, polifenoles (extractos de plantas) y AgNPs, por lo que AuNPs en sinergia con resveratrol y epigalocatequina galato (EGCG) promueven respuesta antibacteriana sobre S. aureus [102] que tuvo el mecanismo más factible en este caso. Penders et al. reportaron 250 y 500 µg/mL de AuNPs como agentes antibacterianos sobre S. aureus aumentan el tiempo de latencia de crecimiento bacteriano y efecto antibacteriano [61, 98, 99].

Creemos que la inhibición es causada por AgNPs [103] acumulación y difusión en bacterias relacionada con cargas superficiales de NPs que promueven interacciones electrostáticas [104] con la membrana de la bacteria conduciendo a mayor penetración y daño. Pensamos que este es un mecanismo similar descrito para interacciones entre biopelículas de E. coli y AgNPs [105].

Para Au@AgNPs, los resultados obtenidos son comparables a los reportados por otros grupos de trabajo [100, 101]; sin embargo, diferentes autores sugieren que la inhibición del crecimiento de los microorganismos está directamente relacionada con el grosor de la capa [100, 101]. NPs core-shell mostraron baja citotoxicidad cuando se probaron en células fibroblastos NIH-3T3 (células de mamíferos normales) [35]. Una menor proporción de plata en la capa de Au@AgNPs muestra resultados similares a AgNPs [100], y el núcleo Au potencializa el efecto antibacteriano y minimiza la citotoxicidad.

Curvas de crecimiento analizadas por el modelo de Gompertz modificado

Para saber cómo las razones de crecimiento (µ) y fase de latencia (λ) se modifican cuantitativamente, las curvas de crecimiento de microorganismos expuestos a diferentes concentraciones de nanomateriales (Fig. 10) se ajustaron por el modelo de Gompertz (Ec. 2).

En Fig. 10a, se puede ver que todos los nanomateriales producen una disminución en la tasa de replicación de poblaciones de S. aureus cuando la concentración de nanopartículas aumenta. Este efecto resulta en sensibilidad ligeramente mayor para AuNPs. A una concentración de 50 µg/mL, la razón de crecimiento es solo 30 % respecto al control (Archivo adicional 1: Tablas S1-S24); a una concentración de 100 µg/mL, todos los materiales inhiben el crecimiento de la población de S. aureus. El comportamiento de la fase adaptativa para S. aureus con los diferentes tratamientos se muestra en Fig. 10b. Se observa que no hay diferencias significativas en el material usado, y a 50 µg/mL, la fase de latencia ha aumentado casi 5 veces comparado con la fase adaptativa de S. aureus (Archivo adicional 1: Tablas S1-S24). En general, podemos establecer que los diferentes nanomateriales evaluados en S. aureus reducen la tasa de replicación y posponen la fase adaptativa de manera dependiente de la dosis hasta su inhibición a 100 µg/mL.

La Figura 10c muestra claramente que AuNPs no afectan la razón de crecimiento µ de bacterias E. coli. Mientras tanto, AgNPs producen una disminución sobre µ, alcanzando un valor mínimo correspondiente al 19 % del control (µ para E. coli sin tratamiento) para 50 µg/mL (ver Archivo adicional 1: Tabla S52). En contraste, Au@AgNPs inhiben completamente el crecimiento de E. coli a 100 µg/mL. El análisis del comportamiento de la fase de latencia de E. coli expuesta a diferentes materiales se muestra en Fig. 10d. En este caso, a diferencia de Fig. 10b, cada material tiene una respuesta característica. Así, AuNPs no generan ninguna modificación en la fase adaptativa de E. coli, mientras AgNPs y Au@AgNPs tienen un efecto dependiente de la dosis en la fase de latencia, destacando este último material. Así, podemos establecer que AuNPs no tienen efecto apreciable en bacterias E. coli, y Au@AgNPs pueden inhibir la replicación y, por tanto, posponer indefinidamente la fase de latencia de E. coli. Interesantemente, este efecto no se logra para AgNPs aunque el contenido neto de plata es mayor que en Au@AgNPs. Esto sugiere que la presentación core@shell de ambos metales produce una sinergia que favorece la actividad antimicrobiana. Feng et al. han reportado un fenómeno de compensación electrónica de Au a Ag en estructuras core-shell y aleación, que derivan en aumento de la citotoxicidad de nanopartículas pero mantienen las propiedades antibacterianas, lo que significa que se asume una sinergia entre Au y Ag, debido a las diferencias observadas entre materiales monometálicos y bimetálicos [106], pero se necesita más investigación.

La Figura 11 muestra los resultados del estudio de conteo directo de colonias de microorganismos expuestos a nanomateriales. En general, el comportamiento de las poblaciones de microorganismos reproduce los resultados obtenidos del estudio de cinética de crecimiento (Fig. 7a, e, i). Por ejemplo, en Fig. 11a, la población de microorganismos (representada logarítmicamente) disminuye significativamente solo a 19 h donde AuNPs han matado 92 % de C. albicans. Interesantemente, para nanopartículas que contienen plata (Fig. 11b, c) se observa un declive poblacional más pronunciado. El sistema Au@AgNPs a 50 µg/mL inhibe casi completamente S. aureus a 7 h (99,5 % de bacterias muertas) aunque el microorganismo reactiva su crecimiento para tiempos posteriores. La determinación de CBM no fue posible obtener para concentraciones probadas (Archivo adicional 1: Figura S9-11), según observación experimental se requieren concentraciones mayores para mostrar este efecto. Sin embargo, para C. albicans, AgNPs mostró un valor CBM de 50 µg/mL (Archivo adicional 1: Tabla S55).

Conclusiones

Por primera vez, se reporta la producción de nanopartículas de oro y core@shell (Au@Ag) usando extracto de raíz de Rumex hymenosepalus como agente reductor. Para obtener Au@AgNPs se propone un método secuencial de dos pasos que produce partículas con polidispersidad moderada y capa de plata homogénea. La determinación de las curvas de crecimiento y sus parámetros obtenidos a través del modelo de Gompertz indican diferentes efectos de los nanomateriales en los microorganismos evaluados. Los efectos inhibitorios de AuNPs sobre S. aureus se alcanzan a una concentración 5 veces menor a la reportada para otras AuNPs sintetizadas por diferentes procesos. Esto revela la importancia del proceso de síntesis seguido y el entorno en la superficie de las nanopartículas. Por otro lado, AgNPs y Au@AgNPs producen un gran crecimiento de la fase de latencia (> 12 h). Sin embargo, las bacterias pueden adaptar e iniciar su crecimiento en estas concentraciones sub-inhibitorias con el consiguiente riesgo de generar resistencia a estos nanomateriales. Esto destaca la importancia de realizar estudios de cinética de crecimiento que cubran un período apropiado para descartar un crecimiento retardado. Interesantemente, el análisis de Gompertz indica que Au@AgNPs presentan un efecto mayor en la cinética de crecimiento de microorganismos que el mostrado por nanopartículas monometálicas, lo que puede atribuirse a un efecto sinérgico de ambos metales en la estructura core@shell. Los efectos bactericidas solo se logran en C. albicans expuesto a AgNPs. Más experimentos deben realizarse en rangos de concentración mayores de estos nanomateriales (> 200 µg/mL) para determinar su CBM en los microorganismos estudiados.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están incluidos en este artículo y su archivo de información suplementaria.

Abreviaturas

AuNPs:

Nanopartículas de oro

AgNPs:

Nanopartículas de plata

Au@AgNPs:

Nanopartículas bimetálicas oro-plata con estructura core@shell

DLS:

Dispersión dinámica de luz

EDS:

Espectroscopía de rayos X dispersiva en energía

EGCG:

Epigalocatequina galato

FTIR:

Espectrómetro de transformada de Fourier infrarroja

HAADF:

Imágenes de campo oscuro anular de alto ángulo

MBC:

Concentración bactericida mínima

MIC:

Concentración inhibitoria mínima

Rh:

Extracto de raíz de Rumex hymenosepalus

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

STEM:

Microscopio electrónico de transmisión de barrido

UV-Vis:

Espectroscopía ultravioleta-visible

XPS:

Espectroscopía de fotoelectrones de rayos X

XRD:

Difracción de rayos X