Fácil fabricación de microesferas rGO@Fe3O4 para quimio-fototerapia oncológica dirigida magnéticamente y sensible a NIR

Resumen

Se ha demostrado que el grafeno sensible a luz infrarroja cercana (NIR) tiene un efecto prometedor en la terapia de ablación fototérmica del cáncer. En este trabajo, informamos la preparación de microesferas huecas de grafeno decoradas con Fe₃O₄ (rGO@Fe₃O₄) mediante un método sencillo de secado por pulverización y coprecipitación para la quimio-fototerapia combinada dirigida magnéticamente y sensible a NIR. Las microesferas mostraron una superficie específica muy alta (~ 120,7 m² g⁻¹) y un gran volumen de poros (~ 1,012 cm³ g⁻¹), demostrando ventajas distintivas para una alta capacidad de carga de DOX (~ 18,43 %). El efecto fototérmico desencadenado por NIR de las microesferas rGO@Fe₃O₄ respondió de manera reversible e indujo una alta eficiencia de conversión fototérmica. Además, el Fe₃O₄ en las microesferas exhibió una excelente capacidad de dirigido a células tumorales. El tratamiento quimio-fototérmico basado en rGO@Fe₃O₄/DOX mostró una citotoxicidad superior hacia células HeLa in vitro. Nuestros estudios indicaron que las microcápsulas rGO@Fe₃O₄/DOX tienen un gran potencial en el tratamiento combinado de quimio-fototerapia del cáncer.

Introducción

El cáncer es una de las enfermedades más malignas del mundo y una de las principales causas de muerte humana [1, 2]. Aunque la quimioterapia se utiliza comúnmente en el tratamiento clínico del cáncer, varios problemas clave, como la baja eficiencia terapéutica y los extensos efectos secundarios, limitan seriamente su aplicación [3]. Los sistemas de administración de fármacos (DDS) han mostrado grandes ventajas en la mejora de la solubilidad, biodisponibilidad y acumulación tumoral de los fármacos, lo que se espera que mejore prominentemente su eficiencia antitumoral [4]. Recientemente, las microesferas huecas empleadas como sistemas de administración de fármacos han ganado una atención creciente debido a su gran superficie y estructuras porosas abundantes [5,6,7,8], y se han diseñado varios materiales de microesferas huecas con tecnologías innovadoras [9,10,11,12,13].

El óxido de grafeno (GO), un nuevo tipo de material inorgánico libre de metales, ha sido ampliamente investigado en la administración de fármacos debido a sus características únicas, como buena biocompatibilidad, bajo costo y preparación sencilla [14,15,16,17]. Notablemente, el óxido de grafeno puede transformar eficazmente la luz en calor cuando es activado por irradiación NIR [18,19,20], convirtiéndose en una estrategia prometedora para mejorar el efecto de la terapia fototérmica del cáncer. El grupo de Chen informó que el GO podía administrar fármacos anticancerígenos mediante interacciones no covalentes como apilamiento π-π, enlaces de hidrógeno y adsorción electrostática [21]. Sin embargo, la nanoestructura 2D del óxido de grafeno tiende a aglomerarse debido a la gran superficie específica y a los enlaces de van der Waals entre las capas de grafeno [17, 22], lo que resulta en baja solubilidad en agua y disminución de la capacidad de carga de fármacos. Se han explorado algunas estrategias para superar estos inconvenientes. El grupo de Tsukruk desarrolló cápsulas huecas de grafeno usando tecnología de ensamblaje capa por capa [23], que mostraron una carga de fármacos extremadamente alta en comparación con otros materiales de GO. Esto podría atribuirse a la alta superficie específica y al gran volumen de poros de la cápsula hueca estabilizada por GO. Sin embargo, pocos informes se han referido al estudio del GO con una estructura de poros tridimensionalmente conectada para la administración de fármacos.

Aunque muchos sistemas de administración de fármacos reportados han exhibido una capacidad de carga superior y un comportamiento de liberación controlada, su investigación preclínica y aplicaciones también están limitadas debido a una especificidad insuficiente para dirigirse a tejidos tumorales [24]. Entre varios sistemas de administración dirigida, el Fe₃O₄, un material de dirigido magnético, es ampliamente utilizado en la terapia del cáncer por sus altas respuestas magnéticas, calidad estable y fácil obtención [25,26,27,28,29]. El grupo de Ni desarrolló nanopartículas de estructura núcleo-cáscara Fe₃O₄@SiO₂ con propiedad superparamagnética para el dirigido magnético de tumores [30]. Además, las nanopartículas de Fe₃O₄ ancladas en GO han sido bien estudiadas en la combinación de administración dirigida magnética y terapia fototérmica [31,32,33,34].

En el presente estudio, informamos una estrategia avanzada para desarrollar una plataforma DDS que comprende microesferas huecas de rGO decoradas con óxido de hierro (rGO@Fe₃O₄) para la terapia fototérmica (PTT) activada por NIR y dirigida magnéticamente. Como se muestra en el Esquema 1, las microesferas huecas rGO@Fe₃O₄ se prepararon en tres pasos. Primero, se sintetizó rGO-SiO₂ mediante secado por pulverización usando SiO₂ como plantilla y luego se obtuvieron microesferas huecas de rGO eliminando SiO₂ con grabado HF. Posteriormente, se anclaron nanopartículas de Fe₃O₄ sobre las microesferas huecas de rGO para construir microesferas rGO@Fe₃O₄. En este sistema, el rGO sirve como agente PTT activado por NIR, y el Fe₃O₄ puede ofrecer la propiedad de dirigido magnético hacia células HeLa. La doxorrubicina (DOX), encapsulada en microesferas (rGO@Fe₃O₄/DOX) basada en adsorción porosa y apilamiento π-π, se espera que exhiba una capacidad de carga ultrahigh y un comportamiento de liberación sensible al pH, y puede mejorar significativamente el efecto anticancerígeno para la combinación de fototerapia-quimioterapia.

Fácil fabricación de microesferas rGO@Fe3O4 para quimio-fototerapia oncológica dirigida magnéticamente y sensible a NIR

Materiales y Métodos

Materiales

Cloruro férrico hexahidratado (FeCl₃·H₂O), hidróxido de sodio (NaOH) y sulfato ferroso heptahidratado (FeSO₄·7H₂O) fueron adquiridos de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Células HeLa provienen del Hospital Oncológico de Tianjin. Solución salina fosfato amortiguada (PBS), clorhidrato de doxorrubicina (DOX·HCl), medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM), 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y kit de conteo celular-8 (CCK-8) fueron adquiridos de Solarbio Science and Technology Co., Ltd. SiO₂ (~ 300 nm) fue adquirido de Shanghai Yuanjiang Chemical Company. Solución acuosa de óxido de grafeno desionizado (2 mg/ml) fue un producto comercial de Nanjing Xianfeng Company.

Preparación de microesferas rGO@Fe₃O₄

Las microesferas huecas de grafeno se prepararon mediante secado por pulverización usando SiO₂ (300 nm) como plantilla. Brevemente, 100 mL de suspensión de SiO₂ (50 mg mL⁻¹) se gotearon lentamente en 300 mL de solución acuosa de GO (2 mg mL⁻¹) bajo agitación vigorosa, la solución mixta se secó por pulverización a 200 °C en una unidad de secado por pulverización. Posteriormente, el producto se mantuvo a 300 °C bajo protección de Ar durante 2 h y se obtuvo rGO-SiO₂. Para eliminar SiO₂, rGO-SiO₂ se colocó en solución de HF (10 %) durante 48 h a 60 °C. El producto sólido se lavó varias veces y se secó en horno de vacío a 60 °C durante 12 h, obteniéndose finalmente rGO con un rendimiento del 75 %.

Las nanopartículas rGO@Fe₃O₄ se prepararon mediante el método de coprecipitación. En un proceso típico, 0,27 g FeCl₃·H₂O, 0,28 g FeSO₄·7H₂O y 0,1 g microesferas huecas de rGO se disolvieron en 10 mL de agua desionizada y se agitaron durante 30 min a 50 °C. Luego, se agregaron lentamente 60 mL de NaOH (0,15 mol L⁻¹) bajo agitación continua a 50 °C durante 12 h. Los productos se separaron magnéticamente y se lavaron repetidamente con agua desionizada y etanol varias veces, seguido de secado a 60 °C bajo vacío durante 12 h.

Caracterización estructural

El tamaño y morfología de las muestras se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM, Hitachi, S-4800) y microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEM2100F, JEOL). La composición de los productos se analizó mediante difracción de rayos X (XRD, D8 Focus, radiación Cu Ka, Bruker, Alemania) a una velocidad de barrido de 12 °/min en rango de 10 a 80°. También se realizó espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) en un espectrómetro XPS (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, América). Los espectros FTIR (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) se registraron de 500 a 4000 cm⁻¹ a una resolución de 4 cm⁻¹. Las mediciones magnéticas se realizaron usando un dispositivo de interferencia cuántica superconductora (SQUID, Quantum Design MPMS) magnetómetro a temperatura ambiente (300 K). Los espectros Raman se recolectaron usando un espectrómetro Raman (Renishaw, inVia Reflex, Inglaterra) con láser de longitud de onda 532 nm. El contenido de rGO se evaluó usando un analizador termogravimétrico (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600). La superficie específica se midió mediante la técnica Brunauer-Emmett-Teller (BET). Los espectros UV-Vis se registraron usando un analizador de ácidos nucleicos/proteínas Beckman DU 800 (Beck-man Instruments, Inc., Rosemead, CA).

Carga y liberación de DOX

DOX, un fármaco quimioterapéutico modelo, fue encapsulado en los núcleos de rGO@Fe₃O₄ para evaluar los comportamientos de carga y liberación de fármacos anticancerígenos in vitro. rGO@Fe₃O₄/DOX se preparó según referencia previa. Brevemente, 10 mL (0,2 mg mL⁻¹) de solución acuosa de DOX se agregaron a 10 mg de solución rGO@Fe₃O₄, la mezcla se homogeneizó ultrasónicamente para asegurar ninguna precipitación significativa. Luego, la mezcla se equilibró en un agitador reciproco (SK-O180-Pro) a 150 rpm durante 24 h. Después de centrifugación a 6000 rpm durante 10 min, se eliminó DOX no cargado, el sobrenadante de rGO@Fe₃O₄/DOX se midió mediante espectrofotómetro UV-Vis para determinar la cantidad de DOX cargado. La OD de DOX se registró a 490 nm, se usaron las siguientes ecuaciones para calcular la eficiencia de carga (LE) y capacidad de carga (LC) del DOX:

LE = (cantidad total de DOX - DOX libre) / cantidad total de DOX

LC = (cantidad total de DOX - DOX libre) / cantidad de rGO@Fe₃O₄/DOX

Los estudios de liberación in vitro de DOX se realizaron colocando rGO@Fe₃O₄/DOX (10 mg) en una bolsa de diálisis (MWCO = 1000) con solución salina fosfato amortiguada (PBS, 30 mL) a pH 5,4, 6,5 o 7,4, colocándola en baño de agua a 37 °C y agitando a 80 rpm. A intervalos predeterminados, se recolectaron 3 mL del medio de liberación y la cantidad de DOX liberado se calculó midiendo UV-Vis a 480 nm.

Efecto fototérmico activado por NIR de microesferas rGO@Fe₃O₄

Para monitorear la influencia de la dosis de rGO@Fe₃O₄ en el efecto fototérmico activado por NIR, soluciones de rGO@Fe₃O₄ con diferentes concentraciones (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 y 1 mg mL⁻¹) fueron irradiadas con láser NIR a 2 W cm⁻² durante 5 min, respectivamente. Además, se evaluó la influencia de la energía NIR en el efecto fototérmico irradiando rGO@Fe₃O₄ (0,25 mg mL⁻¹) con diferentes potencias (1 W cm⁻², 1,5 W cm⁻², 2 W cm⁻²) durante 5 min. La temperatura en tiempo real se midió usando una cámara térmica infrarroja FLIR I5.

Captación in vitro

Células HeLa se sembraron en platos confocales de 35 mm² a una densidad de 1 × 10⁵ células/pozo. Después de incubar durante 24 h en incubadora (5 % CO₂, 37 °C), se removió el medio y se agregó medio fresco conteniendo microesferas rGO@Fe₃O₄/DOX y rGO@Fe₃O₄/DOX con imán, cultivando por otras 5 h. La concentración de rGO@Fe₃O₄/DOX fue 0,1 mg mL⁻¹. Las células se lavaron tres veces con PBS frío (pH = 7,4) y se fijaron con solución de paraformaldehído al 4 % durante 20 min (CLSM, TCSSP5II, Leica, Ernst-Leitz-Strasse, Alemania).

Ensayos de viabilidad celular

La citotoxicidad de estas microesferas se evaluó mediante ensayo CCK-8 después de tratamiento NIR. Células HeLa se sembraron en placas de 96 pozos (5 × 10³ células/pozo) en 100 μL de medio y se cultivaron en 5 % CO₂ a 37 °C durante 24 h. Para evaluación de biocompatibilidad, se agregó rGO@Fe₃O₄ al pozo con rango de concentración de 0,01 a 0,2 mg mL⁻¹; para grupo de fototerapia única, se agregó rGO@Fe₃O₄ con rango de concentración de 0,01 a 0,2 mg mL⁻¹, aplicando irradiación de luz NIR durante 10 min (2 W cm⁻², 808 nm); para grupo de quimio-fototerapia combinada, se agregó rGO@Fe₃O₄/DOX con rango de concentración de 0,01 a 0,2 mg mL⁻¹, aplicando iluminación NIR durante 10 min (2 W cm⁻², 808 nm). Las células se incubaron posteriormente durante 24 h o 48 h. Después, las células se lavaron con PBS e incubaron en 100 μL medio DMEM conteniendo 10 μL solución CCK-8 durante otros 40 min. La viabilidad se detectó usando lector de microplacas a longitud de onda de 450 nm. Todos los experimentos se realizaron en triplicado.

Resultados y Discusión

Síntesis y caracterización morfológica

La preparación de microesferas rGO@Fe₃O₄ se realizó en tres pasos. Primero, microesferas rGO-SiO₂ se sintetizaron por secado por pulverización usando SiO₂ como plantilla. La morfología de microesferas rGO-SiO₂ se caracterizó por SEM y TEM. Como se muestra en Fig. 1a, las microesferas rGO-SiO₂ con diámetros de 3 μm exhibieron forma esférica uniforme y comprendían muchas nanopartículas de SiO₂ apiñadas (~ 300 nm). Los datos TEM y el diámetro hidrodinámico medido por dispersión dinámica de luz también confirmaron los resultados (Fig. 1d, g). Luego, microesferas huecas de rGO se obtuvieron eliminando SiO₂ de rGO-SiO₂ con calentamiento a 300 °C y grabado HF. Poros obvios con tamaño de poro de ~ 300 nm pudieron observarse debido a la disolución de SiO₂ (Fig. 1b, e). Finalmente, Fe₃O₄ por su capacidad de dirigido magnético fue decorado sobre rGO poroso mediante el método de coprecipitación. La observación SEM y TEM ilustró que se obtuvo una notable disminución del tamaño de poro después de la carga de Fe₃O₄ (Fig. 1c, f), proporcionando factibilidad de administración de fármacos y liberación controlada. Notablemente, el tamaño de partícula y distribución de tamaño hidrodinámico de rGO-SiO₂, rGO, rGO@Fe₃O₄ no tienen cambios visibles durante estos tratamientos (Fig. 1g, h, i).

Caracterización estructural y composicional

Para confirmar la preparación exitosa de rGO@Fe₃O₄, se empleó SEM con EDS para investigar la estructura y composición de las microesferas. Las imágenes EDS de rGO@Fe₃O₄ se caracterizaron visualizando electrones dispersados inelásticamente en ventanas de pérdida de energía para elementos O, Fe y C, y las áreas de diferentes colores representan ubicaciones enriquecidas en O, Fe y C en estructuras reales, respectivamente. Como se muestra en Fig. 2a y b, Fe y O estaban ampliamente distribuidos en microesferas rGO@Fe₃O₄ con alta densidad de carga. La Figura 2d confirmó que las nanopartículas Fe₃O₄ se dispersaron uniformemente en rGO con diámetro de ~ 18 nm, resultando en una disminución aguda del tamaño de poro en microesferas rGO@Fe₃O₄. El patrón de difracción electrónica de área seleccionada (SAED) verificó la presencia de Fe₃O₄ en rGO (Fig. 2e), la resonancia característica en 2,98 nm, 2,53 nm, 2,09 nm, 1,62 nm y 1,49 nm de espaciado facial asignado a los planos 220, 311, 400, 511 y 440 de la fase cúbica centrada en caras de Fe₃O₄, respectivamente. Los picos aparecidos en 220, 311, 400, 511 y 440 correspondientes a Fe₃O₄ también se detectaron en espectros XRD, consistentes con resultados SAED (Fig. 2c). Sin embargo, se reporta que Fe₃O₄ y γ-Fe₂O₃ no pueden distinguirse por patrón XRD independientemente por la misma ubicación de picos característicos [35]. El resultado XPS mostró que los picos predominantes en 725,9/724,5 eV y 714,1/711,0 eV, correspondientes a Fe2p_1/2 y Fe 2p_3/2 de rGO@Fe₃O₄ (Fig. 2g, h), respectivamente, indicando la coexistencia de Fe³⁺ y Fe²⁺ en Fe₃O₄ [36]. El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó para monitorear el comportamiento de degradación térmica de rGO en microesferas rGO@Fe₃O₄ calentando la muestra a 800 °C y enfriando a 100 °C en atmósfera de aire (Fig. 2f). La curva de pérdida de masa mostró dos regiones de pérdida de masa distintas incluyendo la región de deshidratación (40-300 °C) y la región de desvolatilización (300-800 °C) de rGO en rGO@Fe₃O₄, el contenido de carbono calculado de la muestra fue 25,6 % en peso.

Las propiedades magnéticas de microesferas rGO@Fe₃O₄ se investigaron usando un dispositivo de interferencia cuántica superconductora. El campo magnético se realizó con rango de barrido de −20.000 a 20.000 Oe a temperatura ambiente. La Figura 2i muestra el valor de magnetización de saturación (Ms) y campo coercitivo (Hc) de Fe₃O₄ son 66,6 emu g⁻¹ y 9,3 Oe. Tras cargar Fe₃O₄ sobre rGO, los valores Ms y Hc de microesferas rGO@Fe₃O₄ disminuyeron a 33,9 emu g⁻¹ y 7,44 Oe. La notable disminución en saturación magnética puede atribuirse a las propiedades diamagnéticas de rGO en microesferas rGO@Fe₃O₄. Además, la capacidad de aglomeración selectiva de microesferas rGO@Fe₃O₄ se realizó intuitivamente por experimento de separación magnética. Las suspensiones de Fe₃O₄ y microesferas rGO@Fe₃O₄ se colocaron en vial con imán externo durante 2 min, las suspensiones se concentraron al lado del imán y la solución acuosa se volvió transparente. Al retirar el imán, las microesferas rGO@Fe₃O₄ se dispersaron uniformemente de nuevo tras agitación lenta, indicando que microesferas rGO@Fe₃O₄ mantienen la mérito de buena capacidad de dispersión acuosa. La excelente capacidad de dispersión acuosa y propiedad de respuesta magnética allanan el camino para la aplicación de dirigido magnético de rGO@Fe₃O₄ como portadores de fármacos en tratamiento del cáncer.

Análisis del efecto fototérmico

Considerando la mayor penetración en tejidos y menor daño a tejidos circundantes de NIR, la terapia fototérmica sensible a NIR se empleó a menudo para tratamiento tumoral. Por tanto, se registró el comportamiento de transformación fototérmica de soluciones acuosas rGO@Fe₃O₄ a diferentes concentraciones y densidades de potencia bajo irradiación láser NIR a 808 nm durante 5 min. La Figura 3a, b mostró que el aumento de temperatura de rGO@Fe₃O₄ dependía altamente de la concentración y densidad de potencia láser. Cuando la concentración de microesferas alcanzó 1 mg mL⁻¹, la temperatura subió de 27,9 a 70,3 °C bajo irradiación láser NIR durante 5 min a 2 W cm⁻², mientras que la temperatura para grupo PBS solo subió de 31,7 a 36,2 °C. La alta eficiencia de conversión fototérmica de rGO@Fe₃O₄ tendrá gran potencial para terapia fototérmica tumoral según reporte previo de que la degeneración proteica y daño ADN en célula ocurrirán al exponerse a 50 °C durante 4 a 6 min [21, 37]. Para mostrar intuitivamente el comportamiento de transformación fototérmica de rGO@Fe₃O₄, se realizó termografía IR y los resultados se muestran en Fig. 4c. La solución rGO@Fe₃O₄ con concentración de 1 mg mL⁻¹ aumentó rápidamente a 70,3 °C tras irradiación NIR durante 5 min, mientras que el grupo agua no mostró cambios obvios, consistente con resultados de termometría. Además, se estudió la estabilidad fototérmica de rGO@Fe₃O₄ realizando procedimiento láser encendido/apagado con láser 808 nm a 2 W cm⁻² durante seis ciclos (Fig. 3d). Se obtuvo aumento de temperatura idéntico, indicando la perfecta estabilidad fototérmica NIR de compuestos rGO@Fe₃O₄. Estos resultados demostraron que microesferas rGO@Fe₃O₄ tienen gran promesa como agente fototérmico para terapia fototérmica en cáncer.

Carga y liberación de fármaco

La superficie y tamaño de poro de rGO@Fe₃O₄ se evaluaron mediante análisis BET y BJH (Fig. 2a, b). La curva de adsorción-desorción N₂ tipo isotérmico IV, y la superficie y tamaño de poro fueron 120,7 m² g⁻¹, 2-8 nm y 1,012 cm³ g⁻¹, respectivamente. Los resultados mostraron que rGO@Fe₃O₄ poseía canales mesoporosos y distribución promedio de tamaño de poro, exhibiendo gran potencial para carga de fármacos antitumorales. Luego, microesferas rGO@Fe₃O₄ con estructura porosa se usaron para cargar fármaco quimioterapéutico modelo doxorrubicina simplemente mezclando y sonicación ligera. El análisis ATR-FTIR verificó además la incorporación estable de DOX en rGO@Fe₃O₄ debido a la resonancia característica de grupos -COOH y benceno de DOX a 1726 cm⁻¹ y 1618 cm⁻¹ (Fig. 4c). La observación por microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró que las nuevas señales de elementos N asignadas a DOX se distribuyeron uniformemente en microesfera tras carga de DOX (Fig. 4d, e). Además, la eficiencia de carga (LE) y capacidad de carga (LC) de DOX de rGO@Fe₃O₄/DOX fueron 92,15 % y 18,43 %, respectivamente. Los LC notablemente más altos de rGO@Fe₃O₄/DOX que muchos portadores de fármacos pueden atribuirse a superficies extremadamente altas y tamaños de poro [19]. La alta LE de rGO@Fe₃O₄/DOX puede atribuirse a dos aspectos: uno es que rGO@Fe₃O₄ puede interactuar con DOX por fuerte apilamiento π-π entre enlaces π sp2-híbridos de rGO@Fe₃O₄ y porción quinona de DOX [21], y otro puede ser que formen enlaces de hidrógeno entre grupos ácido carboxílico (–COOH), hidroxilo (–OH) de rGO@Fe₃O₄ y grupos amina (–NH₂), hidroxilo (–OH) de DOX. Luego, monitoreamos comportamiento de liberación de DOX en PBS a pH 7,4, 6,5 y 5,4, para imitar entornos extracelulares de tejidos tumorales y normales. Como se indica en Fig. 4f, la tasa de liberación de DOX se aceleró cuando el pH se ajustó de 7,4 a 5,4, y la liberación sostenida de DOX a pH 5,4 alcanzó hasta 73 % tras 98 h tratamiento. Por tanto, el perfil de liberación acumulativa de DOX desde rGO@Fe₃O₄ exhibió manera dependiente de pH. Esta liberación acelerada bajo condiciones ácidas podría deberse a la protonación parcial de grupos hidroxilo y amina de DOX, conduciendo a mayor solubilidad del fármaco y debilitamiento de enlaces de hidrógeno entre DOX y grafeno [38]. Además, también estudiamos el comportamiento de liberación de DOX sensible a NIR in vitro. Como se indica en Fig. 4g, la liberación de DOX se aceleró por radiación NIR y la tasa de liberación de DOX alcanzó hasta 85 %. Este comportamiento sensible a estímulos pH y NIR juega papel importante en administración eficaz de fármacos hacia sitio tumoral.

Captación celular in vitro

Para verificar la capacidad de dirigido magnético de Fe₃O₄ en microesfera rGO@Fe₃O₄, los experimentos de captación celular con o sin tratamiento de campo magnético se investigaron cualitativamente por microscopía confocal de barrido láser (CLSM). Células HeLa se incubaron con rGO@Fe₃O₄/DOX durante 4 h y los núcleos de HeLa se tiñeron con DAPI. Los resultados en Fig. 5 mostraron que el punto negro correspondiente a microesfera rGO@Fe₃O₄ y señales de fluorescencia roja intracelulares obvias asignadas a DOX se observaron en grupo rGO@Fe₃O₄ con tratamiento de campo magnético. En contraste, hubo menos puntos negros y fluorescencia DOX más débil cuando grupo rGO@Fe₃O₄ sin carga de campo magnético. La explicación puede ser que el punto negro atribuido a rGO@Fe₃O₄ internalizado en la célula podría ser promovido por imán. Los resultados indican que Fe₃O₄ en rGO@Fe₃O₄/DOX podría dirigir específicamente células HeLa eficientemente y mejorar significativamente la internalización celular de microesferas, demostrando capacidad favorable de dirigido magnético del sistema de administración de fármacos en terapia del cáncer.

Análisis de citotoxicidad in vitro

La biocompatibilidad de rGO@Fe₃O₄ se evaluó usando ensayo CCK-8 hacia células HeLa. Como se muestra en Fig. 6a, tras incubación con rGO@Fe₃O₄ a amplio rango de concentraciones, la viabilidad celular fue también superior a 90 % incluso a altas concentraciones hasta 200 μg mL⁻¹, los resultados indicaron que rGO@Fe₃O₄ exhibe alta biocompatibilidad y podría servir como plataforma eficiente de administración de fármacos. La eficacia de terapia fototérmica de rGO@Fe₃O₄ se investigó además tras incubación con células HeLa durante 24 h y 48 h bajo irradiación luz NIR (láser NIR 808 nm, 10 min). Como se muestra en Fig. 6b, la fototoxicidad fue claramente dependiente de dosis bajo estimulación NIR, y la viabilidad celular disminuyó de 90,37 a 35,52 % a 24 h, y de 93,77 a 31,75 % a 48 h, implicando que rGO@Fe₃O₄ tenía excelente fototoxicidad y gran promesa en terapia fototérmica. Para estimar la eficacia terapéutica sinérgica de fototerapia-quimioterapia, se estudió la citotoxicidad de rGO@Fe₃O₄/DOX hacia células HeLa con y sin irradiación NIR. Como se muestra en Fig. 6c, d, la viabilidad celular mostró manera dependiente de concentración y controlada por tiempo. Aproximadamente 65 % y 80 % de células HeLa fueron eliminadas por rGO@Fe₃O₄/DOX sin irradiación NIR y DOX a 24 h, la disminución de capacidad tumoricida de rGO@Fe₃O₄/DOX comparado con DOX libre puede deberse al comportamiento de liberación retardada de DOX de microesferas rGO@Fe₃O₄/DOX. Tras irradiación láser NIR (láser NIR 808 nm, 10 min), grupo rGO@Fe₃O₄/DOX con láser eliminó más de 86 % células a dosis equivalente de DOX (30 μg mL⁻¹). Resultados similares se observaron tras mismo tratamiento celular por 48 h, la disminución en viabilidad celular de DOX, rGO@Fe₃O₄/DOX, grupo rGO@Fe₃O₄/DOX con irradiación NIR fue 80 %, 76 % y 90 %, respectivamente, indicando efecto sinérgico de terapia fototérmica y quimioterapia combinadas.

Conclusiones

En resumen, exploramos una estrategia sencilla para construir plataforma de administración de fármacos basada en rGO rGO@Fe₃O₄/DOX para quimio-fototerapia sinérgica. Microesferas rGO@Fe₃O₄/DOX exhibieron excelente efecto PTT activado por NIR y perfecta estabilidad fototérmica NIR. El Fe₃O₄ en las microesferas aseguró excelente capacidad de dirigido a células tumorales. DOX pudo encapsularse en rGO@Fe₃O₄ con capacidad de carga ultrahigh y comportamiento de liberación sensible al pH simultáneamente. Además, se logró una eficiencia antitumorral mejorada cuando combinación de quimioterapia y terapia fototérmica. Por tanto, esta plataforma multifuncional de administración de fármacos podría ser candidato prometedor para dirigido tumoral y terapia combinada del cáncer en el futuro.