Enfoque fácil para preparar microesferas rGO @ Fe3O4 para la terapia combinada quimio-fototérmica magnéticamente dirigida y sensible a NIR

Resumen

Se ha demostrado que el grafeno sensible a la luz del infrarrojo cercano (NIR) tiene un efecto emocionante en la terapia de ablación fototérmica del cáncer. Aquí, informamos sobre la preparación de Fe ₃ O ₄ microesferas huecas de grafeno decoradas (rGO @ Fe ₃ O ₄ ) mediante un sencillo método de secado por pulverización y coprecipitación para la terapia de combinación quimio-fototérmica magnéticamente dirigida y sensible a NIR. Las microesferas mostraron un área de superficie específica muy alta (~ 120,7 m ² g ⁻¹ ) y gran volumen de poros (~ 1.012 cm ³ g ⁻¹ ), lo que demuestra claras ventajas para una alta capacidad de carga de DOX (~ 18,43%). Efecto fototérmico activado por NIR del rGO @ Fe ₃ O ₄ las microesferas respondieron de manera intermitente e indujeron una alta eficiencia de conversión fototérmica. Además, el Fe ₃ O ₄ en las microesferas exhibió una excelente capacidad de direccionamiento de células tumorales. El tratamiento quimio-fototérmico basado en rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX mostró una citotoxicidad superior hacia las células Hela in vitro. Nuestros estudios indicaron que rGO @ Fe ₃ O ₄ / Las microcápsulas de DOX tienen un gran potencial en el tratamiento combinado quimio-fototérmico del cáncer.

Introducción

El cáncer es una de las enfermedades más malignas del mundo y es una de las principales causas de muerte humana [1, 2]. Aunque la quimioterapia se usa comúnmente en el tratamiento clínico del cáncer, varios aspectos clave, incluida la baja eficacia terapéutica y los efectos secundarios importantes, limitan seriamente su aplicación [3]. Los sistemas de administración de fármacos (DDS) han demostrado grandes ventajas para mejorar la solubilidad, la biodisponibilidad y la acumulación de tumores, que se espera que mejoren de forma destacada su eficacia antitumoral [4]. Recientemente, las microesferas huecas que se emplean como sistemas de administración de fármacos han ganado una atención cada vez mayor debido a su gran superficie y abundantes estructuras porosas [5,6,7,8], y se han diseñado varios materiales de microesferas huecas con tecnologías innovadoras [9,10,11 , 12, 13].

El óxido de grafeno (GO), un nuevo tipo de material metálico libre inorgánico, ha sido ampliamente investigado en la administración de fármacos debido a sus características únicas, como buena biocompatibilidad, bajo costo y preparación simple [14, 15, 16, 17]. En particular, el óxido de grafeno puede transformar eficazmente la luz en calor cuando se activa mediante la irradiación NIR [18,19,20], convirtiéndose en una estrategia prometedora para mejorar el efecto de la terapia fototérmica del cáncer. El grupo Chen ha informado que GO podría administrar los medicamentos contra el cáncer por interacción no covalente, como apilamiento π-π, enlaces de hidrógeno y adsorción electrostática [21]. Sin embargo, la nanoplaca de óxido de grafeno 2D tiende a aglomerarse debido a la gran superficie específica, así como a los enlaces de van der Waals entre las capas de grafeno [17, 22], lo que resulta en una escasa solubilidad en agua y una disminución de la capacidad de carga del fármaco. Se han explorado algunas estrategias para superar estas deficiencias. El grupo Tsukruk ha desarrollado cápsulas huecas de grafeno utilizando tecnología de ensamblaje capa por capa [23], que mostró una carga de fármaco extremadamente alta en comparación con otros materiales GO. Esto podría contribuir a la alta área de superficie específica y al gran volumen de poros de la cápsula hueca estabilizada por GO. Sin embargo, pocos informes se han referido al estudio de GO con una estructura de poros conectados en tres dimensiones para la administración de fármacos.

Aunque muchos sistemas de administración de fármacos notificados han mostrado una capacidad superior de carga de fármacos y un comportamiento de liberación controlada de fármacos, su investigación preclínica y sus aplicaciones también están limitadas debido a una especificidad insuficiente para los tejidos tumorales diana [24]. Entre varios sistemas de administración de fármacos objetivo, Fe ₃ O ₄ , un material de diana magnética se usa ampliamente en la terapia del cáncer por sus altas respuestas magnéticas, calidad estable y fácil obtención [25, 26, 27, 28, 29]. Ni group ha desarrollado un Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ nanopartículas de estructura núcleo-capa con propiedad superparamagnética para el direccionamiento magnético de tumores [30]. Además, Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas de GO ancladas se han estudiado bien en combinación de administración de objetivos magnéticos y terapia fototérmica [31,32,33,34].

En el presente estudio, presentamos una estrategia avanzada para el desarrollo de una plataforma DDS que comprende microesferas huecas rGO decoradas con óxido de hierro (rGO @ Fe ₃ O ₄ ) para la terapia fototérmica (PTT) magnéticamente dirigida y activada por NIR. Como se muestra en el Esquema 1, rGO @ Fe ₃ O ₄ Se prepararon microesferas huecas mediante tres pasos. En primer lugar, rGO-SiO ₂ se sintetiza mediante el método de secado por pulverización utilizando SiO ₂ como plantilla y luego se obtuvieron microesferas huecas rGO eliminando SiO ₂ con grabado HF. Luego, Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas se anclaron en microesferas huecas de rGO para construir rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas. En este sistema, rGO se sirve como un agente PTT activado por NIR, y Fe ₃ O ₄ puede ofrecer la propiedad de focalización magnética hacia la célula Hela. Doxorrubicina (DOX), microesferas encapsuladas (rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX) basado en la adsorción de poros y el apilamiento π-π, se espera que muestre una capacidad de carga de fármaco ultra alta y un comportamiento de liberación de fármaco sensible al pH, y pueda mejorar significativamente el efecto anticancerígeno de la combinación de quimioterapia fototérmica.

Ilustración esquemática de rGO @ Fe ₃ O ₄ / Microesferas DOX y la quimioterapia fototérmica combinada para la inhibición de tumores

Materiales y métodos

Materiales

Cloruro de hierro hexahidrato (FeCl ₃ · H ₂ O), hidróxido de sodio (NaOH) y sulfato ferroso heptahidratado (FeSO ₄ · 7H ₂ O) se adquirieron de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Las células Hela son del Tianjin Cancer Hospital. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) _, El clorhidrato de doxorrubicina (DOX · HCl), el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM), 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y el kit de recuento de células 8 (CCK-8) se adquirieron de Solarbio Science and Technology Co. , Ltd. SiO ₂ (~ 300 nm) se adquirió en Shanghai Yuanjiang Chemical Company. La solución de agua desionizada de óxido de grafeno (2 mg / ml) era un producto disponible comercialmente de Nanjing Xianfeng Company.

Preparativos de rGO @ Fe ₃ O ₄ Microesferas

Se prepararon microesferas huecas de grafeno mediante el método de secado por pulverización utilizando SiO ₂ (300 nm) como plantilla. Brevemente, 100 ml de SiO ₂ líquido de suspensión (50 mg mL ⁻¹ ) se vertió lentamente en 300 ml de solución acuosa de GO (2 mg ml ⁻¹ ) bajo agitación drástica, la solución mixta se secó por pulverización a 200 ° C en una unidad de secado por pulverización. Posteriormente, el producto se mantuvo a 300 ° C bajo protección de Ar durante 2 h y rGO-SiO ₂ fue obtenido. Para eliminar SiO ₂ , rGO-SiO ₂ se colocó en solución de HF (10%) durante 48 ha 60 ° C. El producto sólido se lavó varias veces y se secó en estufa de secado al vacío a 60 ° C durante 12 h, finalmente se obtuvo rGO con un rendimiento del 75%.

El rGO @ Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas se prepararon mediante el método de coprecipitación. En un proceso típico para la síntesis de rGO @ Fe ₃ O ₄ nanopartículas, 0,27 g de FeCl ₃ · H ₂ O, 0,28 g de FeSO ₄ · 7H ₂ Se disolvieron O, y 0,1 g de microesferas huecas de rGO en 10 ml de agua desionizada y se agitaron durante 30 min a 50ºC. Luego, 60 mL de NaOH (0.15 mol L ⁻¹ ) se añadió lentamente con agitación continua a 50ºC durante 12 h. Los productos finalmente se separaron magnéticamente y se lavaron repetidamente con agua desionizada y etanol varias veces seguido de secado a 60 ° C al vacío durante 12 h.

Caracterización estructural

El tamaño y la morfología de la muestra se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM, Hitachi, S-4800) y microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEM2100F, JEOL). La composición de los productos se analizó mediante un sistema de difracción de rayos X (XRD, D8 Focus, radiación Cu Ka, Bruker, Alemania) a una velocidad de barrido de 12 ° / min en un rango de 10 a 80 °. Además, se llevó a cabo espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) en un espectrómetro XPS (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, América). Los FTIR (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) se registraron de 500 a 4000 cm ⁻¹ a una resolución de 4 cm ⁻¹ . Las mediciones magnéticas se realizaron utilizando un magnetómetro de dispositivo de interferencia cuántica superconductor (SQUID, Quantum Design MPMS) a temperatura ambiente (300 K). Los espectros Raman se recogieron utilizando un espectroscopio Raman (Renishaw, inVia Reflex, Inglaterra) con un láser de longitud de onda de 532 nm. El contenido de rGO se evaluó utilizando un analizador termogravimétrico (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600). La superficie específica se midió mediante la técnica de Brunauer-Emmett-Teller (BET). Los espectros de UV-Vis se registraron usando un analizador de proteínas / ácidos nucleicos Beckman DU 800 (Beck-man Instruments, Inc., Rosemead, CA).

Carga y liberación de DOX

DOX, un fármaco quimioterapéutico modelo doxorrubicina, se encapsuló en los núcleos de rGO @ Fe ₃ O ₄ evaluar los comportamientos de carga y liberación de medicamentos contra el cáncer in vitro. rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX se preparó de acuerdo con la referencia anterior. En resumen, 10 ml (0,2 mg ml ⁻¹ ) de solución acuosa de DOX se añadió a 10 mg de rGO @ Fe ₃ O ₄ solución, la mezcla se homogeneizó ultrasónicamente para asegurar que no haya precipitación significativa. Luego, la mezcla se equilibró en un agitador alternativo (SK-O180-Pro) a una velocidad de 150 rpm durante 24 h. Después de centrifugar a 6000 rpm durante 10 min, se eliminó el DOX descargado, el sobrenadante de rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX se midió mediante un espectrofotómetro UV-Vis para determinar la cantidad de DOX cargada. La DO de DOX se registró a 490 nm, se utilizaron las siguientes ecuaciones para calcular la eficiencia de carga (LE) y la capacidad de carga (LC) de DOX:

$$ \ mathrm {LE} =\ left (\ mathrm {total} \ \ mathrm {cantidad} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {DOX} - \ mathrm {Gratis} \ \ mathrm {DOX} \ right) / \ mathrm {total} \ \ mathrm {cantidad} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {DOX} $$$$ \ mathrm {LC} =\ left (\ mathrm {total} \ \ mathrm {cantidad} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {DOX} - \ mathrm {Gratis} \ \ mathrm {DOX} \ right) / \ mathrm {cantidad} \ \ mathrm {de} \ mathrm {rGO} @ {\ mathrm {Fe}} _ 3 {\ mathrm {O}} _ 4 / \ mathrm {DOX} $$

Los estudios de liberación in vitro de DOX se realizaron poniendo rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX (10 mg) en una bolsa de diálisis (MWCO =1000) con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 30 mL) a pH 5.4, 6.5 o 7.4, colocándolo en un baño de agua a 37 ° C y agitando a 80 rpm. A intervalos predeterminados, se recogieron 3 ml del medio de liberación y se calculó la cantidad de DOX liberada midiendo el UV-Vis a 480 nm.

Efecto fototérmico activado por NIR de rGO @ Fe ₃ O ₄ Microesferas

Para monitorear la influencia de rGO @ Fe ₃ O ₄ dosis sobre el efecto fototérmico activado por NIR, el rGO @ Fe ₃ O ₄ soluciones con diferentes concentraciones (0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 y 1 mg mL ⁻¹ ) se irradiaron con láser NIR a 2 W cm ⁻² durante 5 min, respectivamente. Además, se evaluó la influencia de la energía NIR en el efecto fototérmico irradiando rGO @ Fe ₃ O ₄ (0,25 mg ml ⁻¹ ) con diferentes potencias (1 W cm ⁻² , 1,5 W cm ⁻² , 2 W cm ⁻² ) durante 5 min. La temperatura en tiempo real se midió con una cámara térmica infrarroja FLIR I5.

Captación in vitro

Las células Hela se sembraron en 35 mm ² platos confocales a una densidad de 1 × 10 ⁵ células / pocillo. Después de incubar durante 24 h en una incubadora (5% CO ₂ , 37 ° C), se retiró el medio y el medio fresco que contenía rGO @ Fe ₃ O ₄ / Microesferas DOX y rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX con imán y se cultivaron durante otras 5 h. El rGO @ Fe ₃ O ₄ / La concentración de DOX fue de 0,1 mg mL ⁻¹ . Luego, las células se lavaron tres veces con PBS frío (pH =7,4) y se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% durante 20 min (CLSM, TCSSP5II, Leica, Ernst-Leitz-Strasse, Alemania).

Ensayos de viabilidad celular

La citotoxicidad de estas microesferas se evaluó mediante un ensayo CCK-8 después del tratamiento con NIR. Las células HeLa se sembraron en placas de 96 pocillos (5 x 10 ³ células / pocillo) en 100 μL del medio y se cultivaron en CO ₂ al 5% a 37 ° C durante 24 h. Para la evaluación de biocompatibilidad, rGO @ Fe ₃ O ₄ se agregaron al pocillo con un rango de concentración de 0.01 a 0.2 mg mL ⁻¹ ; para el grupo de terapia fototérmica única, rGO @ Fe ₃ O ₄ se agregó con un rango de concentración de 0.01 a 0.2 mg mL ⁻¹ y aplicando irradiación de luz NIR durante 10 min (2 W cm ⁻² , 808 nm); para el grupo combinado de quimioterapia fototérmica, rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX se agregó con un rango de concentración de rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX de 0.01 a 0.2 mg mL ⁻¹ y aplicando iluminación con luz NIR durante 10 min (2 W cm ⁻² , 808 nm). Se procedió a incubar las células durante 24 ho 48 h. Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se incubaron en 100 μl de medio DMEM que contenía 10 μl de solución de CCK-8 durante otros 40 min. La viabilidad se detectó utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Resultados y discusiones

Síntesis y caracterización morfológica

La preparación de rGO @ Fe ₃ O ₄ Las microesferas se realizaron a través de tres pasos. En primer lugar, rGO-SiO ₂ Las microesferas se sintetizaron mediante secado por pulverización utilizando SiO ₂ como plantilla. La morfología de rGO-SiO ₂ Las microesferas se caracterizaron por SEM y TEM. Como se muestra en la Fig. 1a, el rGO-SiO ₂ Las microesferas con diámetros de 3 μm exhibieron una forma esférica uniforme y estaban compuestas por muchos SiO ₂ apiñados nanopartículas (~ 300 nm). Los datos de TEM y el diámetro hidrodinámico medidos por dispersión de luz dinámica también confirmaron los resultados. (Figura 1d, g). Luego, se obtuvieron microesferas huecas de rGO eliminando SiO ₂ de rGO-SiO ₂ con calentamiento a 300 ° C y grabado por HF. Se pudieron observar poros obvios con un tamaño de poro de aproximadamente 300 nm debido al SiO ₂ disolución (Fig. 1b, e). Finalmente, Fe ₃ O ₄ en virtud de la capacidad de orientación magnética, se decoró sobre el rGO poroso mediante el método de coprecipitación. La observación de SEM y TEM ilustró que la notable disminución del tamaño de los poros después de Fe ₃ O ₄ Se obtuvo la carga (Fig. 1c, f), lo que proporciona la viabilidad de la administración del fármaco y la liberación controlada del fármaco. En particular, el tamaño de partícula y la distribución del tamaño hidrodinámico de rGO-SiO ₂ , rGO, rGO @ Fe ₃ O ₄ no tienen más cambios visibles durante estos tratamientos (Fig. 1g, h, i).

Caracterización morfológica de microesferas. Imágenes SEM de ( a ) rGO-SiO ₂ , ( b ) rGO, ( c ) rGO @ Fe ₃ O ₄; Imágenes TEM de ( d ) rGO-SiO ₂ , ( e ) rGO, ( f ) rGO @ Fe ₃ O ₄; Distribución hidrodinámica del tamaño de las muestras correspondientes ( g ) rGO-SiO ₂ , ( h ) rGO, ( i ) rGO @ Fe ₃ O ₄

Caracterización de estructura y composición

Para confirmar aún más la preparación exitosa de rGO @ Fe ₃ O ₄ Se empleó SEM con EDS para investigar la estructura y composición de las microesferas. Las imágenes EDS de rGO @ Fe ₃ O ₄ se caracterizaron por visualizar los electrones dispersos inelásticamente en las ventanas de pérdida de energía para O, Fe y C elementales, y las diferentes áreas de color representan ubicaciones enriquecidas con O, Fe y C en estructuras reales, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 2a yb, Fe y O se distribuyeron ampliamente en rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas con alta densidad de carga. La Figura 2d confirmó que el Fe ₃ O ₄ nanopartículas uniformemente dispersas en rGO con un diámetro de aproximadamente 18 nm, lo que resulta en una fuerte disminución del tamaño de los poros en rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas. El patrón de difracción de electrones de área seleccionada (SAED) verificó aún más la presencia de Fe ₃ O ₄ en rGO (Fig.2e), la resonancia característica en 2.98 nm, 2.53 nm, 2.09 nm, 1.62 nm y 1.49 nm espaciamiento de caras asignado a los planos 220, 311, 400, 511 y 440 de la cara centrada-cúbica fase de Fe ₃ O ₄ , respectivamente. Los picos aparecieron en 220, 311, 400, 511 y 440 correspondientes a Fe ₃ O ₄ también se detectaron en los espectros XRD, lo que fue consistente con los resultados de SAED (Fig. 2c). Sin embargo, se informa que Fe ₃ O ₄ y γ-Fe ₂ O ₃ no se pudo distinguir por el patrón XRD de forma independiente para la misma ubicación de picos característicos [35]. El resultado de XPS mostró que los picos predominantes a 725,9 / 724,5 eV y 714,1 / 711,0 eV, correspondientes a Fe2p _1/2 y Fe 2p _3/2 del rGO @ Fe ₃ O ₄ (Fig. 2g, h), respectivamente, indicando la coexistencia de Fe ³⁺ y Fe ²⁺ en Fe ₃ O ₄ [36]. Se realizó un análisis termogravimétrico (TGA) para monitorear el comportamiento de degradación térmica de rGO en rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas calentando la muestra a 800 ° C y enfriando hasta 100 ° C en una atmósfera de aire (Fig. 2f). La curva de pérdida de masa mostró dos regiones distintas de pérdida de masa, incluida la región de deshidratación (40-300 ° C) y la región de desvolatilización (300-800 ° C) de rGO en rGO @ Fe ₃ O ₄ , el contenido de carbono calculado a partir de la muestra fue del 25,6% en peso.

Caracterización de la estructura y composición de rGO @ Fe3O4. ( a , b ) SEM con imágenes de mapeo EDS de rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas:elementos C, Fe y O; ( c ) Patrones XRD de rGO-SiO ₂ , rGO y rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas; ( d , e ) SEAD imágenes de rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas; ( f ) TG curvas de rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas; ( g , h ) Espectros XPS de rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas; ( yo ) Bucles de histéresis magnética del Fe ₃ O ₄ y rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas (el recuadro de la parte superior muestra los valores del campo coercitivo (Hc) de las muestras, y el recuadro de la parte inferior muestra sus suspensiones antes y después de la separación magnética por un imán externo)

Las propiedades magnéticas de rGO @ Fe ₃ O ₄ Las microesferas se investigaron utilizando un dispositivo de interferencia cuántica superconductor. El campo magnético se realizó con un rango de exploración de -20.000 a 20.000 Oe a temperatura ambiente. La Figura 2i muestra el valor de magnetización de saturación (Ms) y el valor de campo coercitivo (Hc) de Fe ₃ O ₄ son 66,6 emu g ⁻¹ y 9.3 Oe. Después de cargar Fe ₃ O ₄ en rGO, el valor de Ms y el valor de Hc de rGO @ Fe ₃ O ₄ las microesferas disminuyeron a 33,9 emu g ⁻¹ y 7,44 Oe. La notable disminución de la saturación magnética puede contribuir a las propiedades diamagnéticas de rGO en rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas. Además, la capacidad de aglomeración selectiva de rGO @ Fe ₃ O ₄ Las microesferas se realizaron intuitivamente mediante un experimento de separación magnética. Las suspensiones del Fe ₃ O ₄ y rGO @ Fe ₃ O ₄ Se colocaron microesferas en el vial con un imán externo durante 2 min, las suspensiones se pueden concentrar en el lado del imán y la solución acuosa se volvió transparente. Cuando se quitó el imán, el rGO @ Fe ₃ O ₄ las microesferas se dispersaron uniformemente de nuevo después de agitar lentamente, lo que indica que rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas que tienen el mérito de una buena capacidad de dispersión de agua. La excelente capacidad de dispersión de agua y la propiedad de respuesta magnética pagaron el camino para la aplicación magnética dirigida de rGO @ Fe ₃ O ₄ como el fármaco en el tratamiento del cáncer.

Análisis del efecto fototérmico

Teniendo en cuenta la penetración más profunda en el tejido y el menor daño a los tejidos circundantes de NIR, la terapia fototérmica sensible a NIR se empleó a menudo para el tratamiento de tumores. Por lo tanto, el comportamiento de transformación fototérmica de rGO @ Fe ₃ O ₄ Se registraron soluciones acuosas a diferentes concentraciones y diferentes densidades de potencia bajo irradiación con láser NIR a 808 nm durante 5 min. La Figura 3a, b mostró que el aumento de temperatura de rGO @ Fe ₃ O ₄ dependía en gran medida de la concentración y la densidad de potencia del láser. Cuando la concentración de las microesferas fue de hasta 1 mg mL ⁻¹ , la temperatura se elevó de 27,9 a 70,3 ° C bajo irradiación láser NIR durante 5 min a 2 W cm ⁻² , mientras que la temperatura para el grupo PBS acaba de subir de 31,7 a 36,2 ° C. La alta eficiencia de conversión fototérmica de rGO @ Fe ₃ O ₄ tendrá un gran potencial para la terapia fototérmica tumoral de acuerdo con un informe anterior de que la degeneración de proteínas y el daño del ADN en la célula ocurrirán (sucedieron) tras la exposición a 50 ° C durante 4 a 6 min [21, 37]. Para mostrar intuitivamente el comportamiento de transformación fototérmica de rGO @ Fe ₃ O ₄ , Se realizó termografía IR y los resultados se muestran en la Fig. 4c. El rGO @ Fe ₃ O ₄ solución con la concentración de 1 mg mL ⁻¹ se aumentó rápidamente a 70,3 ° C después de la irradiación NIR durante 5 min, mientras que el grupo de agua no tiene cambios obvios, lo que fue consistente con los resultados de la termometría. Además, la estabilidad fototérmica del rGO @ Fe ₃ O ₄ se estudió realizando un procedimiento de encendido / apagado de láser con un láser de 808 nm a 2 W cm ⁻² durante seis ciclos (Fig. 3d). Se obtuvo el mismo aumento de temperatura, lo que indica la perfecta estabilidad fototérmica NIR de rGO @ Fe ₃ O ₄ composicion. Estos resultados demostraron que rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas muy prometedoras como agente fototérmico para la terapia fototérmica en el cáncer.

Efectos fototérmicos de rGO @ Fe3O4. un Cambio de temperatura dependiente de la concentración de rGO @ Fe ₃ O ₄ soluciones a diferentes concentraciones (0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 y 1 mg mL ⁻¹ ) bajo irradiación de 808 nm a 2 W cm ⁻² durante 5 min. b Respuesta de temperatura dependiente de la potencia de 0,25 mg mL ⁻¹ rGO @ Fe ₃ O ₄ solución bajo la irradiación de un láser NIR de 808 nm durante 5 min (1 W cm ⁻² , 1,5 W cm ⁻² , 2 W cm ⁻² ). c Imágenes térmicas infrarrojas de rGO @ Fe ₃ O ₄ solución a intervalos de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 min estimulada a 808 nm (2 W cm ⁻² ). d Aumentos de temperatura de rGO @ Fe ₃ O ₄ (0,25 mg ml ⁻¹ ) solución durante 6 ciclos sucesivos de encendido / apagado del láser con irradiación de 808 nm a 2 W cm ⁻²

El área de superficie y el tamaño de los poros de las microesferas rGO @ Fe3O4, los comportamientos de carga y liberación de DOX. un Isotermas de adsorción-desorción de nitrógeno de rGO @ Fe ₃ O ₄ . b Distribución del tamaño de poro de rGO @ Fe ₃ O ₄ . c Espectros FTIR de rGO @ Fe ₃ O ₄ y rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX. d , e Imágenes de mapeo y SEM de N, Fe y O de rGO @ Fe ₃ O ₄ / Microesferas DOX. f Curvas cinéticas de liberación de fármaco obtenidas a diferentes valores de pH de rGO @ Fe ₃ O ₄ microesferas. g Curvas cinéticas de liberación de DOX que responden a NIR

Carga y liberación de medicamentos

El área de la superficie y el tamaño de los poros de rGO @ Fe ₃ O ₄ fueron evaluados mediante análisis BET y BJH (Fig. 2a, b). N ₂ El tipo de curva de adsorción-desorción era de tipo IV isotérmico, y el área de superficie y el tamaño de los poros eran de 120,7 m ² g ⁻¹ , 2-8 nm y 1.012 cm ³ g ⁻¹ , respectivamente. Los resultados mostraron que rGO @ Fe ₃ O ₄ poseía canales mesoporosos y una distribución de tamaño de poro promedio, exhibiendo un gran potencial para la carga de fármacos antitumorales. Luego, el rGO @ Fe ₃ O ₄ Se sirvieron microesferas con estructura porosa para cargar un fármaco quimioterapéutico modelo doxorrubicina simplemente mezclándolo y con una ligera sonicación. El análisis ATR-FTIR verificó además la incorporación estable de DOX en rGO @ Fe ₃ O ₄ debido a la resonancia característica de -COOH y grupos benceno de DOX a 1726 cm ⁻¹ y 1618 cm ⁻¹ (Figura 4c). La observación de microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró que las nuevas señales de N elementos asignados a DOX se distribuían uniformemente en la microesfera después de la carga de DOX (Fig. 4d, e). Además, la eficiencia de carga DOX (LE) y la capacidad de carga (LC) de rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX fueron 92,15% y 18,43%, respectivamente. Los LC notablemente más altos de rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX que muchos portadores de fármacos puede contribuir a áreas de superficie y tamaños de poro extremadamente altos [19]. El LE alto de rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX se puede atribuir a dos aspectos, uno es que rGO @ Fe ₃ O ₄ puede interactuar con DOX mediante un fuerte apilamiento π – π entre enlaces π hibridados con sp2 de rGO @ Fe ₃ O ₄ y la porción de quinina de DOX [21], y otra puede ser que pueden formar puentes de hidrógeno entre los grupos ácido carboxílico (–COOH), hidroxilo (–OH) de rGO @ Fe ₃ O ₄ y la amina (–NH ₂ ), grupos hidroxilo (–OH) de DOX. Luego, monitoreamos el comportamiento de liberación de DOX en PBS a pH 7,4, 6,5 y 5,4, para imitar los entornos extracelulares de los tejidos tumorales y normales. Como se indica en la Fig. 4f, la velocidad de liberación de DOX se aceleró cuando el pH se ajustó de 7,4 a 5,4, y la liberación sostenida de DOX a pH 5,4 puede ser de hasta un 73% después de 98 h de tratamiento. Por lo tanto, el perfil de liberación acumulativa de DOX de rGO @ Fe ₃ O ₄ exhibió una manera dependiente del pH. Esta liberación acelerada en condiciones ácidas podría deberse a la protonación parcial de los grupos hidroxilo y amina de DOX, lo que conduce a una mayor solubilidad del fármaco y al debilitamiento de los enlaces de hidrógeno entre DOX y grafeno [38]. Además, también estudiamos el comportamiento de liberación de DOX sensible a NIR in vitro. Como se indica en la Fig. 4g, la liberación de DOX se aceleró mediante radiación NIR y la tasa de liberación de DOX fue de hasta un 85%. Este comportamiento de respuesta a estímulos de pH y NIR juega un papel importante en la administración eficaz del fármaco hacia el sitio del tumor.

Captación celular in vitro

Para verificar la capacidad de focalización magnética del Fe ₃ O ₄ en rGO @ Fe ₃ O ₄ microesfera, los experimentos de captación celular con o sin tratamiento de campo magnético se investigaron cualitativamente mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Las células Hela se incubaron con rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX durante 4 hy los núcleos de Hela se tiñeron con DAPI. Los resultados de la Fig.5 mostraron que la mancha negra correspondiente a rGO @ Fe ₃ O ₄ Se observaron microesferas y señales obvias de fluorescencia roja intracelular asignadas a DOX en rGO @ Fe ₃ O ₄ grupo con un tratamiento de campo magnético. Por el contrario, hubo menos puntos negros y se puede encontrar una fluorescencia DOX más débil cuando rGO @ Fe ₃ O ₄ grupo sin carga de campo magnético. La explicación puede ser que la mancha negra atribuida a rGO @ Fe ₃ El O4 internalizado en la célula podría ser promovido por un imán. Los resultados indican que Fe3O4 en rGO @ Fe ₃ O4 / DOX podría dirigirse específicamente a las células Hela de manera eficiente y mejorar significativamente la internalización celular de las microesferas, demostrando una capacidad de dirección magnética favorable del sistema de administración de fármacos en la terapia del cáncer.

Evaluación de diana magnética de microesferas rGO @ Fe3O4-DOX. Imágenes CLSM de rGO @ Fe ₃ O ₄ / Células HeLa incubadas con DOX con y sin imán (los recuadros muestran la imagen con gran aumento)

Análisis de citotoxicidad in vitro

La biocompatibilidad de rGO @ Fe ₃ O ₄ se evaluó utilizando el ensayo CCK-8 para células Hela. Como se muestra en la Fig. 6a, después de la incubación con rGO @ Fe ₃ O ₄ en una amplia gama de concentraciones diferentes, la viabilidad celular también fue superior al 90% incluso a concentraciones altas de hasta 200 μg mL ⁻¹ , los resultados indicaron que rGO @ Fe ₃ O ₄ exhibe una alta biocompatibilidad y podría servir como una plataforma de administración de fármacos eficiente. La eficacia de la terapia fototérmica de rGO @ Fe ₃ O ₄ se investigó más a fondo después de la incubación con células Hela durante 24 hy 48 h bajo irradiación de luz NIR (láser NIR de 808 nm, 10 min). Como se muestra en la Fig. 6b, la fototoxicidad fue claramente dependiente de la dosis de la estimulación NIR, y la viabilidad celular disminuyó del 90,37 al 35,52% a las 24 h, y del 93,77 al 31,75% a las 48 h, lo que implica que rGO @ Fe ₃ O ₄ tenía una excelente fototoxicidad y era muy prometedor en la terapia fototérmica. Para estimar la eficacia terapéutica sinérgica de la quimioterapia fototérmica, la citotoxicidad de rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX hacia células Hela con y sin irradiación NIR. Como se muestra en la Fig. 6c, d, la viabilidad celular mostró una manera dependiente de la concentración y controlada por el tiempo. Aproximadamente el 65% y el 80% de las células Hela fueron destruidas por rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX sin irradiación NIR y DOX a las 24 h, la capacidad disminuida de destrucción de tumores de rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX en comparación con DOX gratuito puede deberse al comportamiento de liberación de DOX retrasado de rGO @ Fe ₃ O ₄ / Microesferas DOX. Después de la irradiación con láser NIR (láser NIR de 808 nm, 10 min), rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX con grupo láser mató a más del 86% de las células a una dosis equivalente de DOX (30 μg mL ⁻¹ ). Se pudieron observar resultados similares después de las mismas células de tratamiento durante 48 h, la disminución en la viabilidad celular de DOX, rGO @ Fe ₃ O ₄ / DOX, rGO @ Fe ₃ O ₄ /DOX with NIR irradiation group was 80%, 76%, and 90%, respectively, indicating a synergistic effect of the combined photothermal therapy and chemotherapy.

The biocompatibility and the therapeutic efficacy of single photothermal therapy or combined photothermal-chemotherapy. un Cell viability of Hela cells cultured with rGO@Fe₃ O ₄ for 24 h and 48 h. b Cell viability of Hela cells cultured with or without NIR irradiation at different concentrations of rGO@Fe₃ O ₄ for 24 h and 48 h. ( c , d ) Cell viability of Hela cells cultured with free DOX, rGO@Fe₃ O ₄ /DOX microspheres for 24 h and 48 h with and without NIR irradiation (808 nm, 2 W cm⁻² ) (*p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001)

Conclusions

In summary, we explored a facile strategy to construct rGO-based drug delivery platform rGO@Fe₃ O ₄ /DOX for synergistic photothermal-chemotherapy. rGO@Fe₃ O ₄ /DOX microsphere exhibited excellent NIR-triggered PTT effect and perfect NIR photothermal stability. The Fe₃ O ₄ on the microspheres ensured excellent tumor cells targeting ability. DOX could be encapsulated into rGO@Fe₃ O ₄ with an ultrahigh drug-loading capacity and a pH-responsive drug release behavior could be simultaneously achieved. In addition, an enhanced antitumor efficiency was achieved when a combination of chemotherapy and photothermal therapy. Therefore, this multifunctional drug delivery platform could be a promising candidate for tumor targeting and combinatorial cancer therapy in the future.