Nanoportadores basados ​​en lípidos y nucleósidos para la administración de sorafenib

Métodos

Productos químicos y reactivos

Metanol (MeOH), ácido fórmico (FA) y formiato de amonio (AFNH ₄ ) se adquirieron de VWR Chemicals (Francia) y todos eran de grado HPLC (cromatografía líquida de alta resolución). El agua de grado HPLC (resistividad mínima de 18,2 MΩ) fue producida internamente por el sistema ELGA Millipore (Francia). DOTAU (Número CAS:868226-06-6) y diC ₁₆ dT (Número CAS:1160002-70-9) se sintetizaron en el laboratorio de acuerdo con el protocolo informado en las Referencias [23, 24, 25]. Sorafenib, 4- [4 - [[4-cloro-3- (trifluorometil) fenil] carbamoilamino] fenoxi] - N -metil-piridina-2-carboxamida (número CAS:284461-73-0) se compró en SynVec http://synvec.fr (Ref # D114250414).

Estudios de cromatografía

Se desarrolló un método de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) de fase inversa para nucleolípidos (DOTAU y diC ₁₆ dT) y cuantificación de sorafenib en SLN. Antes de la inyección en HPLC, las soluciones acuosas de nanopartículas se diluyeron con etanol por factores 5 y 10, para cuantificar nucleolípidos y sorafenib, respectivamente.

Se utilizó un sistema cromatográfico UHPLC UltiMate 3000 de Dionex-Thermo Scientific (EE. UU.), Compuesto por una bomba con un sistema de válvula cuaternaria para la selección de la columna, un muestreador automático termostatizado y un compartimento de columna termostatizado. La separación se realizó con la columna Syncronis C18 50 x 2,1 mm, 1,7 µm. La fase móvil constaba de MeOH 70/30 / acetato de amonio 25 mM (pH =7,4) (A) y acetato de amonio 26,5 mM en MeOH (pH =7,9) (B). Se utilizó una velocidad de flujo de 0,2 ml / min y el perfil de gradiente fue de 0 a 2 min, 0 a 100% de B; 2–20 min, 100% B. La temperatura de la columna se fijó en 25 ° C. La detección se realizó a 267 nm para sorafenib y diC ₁₆ dT y 257 nm para DOTAU. El volumen inyectado fue de 1 μL, lo que dio lugar a límites de cuantificación de 0,6 ng para sorafenib y 15 ng para nucleolípidos y DOTAU y diC ₁₆ dT.

Curvas estándar para sorafenib, DOTAU y diC ₁₆ dT en etanol se muestran en el archivo adicional 1:Figuras SI1, SI2 y SI3, respectivamente.

Preparación de nanopartículas de sorafenib

Se disolvieron diez miligramos de sorafenib en 1 ml de etanol y 10 mg de NL (diC ₁₆ dT o DOTAU) se solubilizó en 1 mL de etanol. Se mezclaron cien microlitros de NL, 100 μL de soluciones de sorafenib y 800 μL de etanol a temperatura ambiente y se agregaron gota a gota a 10 ml de agua destilada con agitación magnética. La solución se colocó en un baño ultrasónico durante 90 min a 25 ° C. Se eliminó el etanol al vacío a 30ºC y se ajustó el volumen a 1 ml. Esta solución se sonicó dos veces usando una sonda ultrasónica de 6 mm (Vibracell 75186) durante 10 min al 100% de amplitud con pulso de 2 seg cada 5 seg. Se dializó un mililitro frente a 30 ml de agua destilada durante 3 x 15 min. Este volumen se ajusta a 2 ml y se conserva para la caracterización, cuantificación y estudios de estabilidad. Además, los experimentos de control se realizaron con el mismo protocolo en ausencia de nucleolípidos.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM y EDX)

Las nanopartículas se visualizaron mediante microscopía de tinción negativa. Se transfirieron diez microlitros de nanopartículas a una rejilla de cobre recubierta de carbono durante 10 min. Luego, la muestra se secó y se tiñó con un 2,5% ( w / w ) de acetato de uranilo en agua durante 2 min. Las muestras se observaron con un microscopio electrónico Hitachi H 7650. La espectroscopia de rayos X de dispersión de energía se realizó utilizando un microscopio electrónico de transmisión TECNAI acoplado con Quantax-X-Flash SVE 6.

Tamaño de partícula y determinación de Zeta

La partícula zeta y el tamaño se determinaron usando un Zetasizer NanoZS, Malvern. Los experimentos se realizaron con 40 μL de las nanopartículas diluidas en 400 μL de agua y las mediciones se realizaron a 25 ° C.

Análisis de citotoxicidad

Se cultivaron HuH7 y HepG2 en monocapa en DMEM-Glutamax complementado con suero de ternero fetal al 10%. MDA-MB-134 y T-47D se cultivaron en monocapa en RPMI complementado con suero de ternero fetal al 10% (solo para T-47D, AA no esencial 1X, glucosa 0,45%, insulina 10 mg L ⁻¹ y piruvato de sodio 1X). Todos los reactivos de cultivo fueron de Invitrogen. 10 ⁴ células / pocillo en 90 μL de medio de cultivo completo se sembraron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 ha 37 ° C y 5% de CO ₂ , antes de agregar 10 μL de SLN o sorafenib en el medio de cultivo. Se disolvió sorafenib (número CAS:284461-73-0) en medio de cultivo con DMSO al 0,1%. Tenga en cuenta que en estas condiciones, la concentración máxima de sorafenib sin precipitación fue de 5 μM, mientras que para los SLN cargados con sorafenib, la concentración máxima probada fue de 120 μM sin DMSO. Después de 4 días de incubación, se evaluó la viabilidad celular con el ensayo de proliferación basado en formazán (kit CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega), agregando 20 μL / pocillo de solución de reactivo. Después de una incubación de 30 minutos a 37 ° C, 5% de CO ₂ , la absorbancia de cada pocillo se midió a una longitud de onda de 492 nm utilizando un espectrofotómetro Berthold. Los resultados se expresan como el porcentaje de \ (\ frac {{\ mathrm {OD}} _ {492} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {tratadas} \ \ mathrm {celdas} - {\ mathrm {OD}} _ {492} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {espacio en blanco}} {\ {\ mathrm {OD}} _ {492} \ mathrm {de} \ \ mathrm {sin tratar} \ \ mathrm {celdas} - {\ mathrm {OD}} _ {492} \ \ mathrm {de} \ \ mathrm {en blanco}} \).

Estudios de viabilidad celular

Se cultivaron HuH7 como se describió previamente en la sección "Análisis de citotoxicidad". La viabilidad celular se realizó después de 4 días de incubación con SLN ⁺ cargado con sorafenib a diferentes concentraciones (0, 1, 5, 10, 25, 50 y 100 μM) utilizando un ensayo de viabilidad de células vivas / muertas (Invitrogen). Brevemente, se eliminó el medio de cultivo y las células adherentes se lavaron una vez con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Se agregaron 200 microlitros de HBSS que contenían éster acetoximetílico de calceína 2 μM y homodímero de etidio-1 4 μM a cada pocillo y se incubaron durante 45 min a 37 ° C y 5% de CO ₂ . Después de la tinción, las células se lavaron una vez con HBSS y se obtuvieron imágenes microscópicas en un microscopio de fluorescencia invertido. El porcentaje de células muertas se evaluó mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Después de teñir con 4 μM de solución de homodímero 1 de etidio, las células se trataron con tripsina y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante centrifugación a 1000 rpm durante 5 min. Los datos se adquirieron en el citómetro de flujo LSRFortessa de Becton Dickinson y los resultados se analizaron utilizando el software DIVA. Se preparó una muestra de células muertas utilizando metanol al 70% y se utilizó como control.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de SLN

La no toxicidad y las propiedades de autoensamblaje de los nucleolípidos los convierten en adyuvantes anfifílicos ideales para encapsular fármacos hidrófobos como el sorafenib. En este estudio, se desarrolló un procedimiento de nanoprecipitación simple para abordar las propiedades de baja solubilidad en agua del sorafenib y mejorar su actividad anticancerígena, lo que limita en muchos casos su uso clínico. En cuanto a la solubilidad en agua, planteamos la hipótesis de que el carácter hidrófobo, los heterociclos y las funciones de enlace de hidrógeno del sorafenib favorecerían las interacciones con nucleolípidos y la formación de nanoobjetos. Además, se esperaba que los GC cargados con sorafenib aumentaran las actividades antitumorales al mejorar la captación celular de sorafenib. De hecho, en uno de nuestros estudios anteriores sobre nanopartículas de cisplatino, demostramos que la mejora de las actividades antitumorales del cisplatino se debía a una mayor cantidad de fármaco internalizado en las células cancerosas [23] [1]. Nuestro proceso de nanoprecipitación implica tres pasos:(i) la solubilización de sorafenib en etanol a 40 ° C (10 mg / mL de sorafenib, 100 μL) y la adición de un equivalente de nucleolípido (ya sea un nucleótido-lípido aniónico, el diC ₁₆ -3′-dT [timidina 3 ′ - (1,2-dipalmitoil- sn -glicero-3-fosfato)] o un nucleósido-lípido catiónico DOTAU [23] [2 ′, 3′-dioleilo- 5 ′ -desoxi-5'-trimetil-amonio-uridina], 100 μL de una solución a 10 mg / mL en etanol; (ii) se agrega gota a gota 1 mL de la solución de etanol a temperatura ambiente a 10 mL de agua destilada; y (iii) la suspensión resultante se evaporó para eliminar el exceso de etanol y se sonicó.

Estudios cromatográficos

Para evaluar las capacidades de carga de fármacos de las nuevas formulaciones, se desarrolló un método de UHPLC de fase inversa. Con este método de HPLC, la separación simultánea de sorafenib y nucleolípidos se logró en 12 minutos, lo que permitió la cuantificación individual de compuestos en SLN (archivo adicional 1:Figura SI1-4).

Se obtuvieron relaciones de carga (relaciones de masa de sorafenib / nucleolípidos en nanopartículas) del 50 y 80% y rendimientos de encapsulación de sorafenib en torno al 55 y 75% para formulaciones compuestas de sorafenib / DOTAU (SLN ⁺ ) y sorafenib / diC ₁₆ dT (SLN ^- ), respectivamente. Durante el experimento de control realizado en ausencia de nucleolípidos, aproximadamente el 90% de sorafenib se perdió durante los diferentes pasos de la formulación, probablemente debido a la baja solubilidad del sorafenib en agua. Este resultado demuestra que los nucleolípidos son necesarios para solubilizar sorafenib y estabilizar los SLN.

Estudios fisicoquímicos

Se llevaron a cabo experimentos de dispersión dinámica de luz (DLS) para caracterizar la formación de SLN. Nucleolípidos positivos y negativos (diC ₁₆ dT y DOTAU) forman nanopartículas no esféricas similares con formas de paralelepípedo en solución acuosa con una monodispersidad (índice de polidispersidad, PDI =0,202 y 0,289; tamaño =335,2 y 304,4 nm, respectivamente, Fig.2 y archivo adicional 1:Figura SI7). Como era de esperar, los potenciales zeta de los objetos basados ​​en SLN dependen de las cabezas polares de nucleolípidos ( ζ =+ 59,1 y - 54,9 mV para SLN ⁺ y SLN ^- , consulte el archivo adicional 1:Figura SI10). La presencia de sorafenib en el NP fue validada por imágenes TEM y las adquisiciones EDX de un SLN- se realizaron con adquisiciones EDX. La Fig. 2e, f muestra las manchas I y II. La mancha I en la Fig. 2f exhibe la emisión de átomo de cloro (mancha I, Fig. 2e, f) que indica la presencia del sorafenib (ver estructura química de la Fig. 2f). Tenga en cuenta que el cloro está presente solo en el punto I y no en el punto II (Fig. 2f).

Caracterización de GC. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) que muestran la morfología de nanopartículas de sorafenib con DOTAU ( a ) y recuadro ( b ). Ejemplo de un SLN basado en DOTAU con un tamaño de 327 por 172 nm (flechas), que confirma un tamaño promedio de 304 nm medido por DLS ( d ). c Ejemplo de imagen TEM que muestra diC ₁₆ dT-SLN (flechas 330 por 500 nm, respectivamente). ( e ) Imagen TEM de un SLN-. Los puntos I y II son las localizaciones donde se realizaron las adquisiciones de EDX. ( f ) Espectros EDX en las posiciones I y II. La línea discontinua enfatizaba la emisión del átomo de cloro, que solo está presente en I. También se presenta la estructura química de la molécula de sorafenib. Ambos espectros se normalizaron con emisión de átomos de Cu a 8 keV (debido a la rejilla TEM Cu)

Es importante destacar que en los experimentos de control, la nanoprecipitación de sorafenib en ausencia de nucleolípidos no dio lugar a ningún nanoobjeto, lo que demuestra que los nucleolípidos permiten la formación y estabilización de los GC.

Estudios de estabilidad

Estabilidades coloidales de SLN ⁺ y SLN ^- fueron medidos por DLS y potencial zeta a dos temperaturas (Fig. 3a y archivo adicional 1:Figura SI10). En el caso de diC ₁₆ Formulaciones basadas en dT, el tamaño de SLN ^- no se modificó después de 30 días a 4 y 37 ° C, lo que indica una alta estabilidad de esas nanopartículas (archivo adicional 1:Figura SI9). Dicha estabilidad puede explicarse por la naturaleza de las interacciones (que involucran enlaces H, π - π apilamiento, interacción carga / carga) que se produce entre los diC ₁₆ dT y sorafenib. Sin embargo, para las formulaciones basadas en DOTAU, SLN ⁺ se mantuvieron estables solo a 4 ° C durante 30 días, como lo revelaron los estudios de DLS (Fig. 3a), mientras que a 37 ° C, se observó un aumento tanto del tamaño como del PDI (Fig. 3a). Esta relativa inestabilidad observada a 37 ° C en el caso de SLN ⁺ podría explicarse por las interacciones culómbicas repulsivas que se producen entre las cargas positivas de sorafenib y DOTAU. Curiosamente, los estudios de estabilidad coloidal indican que es posible modular la estabilidad, de ahí el suministro de sorafenib desde los GC al entorno fisiológico, dependiendo del nucleolípido utilizado para la estabilización de los GC. La modulación de estabilidad podría ser atractiva dependiendo de la cinética de liberación necesaria.

Estudios de estabilidad de GC. Estabilidad coloidal de SLN ⁺ ( a ) y estabilidad química de sorafenib y DOTAU en SLN ⁺ frente al tiempo a 4 y 37 ° C ( b ). PDI, índice de polidispersidad

Paralelamente a la estabilidad coloidal, la estabilidad química de sorafenib, DOTAU y diC ₁₆ La dT en las formulaciones basadas en SLN se investigó en función del tiempo a 4 y 37 ° C utilizando un nuevo método cromatográfico (consulte el archivo adicional 1:Figura SI4). Los estudios cinéticos a ambas temperaturas se muestran en la Fig. 3b y en el archivo adicional 1:SI5 para DOTAU-SLN y diC ₁₆ dT-SLN, respectivamente. Los resultados muestran que sorafenib y diC ₁₆ Las moléculas de dT en las formulaciones permanecen estables durante al menos 1 mes, lo que indica una estabilidad química a largo plazo a ambas temperaturas en el caso de SLN ^- . Sin embargo, se observó una disminución de DOTAU durante el tiempo en el SLN ⁺ formulaciones. Primero, a 4 ° C, se midieron pérdidas de aproximadamente 12% durante 7 días y 20% durante 30 días. Al aumentar la temperatura, la estabilidad de DOTAU disminuyó con una pérdida del 55% durante 7 días y hasta el 95% durante 30 días a 37 ° C. Tales diferencias en la estabilidad química entre nucleolípidos ya se evidenciaron durante estudios de estabilidad previos (consulte el archivo adicional 1:Figura SI6).

Estudios biológicos

La citotoxicidad del SLN se evaluó mediante las actividades del metabolismo y la morfología de las células. El ensayo MTT permitió comparar sorafenib libre (en 0,1% de DMSO) y SLN cargados con el fármaco (Fig.4) en cuatro líneas celulares que incluían dos hepatocarcinomas (HuH7 y HepG2) y dos cánceres de mama luminal (MDA-MB-134 y T- 47D). Primero, a concentraciones cercanas a la solubilidad máxima de sorafenib libre (5 μM de sorafenib en 0.1% de DMSO, 2.8 μM para sorafenib / DOTAU y 4 μM para sorafenib / diC ₁₆ nanopartículas dT), ambos SLN inhibieron la viabilidad celular mejor que el sorafenib libre. Como se muestra en la Fig. 4b, un estudio de viabilidad celular realizado en células MDA-MB-134 indicó que la actividad del sorafenib libre está limitada por su solubilidad en agua (100% de la viabilidad celular a [sorafenib] =5 μM), mientras que IC ₅₀ Se observaron valores de 15 y 50 μM para SLN ⁺ y SLN ^- , respectivamente (Fig. 4b). En un estudio FACS logrado en HuH7, un IC ₅₀ de aproximadamente 50 μM se obtuvo (Archivo adicional 1:Figuras SI12 y SI13). Las imágenes de microscopía de contraste de fase muestran de hecho una densidad reducida de las capas de células tratadas con SLN ^- y SLN ⁺ en comparación con las células no tratadas o tratadas con sorafenib sin alteración de la morfología celular (archivo adicional 1:Figura SI11). En segundo lugar, se realizaron experimentos similares a concentraciones más altas de SLN ([sorafenib] =120 y a 84 μM para SLN ^- y SLN ⁺ , respectivamente) y en comparación con sorafenib libre en su límite de solubilidad (concentración de 5 μM). En estas condiciones, ambos SLN exhiben un fuerte efecto citotóxico en las cuatro líneas celulares cancerosas como se muestra en la Fig. 5. Como se revela en las imágenes de microscopía de contraste de fase, se observaron restos celulares para ambos SLN ^- (Fig. 5C1–4) y SLN ⁺ (Fig. 5D1-4) que atestigua la muerte celular, mientras que las células permanecen vivas en el caso del sorafenib libre (fig. 5B1-4). Vale la pena señalar que se observaron fuertes efectos citotóxicos para ambos SLN en el caso de las células de cáncer de mama luminal B (fig. 5C1-2 y D1-2). Tal efecto antitumoral, que no se había informado antes, abre una nueva posible aplicación terapéutica del sorafenib gracias a los GC.

Efecto de citotoxicidad de sorafenib o SLN. un ) Comparación de la citotoxicidad con Sorafenib libre o SLN de Sorafenib en 4 líneas celulares (2 cáncer de mama luminal B y 2 hepatocarcinomas) después de la cuantificación con ensayo MTS en 3 pocillos a 5 μM de Sorafenib libre, 2,8 μM de NP Sorafenib / DOTAU (SLN + ) y 4 μM de NPs Sorafenib / diC16dT (SLN-). b ) Ensayo de viabilidad celular (células MDA-MB-134) en presencia de sorafenib libre (solubilidad limitada), SLN + (gris) o SLN- (negro)

Comparación de morfologías celulares entre control, sorafenib libre o SLN. Imágenes de microscopía de contraste de fase que muestran citotoxicidad en diferentes condiciones en cuatro líneas celulares de carcinoma humano (los hepatocarcinomas, HuH7, HepG2 y el carcinoma de mama luminal MDA-MB-134, T-47D). A) En ausencia de sorafenib (experimentos de control, A1 - A4 para MDA-MB-134, T-47D, HuH7, HepG2, líneas celulares, respectivamente). B) Las células se incubaron durante 4 días en presencia de 5 µM de sorafenib libre. C y D) células incubadas en presencia de SLN ^- y SLN ⁺ a 84 y 120 μM en concentración de sorafenib, respectivamente

Conclusión

Divulgamos un enfoque novedoso basado en nucleolípidos que permite la encapsulación eficiente y la entrega de sorafenib. Nuestras investigaciones demuestran la formación de dos tipos de nanopartículas sólidas de lípidos (SLN) altamente cargadas con sorafenib. Estos SLN, que muestran valores de potenciales zeta negativos o positivos, presentan formas de paralelepípedo. Como revelaron los estudios de DLS y HPLC, la estabilidad de los SLN se puede modular dependiendo del nucleolípido utilizado. Es importante destacar que tanto SLN ⁺ y SLN ^- Las formulaciones pueden mejorar drásticamente la solubilidad en agua del sorafenib (concentraciones superiores a 120 μM). Dichos SLN exhiben mejores actividades antitumorales en cuatro líneas de células cancerosas (cánceres de hígado y de mama) en comparación con el sorafenib libre, que está limitado debido a su falta de solubilidad en agua. Las imágenes de microscopía de fase de contraste, registradas en las cuatro líneas de células cancerosas, exhiben una mortalidad celular drástica cuando se incuban con 120 μM de SLN ^- o 84 μM de SLN ⁺ . Por tanto, este fármaco podría utilizarse como las nuevas opciones terapéuticas en el caso de cánceres de hígado (uso de sorafenib en quimioterapia intraarterial, por ejemplo) o cánceres de mama. Hasta donde sabemos, este informe es el primer ejemplo de un estudio que utiliza sorafenib contra los cánceres de mama luminal B que demuestra la utilidad del enfoque SLN. En conjunto, los resultados informados en esta contribución destacan el potencial de los SLN basados ​​en nucleósidos y lípidos como sistemas de administración de fármacos.

Abreviaturas

AFNH ₄ :

Formiato de amonio

DLS:

Dispersión de luz dinámica

FA:

Ácido fórmico

HCC:

Carcinoma hepatocelular

HPLC:

Cromatografía líquida de alto rendimiento

LN:

Nanopartículas lipídicas

MeOH:

Metanol

PDI:

Índice de polidispersidad

RCC:

Carcinoma de células renales

SLN:

Nanopartículas de lípidos sólidos

UHPLC:

Cromatografía líquida de ultra alto rendimiento

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