Nanotransportadores innovadores de nucleósido-lípido mejoran la administración de sorafenib y reducen la toxicidad

Resumen

Aunque la aplicación de sorafenib, un inhibidor de quinasas de tirosina, sigue siendo una opción mundial en quimioterapia, se necesitan nuevas estrategias para abordar su baja solubilidad en agua (< 5 μM), toxicidad y efectos secundarios. En este contexto, el uso de nanotransportadores se investiga para superar estos inconvenientes. En esta contribución, se reporta un nuevo tipo de nanopartículas basadas en sorafenib estabilizadas por nucleósido-lípidos híbridos. Las nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) mostraron valores de potencial zeta negativos o positivos según la carga del nucleósido-lípido. La microscopía electrónica de transmisión de SLN cargadas con sorafenib reveló nanopartículas paralelépipedas de aproximadamente 200 nm. Estudios biológicos en cuatro líneas celulares diferentes, incluyendo cáncer de hígado y mama, revelaron actividades anticancerígenas mejoradas de las SLN basadas en sorafenib comparadas con el fármaco libre. Importante, imágenes de microscopía de contraste de fase registradas tras incubación de células cancerosas con SLN a alta concentración de sorafenib (> 80 μM) revelaron muerte celular total en todos los casos. Estos resultados destacan el potencial de las SLN basadas en nucleósido-lípido como sistemas de administración de fármacos.

Introducción

El sorafenib, comercializado como Nexavar™, es un inhibidor de quinasas hidrofóbico aprobado para el tratamiento de diferentes cánceres humanos, incluyendo carcinoma de células renales avanzado (RCC), carcinoma hepatocelular (HCC) y carcinoma tiroideo avanzado. El sorafenib tiene múltiples blancos de quinasas proteicas, incluyendo receptores transmembrana y quinasas intracelulares de tirosina y serina-treonina, y también induce apoptosis. Su mecanismo de acción inhibe el crecimiento tumoral mediante múltiples blancos, actuando directamente sobre el tumor y/o sobre la angiogénesis tumoral (a través de la inhibición de la señalización VEGFR y PDGFR). Su eficacia inhibiendo el crecimiento de células malignas se ha demostrado en muchos tipos histológicos de cáncer como melanoma, tiroideo, pancreático, carcinoma hepatocelular y leucemia. Sin embargo, la baja solubilidad en agua, la toxicidad y los efectos secundarios limitan su uso en muchas aplicaciones clínicas. Para abordar estos problemas, varias formulaciones de sorafenib están bajo investigación, incluyendo nanopartículas cristalinas líquidas, nanoemulsiones, nanopartículas de silicio poroso modificadas con ciclodextrina, nanocompuestos eluidos de fármacos, nanopartículas basadas en polielectrolitos, o nanopartículas autoensambladas de curcumina. Sin embargo, las nanopartículas lipídicas (LN) cargadas con sorafenib han sido poco investigadas.

Aquí se reporta el primer ejemplo de nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) basadas en sorafenib estabilizadas por nucleósido-lípidos. Estudios cromatográficos en nucleolípidos cargados positiva y negativamente (DOTAU y diC₁₆dT, respectivamente) indican que estos anfifílicos poseen la estabilidad y pureza requeridas para su uso en aplicaciones de administración de fármacos. Un sencillo procedimiento de nanoprecipitación permite la formación de SLN con cargas positivas (SLN⁺) o negativas (SLN⁻) (Fig. 1). Cabe destacar que todas las SLN investigadas mejoraron el efecto citotóxico del sorafenib en diferentes carcinomas humanos, demostrando que las SLN pueden superar las limitaciones del sorafenib en términos de solubilidad acuosa y actividades anticancerígenas.

Métodos

Reactivos y químicos

Metanol (MeOH), ácido fórmico (FA) y formiato de amonio (AFNH₄) se adquirieron de VWR Chemicals (Francia) y eran de grado HPLC. Agua de grado HPLC (resistividad mínima 18,2 MΩ) se produjo internamente con sistema ELGA Millipore (Francia). DOTAU (Número CAS: 868226-06-6) y diC₁₆dT (Número CAS: 1160002-70-9) se sintetizaron en el laboratorio según protocolo reportado en referencias. Sorafenib (Número CAS: 284461-73-0) se compró de SynVec.

Estudios cromatográficos

Se desarrolló un método UHPLC de fase inversa para la cuantificación de nucleolípidos (DOTAU y diC₁₆dT) y sorafenib en SLN. Antes de la inyección en HPLC, las soluciones acuosas de nanopartículas se diluyeron con etanol por factores 5 y 10, para cuantificar nucleolípidos y sorafenib, respectivamente. Se utilizó un sistema cromatográfico UHPLC UltiMate 3000 (Dionex-Thermo Scientific, EE. UU.) con columna Syncronis C18 50 × 2,1 mm, 1,7 μm. La fase móvil consistió en 70/30 MeOH/acetato de amonio 25 mM (pH = 7,4) (A) y acetato de amonio 26,5 mM en MeOH (pH = 7,9) (B). Flujo de 0,2 mL/min, gradiente 0–2 min 0–100 % B; 2–20 min 100 % B. Temperatura de columna 25 °C. Detección a 267 nm para sorafenib y diC₁₆dT y 257 nm para DOTAU. Volumen inyectado 1 μL, límites de cuantificación 0,6 ng para sorafenib y 15 ng para ambos nucleolípidos.

Preparación de nanopartículas de sorafenib

10 mg de sorafenib se disolvieron en 1 mL etanol, y 10 mg de NL (diC₁₆dT o DOTAU) se solubilizaron en 1 mL etanol. 100 μL de NL, 100 μL de solución de sorafenib y 800 μL de etanol se mezclaron a temperatura ambiente y se añadieron gota a gota en 10 mL de agua destilada bajo agitación magnética. La solución se colocó en baño ultrasónico 90 min a 25 °C. El etanol se eliminó al vacío a 30 °C y el volumen se ajustó a 1 mL. Esta solución se sonicó dos veces con sonda ultrasónica de 6 mm (Vibracell 75186) 10 min al 100 % amplitud con pulsos de 2 seg cada 5 seg. 1 mL se dializó contra 30 mL agua destilada 3 × 15 min. El volumen se ajustó a 2 mL y se conservó para caracterización, cuantificación y estudios de estabilidad. También se realizaron experimentos de control con el mismo protocolo sin nucleolípidos.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM y EDX)

Las nanopartículas se visualizaron por microscopía de tinción negativa. 10 μL de nanopartículas se transfirieron a una rejilla de cobre recubierta de carbono por 10 min. La muestra se secó y tiñó con 2,5 % (p/p) acetato de uranilo en agua por 2 min. Los especímenes se observaron con microscopio electrónico Hitachi H 7650. La espectroscopía de rayos X dispersiva en energía se realizó con microscopio electrónico de transmisión TECNAI acoplado con Quantax-X-Flash SVE 6.

Determinación de tamaño de partícula y potencial zeta

El potencial zeta y tamaño de partícula se determinaron usando Zetasizer NanoZS (Malvern). Experimentos con 40 μL de nanopartículas diluidas en 400 μL agua, mediciones a 25 °C.

Análisis de citotoxicidad

HuH7 y HepG2 crecieron en monocapa en DMEM-Glutamax con 10 % suero fetal bovino. MDA-MB-134 y T-47D crecieron en monocapa en RPMI con 10 % suero fetal bovino (para T-47D solo, AA no esenciales 1X, glucosa 0,45 %, insulina 10 mg L⁻¹, piruvato sódico 1X). Todos los reactivos de cultivo de Invitrogen. 10⁴ células/pozo en 90 μL medio completo se sembraron en placa de 96 pozos e incubaron 24 h a 37 °C y 5 % CO₂, antes de añadir 10 μL de SLN o sorafenib en medio de cultivo. Sorafenib se disolvió en medio de cultivo con 0,1 % DMSO. En estas condiciones, la concentración máxima de sorafenib sin precipitación fue 5 μM, mientras que para SLN cargadas con sorafenib la concentración máxima probada fue 120 μM sin DMSO. Tras 4 días de incubación, la viabilidad celular se evaluó con ensayo de proliferación basado en formazan (CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit, Promega), añadiendo 20 μL/pozo de solución reactivo. Tras incubación 30 min a 37 °C, 5 % CO₂, la absorbancia de cada pozo se midió a 492 nm con espectrofotómetro Berthold. Resultados expresados como porcentaje de (OD₄₉₂ células tratadas − OD₄₉₂ blanco) / (OD₄₉₂ células no tratadas − OD₄₉₂ blanco).

Estudios de viabilidad celular

HuH7 se cultivaron como se describió en la sección "Análisis de citotoxicidad". La viabilidad celular se realizó tras 4 días de incubación con SLN⁺ cargadas con sorafenib a diferentes concentraciones (0, 1, 5, 10, 25, 50, 100 μM) usando ensayo de viabilidad célula viva/muerta (Invitrogen). Brevemente, el medio de cultivo se retiró, y las células adherentes se lavaron una vez con solución salina balanceada de Hanks (HBSS). 200 μL de HBSS conteniendo 2 μM éster calceína acetoximetilo y 4 μM homodímero de etidio-1 se añadieron a cada pozo e incubaron 45 min a 37 °C y 5 % CO₂. Tras tinción, las células se lavaron una vez con HBSS e imaginaron microscópicamente en microscopio de fluorescencia invertido. El porcentaje de células muertas se evaluó por análisis de citometría de flujo activado por fluorescencia (FACS). Tras tinción con 4 μM solución de homodímero de etidio-1, las células se trataron con tripsina y lavaron dos veces con tampón fosfato salino (PBS) por centrifugación a 1000 rpm 5 min. Los datos se adquirieron en citómetro de flujo LSRFortessa (Becton Dickinson) y analizaron con software DIVA. Una muestra de células muertas se preparó con 70 % metanol y usó como control.

Resultados y Discusión

Síntesis y caracterización de SLN

La no toxicidad y las propiedades de autoensamblaje de los nucleolípidos los convierten en adyuvantes anfifílicos ideales para encapsular fármacos hidrofóbicos como sorafenib. En este estudio, se desarrolló un sencillo procedimiento de nanoprecipitación para abordar la baja solubilidad en agua del sorafenib y mejorar su actividad anticancerígena, que en muchos casos limita su uso clínico. Respecto a la solubilidad en agua, se hipotetizó que el carácter hidrofóbico, los heterociclos y las funciones de enlace de hidrógeno del sorafenib favorecerían las interacciones con nucleolípidos y la formación de nanoobjetos. También se esperaba que las SLN cargadas con sorafenib aumentaran las actividades antitumorales mejorando la captación celular del sorafenib. De hecho, en un estudio previo sobre nanopartículas de cisplatino, demostramos que la mejora de actividades antitumorales del cisplatino se debía a una mayor cantidad de fármaco internalizado en células cancerosas. Nuestro proceso de nanoprecipitación involucra tres pasos: (i) solubilización de sorafenib en etanol a 40 °C (10 mg/mL sorafenib, 100 μL) y adición de un equivalente de nucleolípido (ya sea un nucleótido-lípido aniónico, diC₁₆-3′-dT [timidina 3′-(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato)] o un nucleósido-lípido catiónico DOTAU [2′,3′-dioleil-5′-desoxi-5′-trimetil-amonio-uridina], 100 μL de solución a 10 mg/mL en etanol; (ii) 1 mL de la solución etanólica se añade gota a gota a temperatura ambiente a 10 mL de agua destilada; (iii) la suspensión resultante se evapora para eliminar el exceso de etanol y se sonica.

Estudios cromatográficos

Para evaluar las capacidades de carga de fármaco de las nuevas formulaciones, se desarrolló un método UHPLC de fase inversa. Usando este método HPLC, la separación simultánea de sorafenib y nucleolípidos se logró en 12 min, permitiendo la cuantificación individual de compuestos en SLN (Archivo adicional 1: Figuras SI1–4).

Se obtuvieron ratios de carga (ratios de masa de sorafenib/nucleolípidos en nanopartículas) de 50 y 80 % y rendimientos de encapsulación de sorafenib alrededor de 55 y 75 % para formulaciones compuestas de sorafenib/DOTAU (SLN⁺) y sorafenib/diC₁₆dT (SLN⁻), respectivamente. Durante el experimento de control realizado en ausencia de nucleolípido, cerca del 90 % de sorafenib se perdió durante los diferentes pasos de formulación probablemente debido a la baja solubilidad del sorafenib en agua. Este resultado demuestra que los nucleolípidos son necesarios para solubilizar el sorafenib y estabilizar las SLN.

Estudios fisicoquímicos

Experimentos de dispersión dinámica de luz (DLS) se realizaron para caracterizar la formación de SLN. Ambos nucleolípidos negativos y positivos (diC₁₆dT y DOTAU) forman nanopartículas no esféricas similares con formas paralelépipedas en solución acuosa con monodispersidad (índice de polidispersidad, PDI = 0,202 y 0,289; tamaño = 335,2 y 304,4 nm, respectivamente, Fig. 2 y Archivo adicional 1: Figura SI7). Como se esperaba, los potenciales zeta de los objetos basados en SLN dependen de las cabezas polares de los nucleolípidos (ζ = +59,1 y −54,9 mV para SLN⁺ y SLN⁻, ver Archivo adicional 1: Figura SI10). La presencia de sorafenib en la NP se validó por imágenes TEM y adquisiciones EDX de una SLN− realizadas con adquisiciones EDX. Fig. 2e, f muestra puntos I y II. El punto I en Fig. 2f muestra la emisión de átomo de cloro (punto I, Fig. 2e, f) indicando la presencia de sorafenib (ver estructura química Fig. 2f). Nótese que el cloro está presente solo en punto I y no en punto II (Fig. 2f).

Importante, en experimentos de control, la nanoprecipitación de sorafenib en ausencia de nucleolípido no dio lugar a ningún nanoobjeto, demostrando que los nucleolípidos permiten la formación y estabilización de las SLN.

Estudios de estabilidad

Las estabilidades coloidales de SLN⁺ y SLN⁻ se midieron por DLS y potencial zeta a dos temperaturas (Fig. 3a y Archivo adicional 1: Figura SI10). En el caso de formulaciones basadas en diC₁₆dT, el tamaño de SLN⁻ no se modificó tras 30 días a 4 y 37 °C indicando alta estabilidad de esas nanopartículas (Archivo adicional 1: Figura SI9). Tal estabilidad puede explicarse por la naturaleza de las interacciones (involucrando enlaces H, apilamiento π-π, interacción carga/carga) entre diC₁₆dT y sorafenib. Sin embargo, para formulaciones basadas en DOTAU, SLN⁺ fueron estables solo a 4 °C por 30 días según estudios DLS (Fig. 3a), mientras que a 37 °C se observó un aumento de tanto tamaño como PDI (Fig. 3a). Esta inestabilidad relativa observada a 37 °C en el caso de SLN⁺ podría explicarse por interacciones coulombianas repulsivas entre las cargas positivas de tanto sorafenib como DOTAU. Interesantemente, los estudios de estabilidad coloidal indican que es posible modular la estabilidad, y por tanto la liberación de sorafenib de las SLN al entorno fisiológico, dependiendo del nucleolípido usado para la estabilización de las SLN. La modulación de estabilidad podría ser atractiva dependiendo de la cinética de liberación necesaria.

En paralelo a la estabilidad coloidal, la estabilidad química de sorafenib, DOTAU y diC₁₆dT en las formulaciones basadas en SLN se investigó en función del tiempo a 4 y 37 °C usando un nuevo método cromatográfico (ver Archivo adicional 1: Figura SI4). Estudios cinéticos a ambas temperaturas se muestran en Fig. 3b y Archivo adicional 1: SI5 para SLN DOTAU y diC₁₆dT, respectivamente. Los resultados muestran que las moléculas de sorafenib y diC₁₆dT en formulaciones permanecen estables al menos 1 mes, indicando estabilidad química a largo plazo a ambas temperaturas en el caso de SLN⁻. Sin embargo, se observó una disminución de DOTAU durante el tiempo en las formulaciones SLN⁺. Primero, a 4 °C, pérdidas de ~12 % en 7 días y 20 % en 30 días se midieron. Al aumentar la temperatura, la estabilidad de DOTAU disminuyó con pérdida de 55 % en 7 días y hasta 95 % en 30 días a 37 °C. Tales diferencias en estabilidad química entre nucleolípidos ya fueron evidenciadas durante estudios previos de estabilidad (ver Archivo adicional 1: Figura SI6).

Estudios biológicos

La citotoxicidad de SLN se evaluó por actividades metabólicas y morfologías de células. Ensayo MTT permitió comparar sorafenib libre (en 0,1 % DMSO) y SLN cargadas con el fármaco (Fig. 4) en cuatro líneas celulares incluyendo dos hepatocarcinomas (HuH7 y HepG2) y dos cánceres de mama luminales (MDA-MB-134 y T-47D). Primero, a concentraciones cercanas a la solubilidad máxima de sorafenib libre (5 μM sorafenib en 0,1 % DMSO, 2,8 μM para nanopartículas sorafenib/DOTAU, y 4 μM para nanopartículas sorafenib/diC₁₆dT), ambas SLN inhibieron la viabilidad celular mejor que sorafenib libre. Como se muestra en Fig. 4b, un estudio de viabilidad celular en células MDA-MB-134 indicó que la actividad de sorafenib libre está limitada por su solubilidad en agua (100 % viabilidad celular a [sorafenib] = 5 μM), mientras que valores IC₅₀ de 15 y 50 μM se observaron para SLN⁺ y SLN⁻, respectivamente (Fig. 4b). En un estudio FACS en HuH7, se obtuvo un IC₅₀ de aproximadamente 50 μM (Archivo adicional 1: Figuras SI12 y SI13). Imágenes de microscopía de contraste de fase muestran efectivamente una densidad reducida de capas celulares tratadas con SLN⁻ y SLN⁺ comparadas con células no tratadas o tratadas con sorafenib sin alteración de la morfología celular (Archivo adicional 1: Figura SI11). Segundo, experimentos similares se realizaron a concentraciones más altas de SLN ([sorafenib] = 120 y 84 μM para SLN⁻ y SLN⁺, respectivamente) y comparados con sorafenib libre en su límite de solubilidad (concentración 5 μM). En estas condiciones, ambas SLN exhiben un fuerte efecto citotóxico en las cuatro líneas celulares cancerosas como se muestra en Fig. 5. Como se revela en imágenes de microscopía de contraste de fase, se observaron restos celulares para ambas SLN⁻ (Fig. 5C1–4) y SLN⁺ (Fig. 5D1–4) atestiguando muerte celular, mientras que las células permanecen vivas en el caso de sorafenib libre (Fig. 5B1–4). Cabe destacar que fuertes efectos citotóxicos para ambas SLN se observaron en el caso de células de cáncer de mama luminal B (Fig. 5C1–2 y D1–2). Tal efecto antitumoral, no reportado antes, abre nuevas posibles aplicaciones terapéuticas del sorafenib gracias a las SLN.

Conclusiones

Reportamos un enfoque novedoso basado en nucleolípidos que permite la encapsulación y administración eficiente de sorafenib. Nuestras investigaciones demuestran la formación de dos tipos de nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) altamente cargadas con sorafenib. Estas SLN, que muestran valores de potencial zeta negativos o positivos, presentan formas paralelépipedas. Como revelan los estudios DLS y HPLC, la estabilidad de las SLN puede modularse dependiendo del nucleolípido usado. Importante, ambas formulaciones SLN⁺ y SLN⁻ son capaces de mejorar dramáticamente la solubilidad en agua del sorafenib (concentraciones superiores a 120 μM). Dichas SLN exhiben mejores actividades antitumorales en cuatro líneas celulares cancerosas (hígado y mama) comparadas con sorafenib libre, limitado por su falta de solubilidad en agua. Imágenes de microscopía de contraste de fase, registradas en las cuatro líneas celulares cancerosas, exhiben una drástica mortalidad celular cuando se incuban con 120 μM de SLN⁻ o 84 μM de SLN⁺. Por tanto, este fármaco podría usarse como nueva opción terapéutica en cánceres de hígado (uso de sorafenib en quimioterapia intraarterial, por ejemplo) o cánceres de mama. A nuestro conocimiento, este reporte es el primer ejemplo de un estudio usando sorafenib contra cánceres de mama luminal B demostrando la utilidad del enfoque SLN. En conjunto, los resultados reportados destacan el potencial de las SLN basadas en nucleósido-lípido como sistemas de administración de fármacos.

Abreviaturas

AFNH₄:

Formiato de amonio

DLS:

Dispersión dinámica de luz

FA:

Ácido fórmico

HCC:

Carcinoma hepatocelular

HPLC:

Cromatografía líquida de alto rendimiento

LN:

Nanopartículas lipídicas

MeOH:

Metanol

PDI:

Índice de polidispersidad

RCC:

Carcinoma de células renales

SLN:

Nanopartículas de lípidos sólidos

UHPLC:

Cromatografía líquida de ultra alto rendimiento