Estimulación de la luminiscencia de punto cuántico de CdSe / ZnS recubierto de cisteína por meso-Tetrakis (p-sulfonato-fenil) porfirina

Resumen

La interacción entre las porfirinas y los puntos cuánticos (QD) a través de la transferencia de energía y / o carga suele ir acompañada de una reducción de la intensidad y la vida útil de la luminiscencia QD. Sin embargo, para las soluciones de agua CdSe / ZnS-Cys QD, mantenidas a 276 K durante 3 meses (QD envejecido), el aumento significativo en la intensidad de luminiscencia con la adición de meso -tetrakis (p-sulfonato-fenil) porfirina (TPPS ₄ ) se ha observado en este estudio. La agregación de QD durante el almacenamiento provoca una reducción en el rendimiento cuántico y la vida útil de su luminiscencia. Utilizando técnicas de fluorescencia de estado estable y de resolución temporal, demostramos que TPPS ₄ estimuló la desagregación de CdSe / ZnS-Cys QD envejecido en soluciones acuosas, aumentando el rendimiento cuántico de su luminiscencia, que finalmente alcanzó el de la QD recién preparada. La desagregación tiene lugar debido al aumento de la repulsión electrostática entre QD en su unión con moléculas de porfirina cargadas negativamente. La unión de solo cuatro moléculas de porfirina por QD fue suficiente para la desagregación total de QD. El análisis de las curvas de desintegración de luminiscencia QD demostró que la disgregación más fuerte afectaba la luminiscencia relacionada con la aniquilación del agujero de electrones en la capa QD. Los resultados obtenidos demuestran la forma de reparar la QD envejecida mediante la adición de algunas moléculas o iones a las soluciones, estimulando la desagregación de QD y restaurando sus características de luminiscencia, que podrían ser importantes para aplicaciones biomédicas de QD, como la bioimagen y el diagnóstico de fluorescencia. Por otro lado, la desagregación es importante para las aplicaciones de QD en biología y medicina, ya que reduce el tamaño de las partículas facilitando su internalización en células vivas a través de la membrana celular.

Antecedentes

Los nanocristales semiconductores coloidales o puntos cuánticos (QD) debido a sus características específicas, una amplia absorción intensa y espectros de luminiscencia estrechos con la posición máxima dependiente del tamaño y alta termoestabilidad y fotoestabilidad [1, 2], encuentran aplicaciones en varios campos de la tecnología moderna, tales como como diagnóstico e imágenes médicas, nanodispositivos informáticos modernos, sondas fluorescentes para aplicaciones bioanalíticas, generación de hidrógeno fotoelectroquímico, etc. ([3, 4, 5, 6, 7] y sus referencias). La funcionalización de la superficie QD con moléculas orgánicas permite incrementar su solubilidad en agua, reducir su toxicidad y aumentar su biocompatibilidad, preparando QD con afinidad selectiva por las estructuras deseables de los organismos vivos [8]. Por lo tanto, la QD atrae un interés especial para aplicaciones en biología [5] y medicina [6], donde podrían aplicarse con éxito como sondas fluorescentes (FP) para diagnósticos de fluorescencia (FD) [9] y fotosensibilizadores (PS) para fotoquimioterapia (PCT). [10]. La absorción intensa en una amplia región espectral convierte a QD en una antena eficaz para la acumulación de energía luminosa, y la banda de luminiscencia estrecha intensa facilita la transferencia de energía al correspondiente PS, aumentando así la eficiencia de la utilización de la energía luminosa y, en consecuencia, aumentando la eficacia del PS [7, 11]. . Esto hace que los pares (QD + PS) sean prometedores para su aplicación en FD y PCT y estimula los estudios en la interacción QD y FS, especialmente en la transferencia de energía y carga entre ellos.

Entre otros, recubiertos de cisteína (CdSe / ZnS) QD ((CdSe / ZnS) -Cys QD) y meso -tetrakis (p-sulfonato-fenil) porfirina (TPPS ₄ ) atraen un interés especial por las siguientes razones:un tamaño pequeño de QD recubierto de cisteína (QD-Cys) que aumenta su movilidad y la probabilidad de penetrar la membrana celular, su alta estabilidad química, baja adsorción inespecífica y alto rendimiento cuántico de luminiscencia [ 12, 13]. Por otro lado, TPPS sintético ₄ La porfirina es un PS prometedor ya que es fotoactivo, soluble en agua y no tóxico y ya ha sido probado en clínicas para su aplicación en terapia fotodinámica (TFD) demostrando características esperanzadoras [14, 15].

Interacción entre TPPS ₄ y QD a través de transferencia de energía y / o carga ya ha sido documentado [16]. Por lo general, estos procesos van acompañados de una reducción de la intensidad y la vida útil de la luminiscencia QD. Un proceso más que causa la auto-extinción de la luminiscencia en QD es la autoagregación a través de interacciones electrostáticas o formación de enlaces de hidrógeno, en muchos casos, lo que hace que el proceso de agregación sea reversible [17].

En este trabajo, informamos por primera vez sobre la estimulación de la luminiscencia QD a través de la interacción con la porfirina en el ejemplo de (CdSe / ZnS) -Cys QD y TPPS ₄ porfirina.

Experimental

Preparación de (CdSe / ZnS) -Cys Quantum Dots

Las (CdSe / ZnS) -Cys QD se sintetizaron de acuerdo con el método adaptado de [18]. El método incluye lo siguiente:(1) síntesis de nanocristales de núcleo de CdSe hidrófobos coloidales y (2) crecimiento de una capa de ZnS epitaxial alrededor del núcleo de CdSe. Para funcionalizar QD con cisteína, el CdSe / ZnS core-shell QD resultante (~ 3,0 mg) se purificó a partir de TOPO mediante la dispersión triple en cloroformo (500 ml) y la precipitación con metanol (800 ml). Los QD purificados se redispersaron en cloroformo (1,0 ml). DL-Cisteína en metanol (30 mg mL ^{- 1} , 200 ml) se añadió gota a gota a la dispersión QD y se mezcló vigorosamente seguido de centrifugación (10.000 rpm, 5 min), eliminando el cloroformo. Después de lavar con metanol para eliminar el exceso de DL-Cisteína mediante centrifugación (16.000 rpm, 10 min, 3 veces), el precipitado QD se secó al vacío y se volvió a dispersar en agua Milli-Q con NaOH 1 M (20 ml) gota a gota. adición y filtrado con filtro de jeringa Anotop 25 Plus (0.02 μm, Whatman).

Preparación de muestras de porfirina + (CdSe / ZnS) -Cys QD

El TPPS ₄ La porfirina se obtuvo de Midcentury Chemicals (EE. UU.) y se usó sin purificación adicional. Las soluciones experimentales se prepararon en tampón fosfato (pH 7,3; 7,5 mM), utilizando agua de calidad Milli-Q. Para las mediciones de luminiscencia en (CdSe / ZnS) -Cys QD mantenido a 276 K durante 3 meses (QD envejecido), alícuotas de un TPPS concentrado ₄ solución madre ([TPPS ₄ ] _stock =140 μM) a la solución inicial de (CdSe / ZnS) -Cys QD, evitando efectos de dilución. Para el experimento de dilución QD envejecido, se reemplazaron alícuotas de la solución inicial por la misma cantidad de tampón fosfato. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (297 K).

La concentración de TPPS ₄ fue controlado espectrofotométricamente usando ε _515nm =1,3 × 10 ⁴ M ^{- 1} cm ^{- 1} [19]. La concentración del punto cuántico envejecido (CdSe / ZnS) -Cys se calculó utilizando el primer pico de absorción excitónica a 520 nm utilizando ε =5857 ( D ) ^2,65 según el cálculo empírico de Yu [20], donde D (nm) es el diámetro del nanocristal dado. La D El valor se determinó a partir de la función de ajuste empírico de la curva como se presenta en [20]. Para los nanocristales de CdSe, esta función es:

$$ D =\ left (1.6122 \ times {10} ^ {- 9} \ right) {\ lambda} ^ 4- \ left (2.6575 \ times {10} ^ {- 6} \ right) {\ lambda} ^ 3+ \ left (1.6242 \ times {10} ^ {- 3} \ right) {\ lambda} ^ 2- (0.4277) \ lambda + (41.57) $$ (1)

En nuestro caso, λ =520 nm, D =2.6 nm y ε =7,4 × 10 ⁴ M ^{- 1} cm ^{- 1} .

Instrumentos

Los espectros de absorción se controlaron con un espectrofotómetro Beckman Coulter DU640. Las mediciones de luminiscencia en estado estable se realizaron en un espectrofluorímetro Hitachi F-7000 en λ _ex =480 nm y λ _em =558 nm. El rendimiento cuántico de luminiscencia QD envejecido (QY) se determinó mediante el método relativo [21] con una medición de un solo punto, λ _ex =480 nm y λ _em =558 nm, usando 1-palmitoílo, 2- (12- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) amino] dodecanoil) -sn-glicero-3-fosfocolina (C12 -NBD-PC) como estándar (QY =0,34 en etanol) [22, 23] según la ecuación:

$$ {\ Phi} _ {fl} ={\ Phi} _ {fl0} \ frac {n ^ 2 {I} _ {fl}} {n_0 ^ 2 {I} _ {fl0}} \ frac {A_0} {A} $$ (2)

donde yo _fl y yo _fl0 son las intensidades de fluorescencia integral de QD y C12-NBD-PC, A y A ₀ son sus absorbancias en λ _ex =480 nm y n y n ₀ son índices de refracción de los disolventes utilizados, respectivamente.

Los experimentos de resolución temporal se llevaron a cabo utilizando un aparato basado en el método de recuento de fotones individuales correlacionados en el tiempo. La fuente de excitación fue un láser de titanio-zafiro Tsunami 3950 Spectra Physics, bombeado por un láser de estado sólido Millenia X Spectra Physics. La frecuencia de repetición del pulso láser fue de 8,0 MHz utilizando el selector de pulsos 3980 Spectra Physics. El láser se sintonizó de modo que el cristal BBO del segundo generador de armónicos (GWN-23PL Spectra Physics) diera pulsos de excitación de 480 nm que se dirigieron a un espectrómetro Edinburgh FL900. El espectrómetro estaba en configuración de formato L, la longitud de onda de emisión se seleccionó mediante un monocromador y los fotones emitidos se detectaron mediante un fotomultiplicador de placa de microcanal Hamamatsu R3809U refrigerado. El ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) de la función de respuesta del instrumento fue típicamente de 100 ps, y la resolución de tiempo fue de 12 ps por canal. El software proporcionado por Edinburgh Instruments y el software comercial "OriginPro9" se utilizaron para ajustar las curvas de disminución de luminiscencia experimentales.

La calidad del ajuste se evaluó mediante el análisis del parámetro estadístico reducido- χ ² y mediante inspección de la distribución de residuos.

La dispersión dinámica de la luz se midió con el analizador de tamaño de partículas NanoBrook 90Plus Zeta con excitación a 640 nm utilizando un láser HeNe de 40 mW (Brookhaven Instruments Corporation).

Resultados y discusión

(CdSe / ZnS) -Cys QD recién preparado posee el máximo del espectro de luminiscencia a 558 nm (Fig. 1, línea negra), como informaron previamente Liu et al. [13] y rendimiento cuántico (QY) 0,75 [2, 24, 25]. La adición de TPPS ₄ a la solución fresca no induce cambios, tanto en la intensidad de luminiscencia QD como en el perfil del espectro de luminiscencia.

Para (CdSe / ZnS) -Cys QD disuelto en agua y mantenido en el frigorífico a 276 K durante 3 meses (QD envejecido), la posición del máximo del espectro de luminiscencia, medido en tampón fosfato (7,5 mM) a pH 7,3, se desplazó al azul durante 2 nm ( λ _máx =556 nm), en comparación con el de QD fresco. La banda de emisión apareció ensanchada y ligeramente asimétrica (Fig. 1, línea roja). El rendimiento cuántico de la luminiscencia QD envejecida, determinada por el método descrito anteriormente, fue de 0,23 ± 0,03.

La adición de TPPS ₄ a la solución de QD envejecida indujo un aumento significativo en la intensidad de luminiscencia (Fig. 2a), el valor de QY alcanzó 0,75 ± 0,08 (Fig. 2a, recuadro), el valor cercano al de QD fresco [2, 24, 25].

Además, en presencia de TPPS ₄ , se observó la simetrización de la banda de luminiscencia del QD envejecido y la reducción de su ancho de banda, acompañada de un corrimiento máximo al rojo hasta λ _máx =559 nm, cerca del máximo del espectro QD nuevo (Fig. 1, línea azul).

Las curvas de disminución de luminiscencia obtenidas a 480 nm de excitación para soluciones de QD tanto frescas como envejecidas se ajustaron sucesivamente como una suma de tres exponenciales:

$$ I ={I} _ {0_1} {e} ^ {- t / {\ tau} _1} + {I} _ {0_2} {e} ^ {- t / {\ tau} _2} + {I } _ {0_3} {e} ^ {- t / {\ tau} _3} $$ (3)

donde \ ({I} _ {0_i} \) y τ _i son el factor preexponencial (amplitud) y la vida útil del i -ésimo componente de desintegración, respectivamente.

La vida útil de los componentes para QD tanto fresca como añejada es independiente de la presencia de porfirina (Tabla 1). La vida útil de la luminiscencia de las soluciones frescas de QD son típicas para (CdSe / ZnS) -Cys QD [26, 27]. Para QD envejecido, la vida útil de los componentes es mucho más corta (Tabla 1).

Los valores de τ ₁ en todos los casos, QD frescos y envejecidos en presencia y ausencia de porfirina, están cerca de la resolución temporal del equipo de conteo de fotón único (≈ 100 ps) usado en este estudio. Por lo tanto, debe asociarse con la luz dispersa del pulso excitante.

Está bien establecido [28,29,30] que los efímeros ( τ ₂ ) y de larga duración ( τ ₃ ) componentes están asociados con la luminiscencia resultante de la aniquilación del agujero de electrones en el núcleo QD ( τ ₂ ) y shell ( τ ₃ ), respectivamente. La intensidad total de estos dos componentes caracteriza todo el proceso de aniquilación en el QD. En este caso, la intensidad relativa (amplitud) del τ ₃ El componente debe demostrar la contribución de la aniquilación del agujero de electrones en la capa QD. La contribución relativa I ₃ del tercer componente de la curva de caída se calculó como:

$$ {I} _3 =\ frac {I_ {0_3}} {I_ {0_2} + {I} _ {0_3}} $$ (4)

La adición de TPPS ₄ a las soluciones QD frescas no cambia significativamente el contenido relativo de los componentes (datos no mostrados), mientras que para las soluciones QD envejecidas, el contenido relativo de τ ₃ componente I ₃ aumenta con el TPPS ₄ concentración (Fig. 2b, recuadro). La dependencia de QY para la luminiscencia de puntos cuánticos envejecidos en el TPPS ₄ la concentración es similar a la de I ₃ (Fig. 2a, b, recuadros), ambos alcanzando los valores máximos aproximadamente a 2,0 μM TPPS ₄ . Esto significa que TPPS ₄ La interacción con QD envejecida afecta más a la luminiscencia de la cáscara QD que a la de su núcleo. Sin embargo, TPPS ₄ en soluciones QD frescas no demuestra ningún efecto sobre la luminiscencia QD. Por lo tanto, concluimos que el TPPS ₄ El efecto observado para la solución QD envejecida no puede explicarse por la unión de la porfirina a la superficie QD.

Por otro lado, el aumento observado de la intensidad de luminiscencia QD envejecida en la interacción con TPPS ₄ no se puede explicar a través de la transferencia de energía inversa desde TPPS ₄ a QD, ya que el TPPS ₄ el espectro de fluorescencia se localiza en el rango λ > 600 nm donde la absorción QD es débil (archivo adicional 1:Figura S3). Por lo tanto, la transferencia de energía a través del mecanismo de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) es poco probable. Además, la luminiscencia QD se excitó a 460 o 480 nm, donde TPPS ₄ la absorción óptica es insignificante. Además, los espectros de absorción de TPPS ₄ permaneció sin cambios en las soluciones mezcladas, demostrando la ausencia de transferencia de carga entre QD y TPPS ₄ (Archivo adicional 1:Figura S4b, c).

La capacidad de los puntos cuánticos para agregarse mediante la formación de enlaces de hidrógeno NH ··· H no covalentes entre los grupos de superficie QD ya estaba documentada [13, 17]. La agregación reduce la luminiscencia QD, apagando con mayor eficacia el componente atribuido a la capa QD [13, 17]. La reducción de la intensidad de luminiscencia QD y la vida útil se observó para CdSe-QD en películas sólidas debido a la formación de agregados 3D [31]. Los autores propusieron un modelo, donde esta reducción está asociada con la transferencia de energía entre QD individuales en el agregado [32].

Sobre la base de esta evidencia, creemos que mientras está en el refrigerador, QD se agrega, lo que reduce la intensidad de la luminiscencia y la vida útil. Por lo tanto, asociamos el aumento observado en la intensidad de la luminiscencia QD y la vida útil en presencia de TPPS ₄ con desagregación QD, estimulado por TPPS ₄ en su unión con el agregado. Se observó un efecto similar para la emisión de QD agregada en su interacción con iones de flúor [17].

Los cambios observados en el perfil de la banda de luminiscencia para QD envejecido (Fig. 1) pueden explicarse por la agregación QD, así como su asimetría se asocia con la existencia de diferentes tipos de agregados. Interacción con TPPS ₄ reduce la agregación y hace que el perfil de la banda de luminiscencia sea similar al de QD no agregado, observado en soluciones frescas.

A pH neutro, la superficie QD-Cys posee carga neta negativa debido a la desprotonación de los grupos amino terminales en su superficie [17, 33, 34]. A este pH, TPPS ₄ tiene carga neta (4-) debido a cuatro grupos sulfonato fenilo cargados negativamente en su estructura ([35, 36] y referencias allí). Por lo tanto, la interacción entre los grupos de cisteína QD y TPPS ₄ moléculas es poco probable debido a la repulsión electrostática. Sin embargo, la alta afinidad del sistema conjugado π de porfirina por las superficies metálicas está bien documentada [37]. Esta afinidad debería ser responsable de TPPS ₄ unión en la superficie de los puntos cuánticos, a pesar de la repulsión electrostática entre los grupos laterales QD y porfirina. La interacción entre la superficie QD y el sistema π-conjugado de la porfirina unida podría explicar la ampliación débil del espectro de fluorescencia de la porfirina (Figs.1, 3 y archivo adicional 1:Figura S3a, recuadro) y cambios observados en el espectro de excitación de fluorescencia (Adicional archivo 1:Figura S5b, recuadro) [38].

La unión de algunas moléculas de porfirina en la superficie QD aumenta la carga negativa de la superficie QD, aumentando así la repulsión electrostática entre partículas e induciendo su desagregación (Esquema 1) [39].

El área de superficie QD A _QD ≈ 145 nm ² es suficiente para adsorber varios TPPS ₄ moléculas ( A _TPPS4 ≈ 1.8 nm ² por unidad) [40], como se observó en las porfirinas que interactúan con nanopartículas magnéticas y de oro [41, 42].

Para cubrir toda el área de QD por porfirinas, son necesarias 80 moléculas de porfirina por QD individual. Sin embargo, la saturación de la luminiscencia QY y I ₃ Se observaron valores en solución QD de 570 nM a aproximadamente [TPPS ₄ ] =2,0 µM (Fig. 2), lo que demuestra que la unión de cuatro moléculas de porfirina por QD es suficiente para la desagregación QD. Esto podría explicarse por una mayor densidad de carga en la molécula de porfirina en comparación con la de QD (archivo adicional 1:Figura S6) que produce una repulsión electrostática más fuerte entre QD con porfirinas unidas. De hecho, el potencial Zeta para el QD envejecido (ζ _QD ) es - 36,1 mV y el de TPPS ₄ molécula (ζ _TPPS4 ) es - 37,6 mV. Densidad de carga promedio, calculada como σ =ζ / A _QD , para un QD de edad individual es

σ _QD =- 36,1 mV / 145 nm ² =- 0,25 mV / nm ² .

Al mismo tiempo, para un QD de edad individual vinculado con cuatro TPPS ₄ moléculas, la densidad de carga promedio (σ _{QD + TPPS4} ) es

σ _{QD + TPPS4} =- (36,1 + 37,6 × 4) mV / 145 nm ² =- 1,29 mV / nm ² .

Por lo tanto, la unión de cuatro TPPS ₄ Las moléculas con un QD envejecido individual aumentan su σ más de 5 veces, aumentando la fuerza de repulsión electrostática más de 25 veces e induciendo la desagregación del QD envejecido.

De acuerdo con la hipótesis de agregación QD, un efecto similar al inducido por TPPS ₄ La adición debe observarse a la dilución de las soluciones QD envejecidas. Realmente, hemos observado el aumento en el QY de la luminiscencia QD a la dilución de su solución tampón (Fig. 4a, recuadro), lo que demuestra que la auto-extinción de la luminiscencia QD en soluciones envejecidas de QD-Cys depende de la concentración de QD [17] . Simultáneamente, el I ₃ El valor en la cinética de luminiscencia QD también aumenta con la dilución (Fig. 4b, recuadro).

Además, los experimentos de dispersión de luz dinámica muestran que D _hd de partículas dispersas en las soluciones QD después del envejecimiento fue (330 ± 170) nm, que es mucho más grande que la QD fresca. La dilución reduce D _hd hasta (25 ± 6) nm, demostrando así directamente la desagregación QD (Archivo adicional 1:Tabla S1).

Existe un aspecto más interesante del problema:¿se puede agregar TPPS ₄ a la solución de QD fresca prevenir su agregación durante el almacenamiento a baja temperatura, estabilizando así sus características de luminiscencia? Sin embargo, la aclaración de este problema necesita un estudio independiente y detallado utilizando varios métodos experimentales y condiciones experimentales variables, como concentraciones de reactivo, temperatura, duración del almacenamiento de la solución (varios meses), etc. futuro.

Conclusiones

Basándonos en los datos obtenidos, podemos afirmar que el almacenamiento prolongado de CdSe / ZnS-Cys QD en soluciones acuosas incluso a bajas temperaturas induce su agregación, lo que reduce el rendimiento cuántico de luminiscencia y la vida útil. La adición de TPPS ₄ la porfirina estimula la disgregación de CdSe / ZnS-Cys QD envejecido, que se manifiesta mediante el aumento del rendimiento cuántico de luminiscencia QD y la contribución de la aniquilación del agujero de electrones en la capa QD en la luminiscencia QD total. La desagregación, estimulada por la porfirina, tiene lugar debido al aumento de la repulsión electrostática entre QD agregados en su unión con moléculas de porfirina cargadas negativamente. También se ha observado desagregación en la dilución de la solución QD.

Los resultados obtenidos demuestran la forma de reparar el QD envejecido agregando algunas moléculas o iones a las soluciones, estimulando la desagregación del QD y restaurando sus características de luminiscencia, que podrían ser importantes para aplicaciones biomédicas de QD, como la bioimagen y el diagnóstico de fluorescencia. Por otro lado, la desagregación es importante para las aplicaciones de QD en biología y medicina, ya que reduce el tamaño de las partículas facilitando su internalización en células vivas a través de la membrana celular.

Abreviaturas

C12-NBD-PC:: 1-Palmitoil, 2- (12- [N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) amino] dodecanoil) -sn-glicero-3-fosfocolina
FD:: Diagnóstico de fluorescencia
FP:: Sondas fluorescentes
FWHM:: Ancho completo a la mitad del máximo
PCT:: Fotoquimioterapia
PDT:: Terapia fotodinámica
PD:: Fotosensibilizadores
QD:: Puntos cuánticos
QD-Cys:: QD recubierto de cisteína
QY:: Rendimientos cuánticos
TOPO:: Óxido de trioctilfosfina
TPPS ₄ ₄ :: meso -tetrakis (p-sulfonato-fenil) porfirina

Crecimiento directo de un diodo emisor de luz amarillo a base de nanocables de nitruro III en cuarzo amorfo utilizando una capa intermedia fina de Ti Modulador de electroabsorción de polarización de plasma superficial insensible a la polarización basado en óxido de estaño indio Epsilon-Near-Zero

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