SOX2 Modula la Vía CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 para Controlar Proliferación y Autorrenovación de Células Madre de Cáncer Cervical

Resumen

Se ha presentado el papel de ARN no codificantes largos (lncARN) en cáncer cervical (CC). Nuestro objetivo es discutir el efecto de región determinante del sexo caja Y 2 (SOX2)/lncARN transcripción asociada a cáncer de colon 1 (CCAT1)/microARN-185-3p (miR-185-3p)/proteína caja horquilla 3 (FOXP3) en proliferación y capacidad de autorrenovación de células madre de CC. Se probaron expresiones de miR-185-3p, SOX2, CCAT1 y FOXP3 en tejidos y células CC. Se verificó relación entre expresión SOX2/CCAT1 y características clinicopatológicas en pacientes CC. Se realizaron investigaciones de pérdida y ganancia de función en células CD44⁺HeLa para discutir funciones biológicas y capacidad de autorrenovación. Finalmente, se verificaron relaciones entre SOX2, CCAT1, FOXP3 y miR-185-3p. La expresión miR-185-3p disminuyó, mientras SOX2, CCAT1 y FOXP3 aumentaron en tejidos y células CC. Expresiones SOX2 y CCAT1 vinculadas a tamaño tumoral, metástasis ganglionar y estadio FIGO de CC. Down-regular SOX2 o CCAT1 y up-regular miR-185-3p resultó en inhibición de proliferación, invasión, migración y número de esferas celulares así como aceleración apoptosis de células CD44⁺HeLa. SOX2 pudo unir a CCAT1 afectando expresión miR-185-3p, y FOXP3 fue diana de miR-185-3p.

Introducción

El cáncer cervical (CC) es la cuarta causa mayor de mortalidad en mujeres con 570.000 casos estimados y 311.000 muertes mundiales en 2018 [1]. Esta enfermedad compleja participa de variedad de factores, incluyendo efectos genéticos e infección viral [2]. Con desarrollo de co-testing VPH y vacunación VPH, procedimientos diagnósticos tempranos de displasia cervical y cáncer resultan en reducción incidencia, morbilidad y mortalidad CC [3]. Para pacientes CC temprano, cirugía recomendada, como cirugía conservadora fertilidad, biopsia cónica, traquelectomía radical, disección ganglios pélvicos, radioterapia pélvica y braquiterapia [4]. Debido a metástasis o recurrencia en pacientes CC avanzado, pronóstico sigue pobre [5]. Por tanto, sigue urgente identificar nuevos marcadores pronósticos efectivos y estrategias terapéuticas para mejorar tratamiento CC.

La región determinante del sexo caja Y 2 (SOX2) es miembro crítico de familia factor transcripción SOX y se manifiesta principalmente en células madre embrionarias y adultas y también expresada en células madre tumorales [6]. Se reveló que SOX2 modula radiorresistencia en CC vía vía señalización hedgehog [7]. Otro estudio demostró que SOX2 es crucial para mantener subpoblación células madre cancerosas en líneas celulares CC [8]. Los ARN no codificantes largos (lncARN) son clase de moléculas ARN con 200 nucleótidos longitud [9]. LncARN transcripción asociada a cáncer de colon 1 (CCAT1) ubicada en cromosoma humano 8q24.21 y considerada "punto caliente" resultando mutaciones genéticas en cáncer colon [10]. Un estudio reportó CCAT1 acelera proliferación e invasión células CC [11]. Según Jia et al., CCAT1 mejora dramáticamente proliferación, migración e invasión células CC [12]. Además, otro estudio reveló CCAT1 aumenta grado maligno enfermedad inflamatoria intestinal vía ruptura barrera intestinal reduciendo microARN-185-3p (miR-185-3p) [13]. El miARN puede controlar reversamente expresión génica reduciendo ARNm y suprimiendo traducción [14]. Experimentos in vitro en estudio previo revelaron miR-185-3p modula radiorresistencia carcinoma nasofaríngeo [15]. Otro estudio implicó miR-185 participado en resistencia cisplatino cáncer ovario in vivo e in vitro [16]. La proteína caja horquilla 3 (FOXP3) es factor transcripción perteneciente a familia proteínas FOX, hallada primero en células T reguladoras (Treg) y sirviendo papel vital en mantenimiento y proceso Treg [17]. Un estudio reporta FOXP3 conectado a linfangiogénesis CC [18]. Otro revela nivel FOXP3 dramáticamente vinculado a estadio FIGO y tamaño tumoral CC [19]. En este estudio, examinamos efectos del eje SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 en proliferación y capacidad autorrenovación células madre CC.

Materiales y Métodos

Aprobación Ética y Consentimiento Participación

Experimentos con humanos implementados cumpliendo principios Declaración Helsinki. Estudio aprobado por Junta Revisión Institucional Primer Hospital Universidad Jilin. Todos participantes firmaron consentimiento informado.

Sujetos Estudio

Diciembre 2016 a diciembre 2018, 39 casos tejidos CC y normales adyacentes cosechados de pacientes CC y preservados en nitrógeno líquido. Criterios inclusión: (1) Pacientes confirmados CC por patología biopsias transcervical y canales cervicales, citología frotis cervical, prueba yodo cervical, espéculo vaginal y resección vértebra cervical. (2) Pacientes sin radioterapia ni quimioterapia 2 semanas previo operación. Criterios exclusión: (1) pacientes sometidos radioterapia o quimioterapia, (2) pacientes en desacuerdo con recolección muestra, (3) pacientes con trastornos sistema inmune.

Selección y Cultivo Celular

Líneas celulares CC (SiHa, HeLa, CaSki, HCC94, C33A) y línea celular epitelial cervical inmortalizada H8 compradas de Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). Células CC SiHa, HeLa, HCC94 cultivadas en DMEM alta glucosa con 10 % FBS, mientras CaSki, C33A, H8 en medio RPMI-1640 con 10 % FBS (37℃, 5 % CO₂). Células desprendidas y subcultivadas cada 2 días.

Ordenación Células Madre CC (Células CD44⁺HeLa)

Células madre CC separadas de línea HeLa por cultivo suspensión celular. Células CC HeLa cultivadas en medio IMDM libre suero en placa Petri ultra-baja adhesión 21 d con medio semicuantitativamente intercambiado cada 3-5 d. Algunas células suspendidas en esferas, obteniéndose células formadoras esferas HeLa (SFCs). Propiedad células esféricas identificada y analizada. Células desprendidas tripsina y ajustadas 1 × 10⁶ células/mL. Células añadidas anticuerpo CD44 y ordenadas por citometría flujo. Células HeLa CD44 positivas = células madre tumorales HeLa, negativas = no madre. Células madre CC cultivadas en DMEM/F12 con 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF y B27. Medio contenía 1 % penicilina y estreptomicina [20].

Tratamiento Celular

Células CD44⁺HeLa transfectadas con sh-SOX2, sh-SOX2 control negativo (NC), sh-CCAT1, sh-CCAT1 NC, mimic miR-185-3p, mimic NC, sh-CCAT1 e inhibidor miR-185-3p así como sh-CCAT1 e inhibidor NC. Todas secuencias oligonucleótidos suministradas por GenePharma (Shanghai, China). Desprendidas tripsina, células sembradas en placa 6 pozos 3 × 10⁶ células/pozo. Al alcanzar 60 % confluencia, cambiadas a medio libre suero e incubadas 1 h. Transfección facilitada por reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA).

Reacción en Cadena de Polimerasa con Transcripción Inversa Cuantitativa (RT-qPCR)

ARN en tejidos y células extraído por Trizol (Invitrogen). ARN (1 μg) revertido a cDNA por kit RTase virus leucemia murino moloney (Invitrogen). cDNA añadido a sistema PCR tiempo real. Iniciadores diseñados por Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) (Tabla 1). U6 control carga miR-185-3p, GAPDH de SOX2, CCAT1, FOXP3. Resultados analizados por método 2^−ΔΔCt.

Ensayo Western Blot

Proteína total en células y tejidos extraída. Concentración proteica determinada por kits ácido bicinconínico (AmyJet Scientific, Wuhan, Hubei, China). Proteína mezclada con búfer carga y hervida 5 min, seguido baño hielo y centrifugación. Proteína tratada con electroforesis gel poliacrilamida dodecilsulfato sódico 10 % y transferida a membrana. Membrana bloqueada 5 % leche desnatada 1 h, sondada con anticuerpos primarios SOX2 (1:1000, Jiangsu Rui sitan Co., Ltd., Jiangsu, China), FOXP3 (1:1000, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA), GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) y re-sondada con anticuerpo secundario marcado peroxidasa rábano picante, cubierta film preservativo y expuesta. Imagenador Bio-rad Gel Doc EZ (Bio-rad, California, USA) adoptado para revelado. Imágenes proteicas analizadas por software ImageJ2x.

Ensayo Kit Conteo Celular (CCK)-8

Ensayo CCK-8 implementado con kits (Beyotime, Shanghai, China). Células (1 × 10⁴) sembradas en placa 96 pozos e incubadas. Cultivadas 0, 24, 48, 72 h, añadidas 10 μL/pozo solución CCK-8 e incubadas 1 h. Valor densidad óptica determinado con lector microplacas Multiskan Spectrum longitud onda completa a 450 nm. Seis pozos tomados para promediar valor. Curva crecimiento celular trazada con tiempo como ordenada y viabilidad celular relativa como ordenada. Valor DO representó proliferación celular.

Citometría Flujo

Células (1 × 10⁶) centrifugadas 1500 r/min, suspendidas 200 μL búfer unión, incubadas 5 μL yoduro propidio (PI) y 5 μL Annexin V-fluoresceína isotiocianato (FITC) turno y añadidas 400 μL búfer. Tasa apoptosis verificada por citómetro flujo (BD Biosciences, NJ, USA).

Prueba Rayado

Células transfectadas desprendidas y preparadas en suspensión. Suspensiones (1 × 10⁶ células/mL) sembradas en placa 6 pozos y cultivadas 80-90 % confluencia. Rayados transversales y longitudinales en placa 6 pozos hechos uniformemente por punta pipeta aséptica 10-μL junto a regla. Medio original reemplazado por medio completo, células cultivadas continuamente. Migración observada bajo microscopio 0 h y 72 h y fotografiada mismo sitio.

Ensayo Transwell

Células transfectadas tripsinizadas, centrifugadas 1000 g y enjuagadas DMEM. Cámara Transwell totalmente hidratada colocada en placa 24 pozos con 10 % FBS-DMEM (600 mL/pozo). Suspensión celular (5 × 10⁵ células/mL, 200 μL) añadida cámara superior Transwell (recubierta 1:8 Matrigel 80 μL), mientras 500 μL 20 % FBS-DMEM a cámara inferior. Células cultivadas 24 h, fijadas 500 μL 4 % paraformaldehído (PFA) y teñidas solución tinción violeta cristal 0,1 %. Células en superficie y borde cámara superior limpiadas con hisopo algodón. Cinco campos seleccionados aleatoriamente, células contadas bajo microscopio Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon, Japón).

Ensayo Formación Esferas

Células sembradas en placa 6 pozos baja adsorción con medio suspensión libre suero 200 células/pozo. Tras 2 semanas, tasa formación esferas observada bajo microscopio Nikon Eclipse TE2000-S (Nikon), y tasa calculada como promedio número esferas/número células sembradas × 100 %.

Ensayo Inmunoprecipitación Cromatina (ChIP)

Ensayo ChIP operado con kit ChIP (Upstate, NY, USA). Anticuerpos SOX2 (1:1000, Re-stem Biotech, Jiangsu, China) e IgG conejo normal (12-370, Millipore, USA) usados para inmunoprecipitar complejo proteína-ADN entrecruzado. Células CD44⁺HeLa fijadas 1 % PFA e incubadas producir entrecruzamiento ADN-proteína. Luego, ADN cortado en fragmentos cromatina 200-300 bp por ultrasonido. Cromatina precipitada recuperada y analizada por RT-qPCR.

Ensayo Arrastre ARN

Plásmidos biotina-marcados miR-185-3p tipo salvaje (WT) y mutante (MUT) (50 nM) transfectados en células CD44⁺HeLa respectivamente. Células incubadas lisado celular específico (Ambion, Austin, Texas, USA) tras 48 h transfección. Lisado (50 mL) subempaquetado. Lisado residual incubado con perlas M-280 estreptavidina (Sigma, St. Louis, MO, USA) pre-recubiertas RNase-free y ARNt levadura (Sigma). Seguido, células limpiadas dos veces lisado frío, tres veces búfer baja sal y una vez búfer alta sal. Sonda antagónica miR-185-3p establecida como NC. ARN total extraído por Trizol, y nivel CCAT1 probado por RT-qPCR.

Ensayo Gen Reportero Luciferasa Dual

Sitios unión potenciales E1 y E2 SOX2 en región promotor CCAT1 predichos por https://jaspar.genereg.net/. Secuencia promotor CCAT1 conteniendo sitio unión SOX2 y CCAT1 E1 sintetizada, y vectores CCAT1 3′UTR WT (E1-WT) y CCAT1 3′UTR MUT (E1-MUT) formados. Vectores clonados en pmirGLO (Beyotime). Después, CCAT1-WT/pmirGLO o CCAT1-MUT/pmirGLO co-transfectados con sh-SOX2 o sh-SOX2 NC a células CD44⁺HeLa respectivamente por 2 d y luego lisisadas. Actividad luciferasa probada por sistema detección luciferasa (Takara, Dalian, China).

Sitio web bioinformático utilizado para predecir y analizar sitios unión CCAT1 y miR-185-3p. Sitios unión CCAT1 y miR-185-3p verificados por ensayo luciferasa dual. CCAT1 3′UTR conteniendo sitio unión miR-185-3p compuesto. CCAT1 3′UTR WT y CCAT1 3′UTR MUT construidos y co-transfectados con mimics NC y mimic miR-185-3p a células CD44⁺HeLa por 2 d. Luego, células lisisadas y actividad luciferasa probada por sistema detección luciferasa (Takara). Mismo método aplicado para verificar relación diana entre miR-185-3p y FOXP3.

Análisis Estadístico

Todos datos evaluados por SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Datos medición indicados como media ± desviación estándar. Prueba t para discrepancia entre dos grupos y ANOVA unidireccional seguido prueba comparaciones múltiples Tukey para discrepancia entre grupos. Variable clasificación evaluada por prueba exacta Fisher. Valor p < 0,05 considerado significativo.

Resultados

Expresión miR-185-3p Disminuye, SOX2, CCAT1, FOXP3 Aumentan en Tejidos CC, y SOX2/CCAT1 Vinculados a Tamaño Tumor, MG y Estadio FIGO

Al detectar papel eje SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 en proliferación y autorrenovación células madre CC, se probaron expresiones miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 en tejidos CC y normales adyacentes por RT-qPCR y western blot. Se manifestó (Fig. 1a-c) expresión miR-185-3p reducida, mientras SOX2, CCAT1, FOXP3 aumentadas en tejidos CC.

Expresión miR-185-3p disminuye, SOX2, CCAT1, FOXP3 aumentan en tejidos CC. a Comparación expresión ARNm SOX2, CCAT1, miR-185-3p, FOXP3 en CC y tejidos normales adyacentes. b Bandas proteicas expresión SOX2 y FOXP3 en CC y tejidos normales. c Comparación expresión proteica SOX2 y FOXP3 en CC y tejidos normales. *p < 0,05 vs. tejidos normales adyacentes. Datos media ± DE, comparaciones dos grupos por prueba t

Relación entre expresión SOX2/CCAT1 y características clinicopatológicas CC analizada (Tabla 2). SOX2 y CCAT1 sobreexpresados en CC conectados con tamaño tumor, MG y estadio FIGO, indicando expresiones SOX2/CCAT1 mayores en pacientes con mayor tamaño tumor, MG y estadio FIGO avanzado.

Expresión miR-185-3p Reduce, SOX2, CCAT1, FOXP3 Aumentan en Células CD44⁺HeLa

Luego, expresiones miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 en línea epitelial cervical inmortalizada H8 y líneas CC SiHa, CaSki, HeLa, HCC94, C33A probadas. Sugirió (Fig. 2a-c) expresión miR-185-3p degradada, mientras SOX2, CCAT1, FOXP3 elevadas en líneas CC. Entre ellas, SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 en HeLa tuvieron mayor diferencia expresión vs H8; así HeLa seleccionadas y ordenadas; HeLa-SFCs obtenidas por cultivos suspensión, y expresión CD44 en superficie antes y después ordenación identificada por citometría flujo. Resultados mostraron tasa positiva CD44 en HeLa-SFCs marcadamente mayor que antes, sugiriendo ordenación exitosa células madre CC (Fig. 2d). Células madre ordenadas nombradas CD44⁺HeLa. Luego, expresiones miR-185-3p, SOX2, CCAT1, FOXP3 probadas en HeLa y CD44⁺HeLa (Fig. 2e-g). Manifestó SOX2, CCAT1, FOXP3 up-reguladas y miR-185-3p down-regulada en CD44⁺HeLa.

Expresión miR-185-3p reduce, SOX2, CCAT1, FOXP3 elevan en CD44⁺HeLa. a Comparación expresión ARNm SOX2, CCAT1, miR-185-3p, FOXP3 en H8 y líneas CC. b Bandas proteicas SOX2 y FOXP3 en H8 y líneas CC. c Comparación expresión proteica SOX2 y FOXP3 en H8 y líneas CC. d Detección tasa expresión CD44 en HeLa antes y después ordenación por citometría flujo. e Comparación expresión ARNm SOX2, CCAT1, miR-185-3p entre HeLa y CD44⁺HeLa. f Banda proteica SOX2 en HeLa y CD44⁺HeLa. g Comparación expresión proteica SOX2 entre HeLa y CD44⁺HeLa. ^p < 0,05 vs. H8. &p < 0,05 vs. HeLa. Datos media ± DE, prueba t dos grupos, ANOVA unidireccional + Tukey post hoc múltiples grupos

Down-regular SOX2 y CCAT1 Disminuyen Proliferación, Migración, Invasión, Tasa Formación Esferas y Aumentan Apoptosis CD44⁺HeLa

Subsecuentemente, SOX2 y CCAT1 silenciados en CD44⁺HeLa para explorar efectos en proliferación y autorrenovación células madre CC. Detectado por CCK-8, citometría flujo, prueba rayado, Transwell y formación esferas, proliferación, migración, invasión y tasa formación esferas suprimidas y apoptosis promovida por inhibición SOX2 y CCAT1 (Fig. 3a-i). Indicó silenciar SOX2 o CCAT1 inhibió proliferación y autorrenovación células madre CC.

Down-regular SOX2 y CCAT1 disminuyen proliferación, migración, invasión, tasa formación esferas y aumentan apoptosis CD44⁺HeLa. a CCK-8 probó curva crecimiento células tratadas sh-CCAT1 o sh-SOX2. b Citometría flujo detectó apoptosis células tratadas sh-CCAT1 o sh-SOX2. c Comparación tasa apoptosis células tratadas sh-CCAT1 o sh-SOX2. d Migración células tratadas sh-CCAT1 o sh-SOX2 por prueba rayado. e Comparación migración células tratadas sh-CCAT1 o sh-SOX2. f Detección capacidad invasión células tratadas sh-CCAT1 o sh-SOX2 por Transwell. g Comparación capacidad invasión células tratadas sh-CCAT1 o sh-SOX2. h Formación esferas probó capacidad autorrenovación células tratadas sh-CCAT1 o sh-SOX2. i Comparación tasa formación esferas células tratadas sh-CCAT1 o sh-SOX2. a p < 0,05 vs. grupo sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. grupo sh-CCAT1 NC. Datos media ± DE, ANOVA unidireccional + Tukey post hoc múltiples grupos

MiR-185-3p Agotado Revierte Rol Down-regulación CCAT1 en CD44⁺HeLa

Luego examinamos si miR-185-3p involucrado en proceso CCAT1 regulando proliferación y autorrenovación células madre CC. CD44⁺HeLa transfectado con mimic miR-185-3p o co-transfectado sh-CCAT1 e inhibidor miR-185-3p. Resultados presentaron up-regulación miR-185-3p redujo notablemente proliferación, migración, invasión, tasa formación esferas y aumentó tasa apoptosis CD44⁺HeLa. Células con inhibidor miR-185-3p revirtieron rol down-regulación CCAT1 en proliferación, migración, invasión, apoptosis y formación esferas CD44⁺HeLa (Fig. 4a-i).

MiR-185-3p sobreexpresado suprime proliferación, migración, invasión, tasa formación esferas y aumenta apoptosis CD44⁺HeLa. a CCK-8 probó curva crecimiento células tratadas mimic miR-185-3p. b Citometría flujo detectó apoptosis células tratadas mimic miR-185-3p. c Comparación tasa apoptosis células tratadas mimic miR-185-3p. d Migración células tratadas mimic miR-185-3p por prueba rayado. e Comparación migración células tratadas mimic miR-185-3p. f Detección capacidad invasión células tratadas mimic miR-185-3p por Transwell. g Comparación capacidad invasión células tratadas mimic miR-185-3p. h Formación esferas probó capacidad autorrenovación células tratadas mimic miR-185-3p. i Comparación tasa formación esferas células tratadas mimic miR-185-3p. a p < 0,05 vs. sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. sh-CCAT1 NC. c p < 0,05 vs. mimic NC. d p < 0,05 vs. sh-CCAT1 + inhibidor NC. Datos media ± DE, ANOVA unidireccional + Tukey post hoc múltiples grupos

SOX2 y CCAT1 Pobremente Expresados Disminuyen FOXP3 y Aumentan miR-185-3p en CD44⁺HeLa

Después, examinamos expresión SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 en CD44⁺HeLa tras transfección sh-SOX2, sh-CCAT1, mimic miR-185-3p y co-transfección sh-CCAT1 e inhibidor miR-185-3p. Expresiones SOX2, CCAT1, FOXP3 reducidas, miR-185-3p elevada en células sh-SOX2. CCAT1, FOXP3 reducidas, miR-185-3p aumentada en células sh-CCAT1. miR-185-3p elevada, FOXP3 disminuida en células con mimic miR-185-3p. FOXP3 elevada, miR-185-3p reducida en células transfectadas sucesivamente sh-CCAT1 e inhibidor miR-185-3p (Fig. 5a-d).

SOX2 y CCAT1 pobremente expresados disminuyen FOXP3 y aumentan miR-185-3p en CD44⁺HeLa. a Expresión SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 en grupos sh-SOX2 NC y sh-SOX2. b Expresión en grupos sh-CCAT1 NC y sh-CCAT1. c Expresión en grupos mimic NC y mimic miR-185-3p. d Expresión en grupos sh-CCAT1 + inhibidor NC y sh-CCAT1 + inhibidor miR-185-3p. a p < 0,05 vs. sh-SOX2 NC. b p < 0,05 vs. sh-CCAT1 NC. c p < 0,05 vs. mimic NC. d p < 0,05 vs. sh-CCAT1 + inhibidor NC. Datos media ± DE, ANOVA unidireccional + Tukey post hoc múltiples grupos

SOX2 Une a CCAT1 Afectando Expresión miR-185-3p, y FOXP3 es Gen Diana miR-185-3p

Sitios unión potenciales región promotor CCAT1 factor transcripción predichos y analizados por https://jaspar.genereg.net/, mostrando SOX2 y CCAT1 tenían sitios unión potenciales en promotor CCAT1 (Fig. 6a). ChIP-qPCR reportó (Fig. 6b): Contrastando grupo IgG, más fragmentos promotor CCAT1 enriquecidos en grupo SOX2 en sitio unión E1, probando SOX2 unido a promotor CCAT1 en sitio E1 y SOX2 involucrado en regulación CCAT1. Ensayo luciferasa dual mostró (Fig. 6c): Actividad luciferasa suprimida en células co-transfectadas sh-SOX2 y E1-WT, indicando SOX2 une CCAT1.

SOX2 une CCAT1 afectando expresión miR-185-3p, FOXP3 gen diana miR-185-3p. a Predicción sitios unión SOX2 y CCAT1 en promotores por bioinformática. b ChIP-qPCR verificó relación unión SOX2-CCAT1. c Sitio unión SOX2-CCAT1 verificado por luciferasa dual. d Predicción sitios unión CCAT1-miR-185-3p por bioinformática. e Verificación unión CCAT1-miR-185-3p por luciferasa dual. f Relación unión CCAT1-miR-185-3p en células verificada por arrastre ARN. g Predicción relación diana miR-185-3p-FOXP3 por web bioinformática. h Identificación relación diana miR-185-3p-FOXP3 por luciferasa dual. Datos media ± DE, comparaciones dos grupos por prueba t

Sitio web Jefferson predijo CCAT1 une miR-185-3p (Fig. 6d). Ensayo luciferasa dual reportó (Fig. 6e) actividad luciferasa disminuyó en células con mimic miR-185-3p y CCAT1-WT, sugiriendo miR-185-3p une CCAT1. Ensayo arrastre ARN usado para verificar si CCAT1 une miR-185-3p. Resultados revelaron (Fig. 6f) nivel enriquecimiento CCAT1 en células con Bio-miR-185-3p-WT aumentó marcadamente, mientras enriquecimiento con Bio-miR-185-3p-MUT no mostró diferencia significativa. Esto demostró CCAT1 adsorbe miR-185-3p, afectando su expresión.

Relación diana miR-185-3p-FOXP3 predicha por web Jefferson (Fig. 6g). Ensayo luciferasa dual verificó (Fig. 6h) actividad luciferasa relativa redujo dramáticamente tras co-transfectar FOXP3-WT y mimic miR-185-3p a CD44⁺HeLa, mientras FOXP3-MUT co-transfectado con mimic miR-185-3p no afectó actividad luciferasa, sugiriendo miR-185-3p dirige FOXP3.

Discusión

CC es cuarta malignidad frecuente en mujeres mundialmente, tras cánceres mama, colon, pulmón [3]. Se reportó células CC con expresión SOX2 positiva muestran características células madre cancerosas [21]. Estudio reportó CCAT1 lncARN oncogénico esencial relacionado CC ejerce papel facilitador crecimiento e invasión células CC [11]. Otro revela miR-185-3p predice radiosensibilidad carcinoma nasofaríngeo y regula crecimiento y apoptosis células cancerosas [22]. Se reportó autoanticuerpo circulante FOXP3 refleja progreso continuo lesión cervical y puede ser biomarcador pronóstico temprano CC [23]. Estudio actual diseñado para explorar cómo eje SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3 influye proliferación y autorrenovación células madre CC.

Basado en hallazgos, SOX2 y CCAT1 aumentaron en tejidos y células CC vinculados a tamaño tumor, MG y FIGO avanzado. Funcionalmente probado, down-regular SOX2 y CCAT1 declinaron proliferación, migración, invasión, número esferas y aumentaron apoptosis células madre CC. Similar a nuestro estudio, SOX2 tiende aumentar en CC [24, 25]. Además, SOX2 up-regulado en células CC derivadas células madre cancerosas [26]. SOX2 sobreexpresado sugerido vinculado características clinicopatológicas pacientes varios cánceres, no solo CC. Ejemplo: up-regulación SOX2 en carcinoma escamoso cervical pacientes FIGO I-II [27]. SOX2 vinculado MG en carcinoma escamoso oral [28]. Sobre función molecular SOX2 para progresión cáncer, trabajo observacional presenta down-regulación SOX-2 suprime migración e invasión carcinoma escamoso cervical [29]. Otra investigación prueba up-regulación SOX2 mejora clonogenicidad, proliferación y tumorigenicidad CC in vitro e in vivo vs controles [30].

Respecto relación reguladora SOX2-CCAT1, estudio existente presenta silenciamiento SOX2 reduce marcadamente nivel ARNm CCAT1 [31]. Sobre papel CCAT1 en cánceres, estudio mostró expresión CCAT1 marcadamente elevada en tejidos CC vs normales adyacentes [11, 12]. Notable, sobreexpresión CCAT1 en CC positivamente relacionada tamaño tumor [12]. En rol CCAT1 en actividad células cancerosas, investigación destaca CCAT1 sobreexpresado acelera proliferación, formación colonias e invasión CC [11]. Interesante, investigación previa demostró viabilidad, capacidades invasiva y migratoria declinan via knockdown CCAT1 [12]. De cualquier modo, efecto funcional SOX2 y CCAT1 en otros cánceres similar a CC.

Después, nuestra investigación reveló CCAT1 une miR-185-3p, down-regulación CCAT1 en CC y sobreexpresión miR-185-3p suprimieron proliferación y autorrenovación células madre CC. Reportado CCAT1 y miR-185-3p correlacionados negativamente [13]. Resultado reportó reducción expresión miR-185-3p en casos carcinoma nasofaríngeo radiorresistente [22]. Sobre función supresora miR-185-3p en agresividad células cancerosas, estudio reveló up-regulación miR-185-3p suprime propiedades invasivas y metastásicas células carcinoma nasofaríngeo [32]. Zou et al. sugirieron miR-185 restaurado reprime crecimiento e invasión cáncer mama [33]. Artículo halló up-regulación miR-185 declina proliferación, invasión, formación colonias cáncer pulmón no microcítico in vitro [34]. Presentado proliferación, invasión, migración in vitro e in vivo crecimiento tumoral suprimidos via miR-185 sobreexpresado en cáncer pulmón no microcítico [35]. Estudios confirman papel anti-tumoral miR-185-3p en presente estudio consistente con investigaciones previas.

Procedimos, develamos miR-185-3p dirige FOXP3, gen sobreexpresado en CC regulando actividad células madre CC. De hecho, FOXP3, regulador marcador células madre SOX2 en cáncer colon [36], investigado en CC mostrando up-regulación en células CC [19, 37]. Evidencia elevación FOXP3 promueve formación esferas tumorales y estimula stemness cáncer pulmón no microcítico [38].

Conclusión

Colectivamente, exploramos por primera vez que transcripción SOX2 activa CCAT1, inhibiendo miR-185-3p y regulando FOXP3 para promover proliferación y autorrenovación células madre CC, vía potencial para tratar CC. Adicionalmente, limitaciones en presente estudio existen en tamaño muestra relativamente pequeño en experimento diseñado. Así, investigaciones clínicas podrían realizarse para detectar eficacia tratamiento CC.

Disponibilidad datos y materiales

No aplicable.

Abreviaturas

CC:

Cáncer cervical

SOX2:

Región determinante sexo caja Y 2

CCAT1:

Transcripción asociada cáncer colon 1

miR-185-3p:

MicroARN-185-3p

FOXP3:

Proteína caja horquilla 3

lncARN:

ARN no codificante largo

FIGO:

Federación Internacional Ginecología Obstetricia

MG:

Metástasis ganglionar

VPH:

Virus papiloma humano

SFCs:

Células formadoras esferas

FBS:

Suero fetal bovino

DMEM:

Medio modificado Eagle Dulbecco

RPMI:

Instituto Memorial Parque Roswell

IMDM:

Medio Dulbecco Modificado Iscove

bFGF:

Factor crecimiento fibroblasto básico

EGF:

Factor crecimiento epidérmico

PI:

Yoduro propidio

FITC:

Fluoresceína isotiocianato

PFA:

Paraformaldehído

ChIP:

Inmunoprecipitación cromatina

WT:

Tipo salvaje

MUT:

Tipo mutante

NC:

Control negativo

ANOVA:

Análisis varianza