Dirigir miR-301 Suprime Angiogénesis y Crecimiento Tumoral en Carcinoma Escamoso Esofágico mediante Activación de PTEN

Resumen

Objetivo

El carcinoma escamoso de esófago (CEE) se caracteriza por metástasis temprana y diagnóstico tardío. El microARN-301 (miR-301) participa en diversos cánceres. Sin embargo, los efectos de miR-301 en CEE permanecen inexplorados. Por tanto, nuestro objetivo es explorar el papel de miR-301 en progresión de CEE.

Métodos

Se evaluó la expresión de miR-301 y fosfatasa y tensina homóloga (PTEN) en tejidos y líneas celulares de CEE. Luego, las células seleccionadas se trataron con oligonucleótidos y plásmidos de miR-301 o PTEN alterados, y se evaluaron capacidad de formación de colonias, viabilidad celular, migración, invasión, distribución del ciclo celular y apoptosis de células CEE. Además, se evaluaron crecimiento tumoral y densidad de microvasos (DMV), y se confirmó la relación de diana entre miR-301 y PTEN.

Resultados

MiR-301 se sobreexpresó y PTEN se subexpresó en tejidos y células de CEE. Se seleccionaron células KYSE30 y Eca109 para ensayos funcionales. En células KYSE30, miR-301 inhibido o PTEN sobreexpresado suprimieron comportamientos malignos, y PTEN silenciado eliminó el impacto de inhibición de miR-301 en progresión de CEE. En células Eca109, miR-301 sobreexpresado o PTEN inhibido promovieron comportamientos malignos, y PTEN sobreexpresado revirtió efectos de elevación de miR-301 en progresión de CEE. El ensayo in vivo reveló que inhibición de miR-301 o sobreexpresión de PTEN reprimieron crecimiento tumoral y DMV en CEE, y elevación de miR-301 o reducción de PTEN tuvieron efectos contrarios. Además, PTEN fue diana de miR-301.

Conclusión

En conjunto, nuestros resultados revelaron que miR-301 afecta crecimiento celular, metástasis y angiogénesis mediante regulación de expresión de PTEN en CEE.

Introducción

El cáncer de esófago (CE), el 8º más común mundialmente, es una malignidad crítica con alta mortalidad y pronóstico pobre [1]. Representando ~90 % de casos totales de CE, el carcinoma escamoso de esófago (CEE) es la forma principal de CE en China [2]. Múltiples causas incluyendo bajo estatus socioeconómico, tabaquismo, consumo de alcohol, mala nutrición, alimentos ricos en nitrosaminas o contaminados con micotoxinas conducen a CEE [3]. A pesar de mejores resultados clínicos y administración, aún hay pronóstico pobre entre pacientes CEE, con tasa de supervivencia a 5 años de 15-25 % [4]. Por tanto, es crucial confirmar oncogenes o genes supresores tumorales que funcionen como biomarcadores en desarrollo de CEE para proveer métodos terapéuticos más efectivos para pacientes CEE.

Los microARNs (miARNs) son pequeños ARN no codificantes que juegan papel esencial modulando expresión génica [5] y se ha clarificado que tienen capacidad de influir progresión tumoral regulando estabilidad de ARNm y capacidad de ARNm [6]. Una cantidad de miARNs como miR-4324 [7], miR-889-3p [8] y miR-9 [9] se han asociado con proceso de CEE. MiR-301 es miembro de miARNs formado por unidad de transcripción fam33a situada en 17q22-23 en genoma humano. La sobreexpresión de miR-301 se ha identificado previamente, reflejando su implicación en enfermedades humanas [6, 10]. Sin embargo, los mecanismos de función de miR-301 no se han descubierto en CEE. Además, fosfatasa y tensina homóloga (PTEN) se ha afirmado que se disrumpe frecuentemente en tumores y es diana de mutaciones germinales en pacientes con cáncer, jugando papel inhibitorio de tumores [11]. Se ha validado que desregulación de PTEN se correlaciona con desarrollo de CEE [12]. Interesantemente, una investigación reciente reveló que miR-301 dirige PTEN en cáncer de pulmón de células no pequeñas [13]. Sin embargo, esta relación de diana entre miR-301 y PTEN en desarrollo de CEE permanece por desvelar. Nuestra investigación se centró en efectos de miR-301 y PTEN en progresión de CEE, que permanecen largamente desconocidos y son novedosos. Inferimos que miR-301 puede influir angiogénesis y crecimiento celular en CEE modulando expresión de PTEN.

Materiales y Métodos

Declaración Ética

Consentimientos informados por escrito se obtuvieron de todos los pacientes antes del estudio. Los protocolos fueron aprobados por Comité de Ética del Segundo Hospital de Universidad de Jilin y basados en principios éticos para investigación médica con sujetos humanos de Declaración de Helsinki. Experimentos con animales fueron estrictamente consistentes con Guía para Manejo y Uso de Animales de Laboratorio emitida por Institutos Nacionales de Salud. El protocolo de experimentos animales fue aprobado por Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Segundo Hospital de Universidad de Jilin.

Sujetos de Estudio

Ciento diez muestras de tejidos CEE y tejidos normales adyacentes (> 5 cm del tumor) se recolectaron de pacientes CEE (78 hombres, 32 mujeres) que aceptaron esofagectomía en departamento de cirugía torácica del Segundo Hospital de Universidad de Jilin de enero 2015 a diciembre 2017. Entre 110 pacientes, 84 casos > 60 años y 26 ≤ 60 años; tamaño tumoral: 65 casos ≥ 5 cm y 45 < 5 cm; 71 casos sin metástasis ganglionar (MG) y 39 con MG; estadio tumor-ganglio-metástasis (TNM): 60 casos en estadio I + II y 50 en estadio III; localización tumoral: 13 casos CEE superior y 97 medio-inferior. Todos diagnosticados con CEE y sin radioterapia ni quimioterapia previa. Tumores extirpados completamente y margen quirúrgico negativo confirmado por patología. Según criterios de estadificación CEE propuestos por Unión para Control Internacional del Cáncer (UICC) en 2009 [14], la estadificación patológica postoperatoria se identificó como estadio pT1-4N1-2(I-IIIb). No hubo complicaciones significativas post-cirugía, y muertes perioperatorias se excluyeron.

Reacción en Cadena de Polimerasa con Transcripción Inversa Cuantitativa (RT-qPCR)

ARN totales en tejidos y células se extrajeron usando kits Trizol (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA). Concentración y calidad de ARN se midieron. Iniciadores ARN (Tabla 1) diseñados y sintetizados por TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Liaoning China). ARN se transcribió inversamente a cDNA basado en instrucciones de Kit Takara PrimeScript™ RT reagent con gDNA Eraser (Takara). Realizamos qPCR en Light Cycler 480II (Roche) con Power PCR SYBR green PCR master mix (Takara). U6 se usó como control de carga de miR-301, y β-actina como referencia interna de PTEN. Datos analizados usando método 2^−ΔΔCt [15].

Análisis Western Blot

Búfer de lisis RIPA (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) usado para extraer proteína total en células y tejidos, cuantificada por kit BCA Protein Assay (Beyotime). Concentración de proteína de cada muestra medida, y electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico 10 % realizada. Muestras transferidas a membranas de nitrocelulosa, bloqueadas con 5 % leche desnatada a 4 °C overnight. Después, membranas suplementadas con anticuerpos primarios PTEN y β-actina (ambos 1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA) para incubación overnight, luego anticuerpos secundarios respectivos 1 h. Tras inmersión en reactivo quimioluminiscente mejorado (Pierce Chemical Inc., Dallas, TX, USA) 1 min, membranas expuestas en oscuridad y reveladas usando imagenador quimioluminiscente LAS4000 mini. Valores de gris evaluados por software de sistema de imagen con β-actina como control; así se obtuvo expresión proteica relativa final. Bandas proteicas analizadas por software ImageJ2x.

Ensayo de Gen Reportero Luciferasa Dual

La secuencia de región 3′-no traducida (3′-UTR) de PTEN se predijo que interactúa con miR-301, o secuencia mutada dentro de sitios diana predichos se sintetizó e insertó en sitios XbaI y FseI del vector reportero luciferasa pGL3 control (Promega, WI, USA). Luego se produjeron vectores pGL3-PTEN-wt y pGL3-PTEN-mut. Plásmidos reporteros luciferasa wt y mut correctamente identificados con miR-301 mimic y mimic NC se co-transfectaron en células KYSE30 y Eca109 por 48 h. Posteriormente, células lisisaron y actividades luciferasa se determinaron respectivamente por kits detección luciferasa (Promega).

Cultivo Celular, Agrupamiento y Transfección

Líneas celulares CEE (KYSE-150, KYSE-30, Eca109, KYSE-70) obtenidas de Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghai, Academia China de Ciencias (Shanghai, China), y células epiteliales esofágicas humanas (HEEC) de Mingzhou Biotechnology Co., Ltd. (Zhejiang, China). Células cultivadas en medio RPMI 1640 (Invitrogen) con 10 % suero fetal bovino (FBS, Life Technologies, USA), 100 unidades/mL penicilina G sódica (Sigma) y 100 μg/mL sulfato estreptomicina (Sigma). Expresión miR-301 y expresión ARNm PTEN en cada línea se midieron por RT-qPCR, y línea con mayor y menor expresión relativa se eligió para experimentos celulares subsiguientes.

Células KYSE-30 se separaron en 7 grupos y trataron respectivamente con inhibidor miR-301, control negativo (NC) inhibidor, pcDNA-PTEN (sobreexpresión (oe)-PTEN), pcDNA-NC (oe-NC), inhibidor miR-301 + ARN interferente pequeño (si)-PTEN o inhibidor miR-301 + si-NC. Células Eca109 se separaron en 7 grupos y trataron con mimic miR-301, mimic NC, si-PTEN, si-NC, mimic miR-301 + oe-PTEN, mimic miR-301 + oe-NC. Inhibidor NC, inhibidor miR-301, mimic miR-301, mimic NC, si-NC y si-PTEN comprados de GenePharma Ltd., Co. (Shanghai, China); pcDNA-PTEN NC y pcDNA-PTEN de Shanghai Sangon Bio-technology Corporation (Shanghai, China). Células transfectadas transitoriamente en células CEE por lipofectamina 2000 (Invitrogen) cuando confluencia celular alcanzó 60 %.

Ensayo Kit de Conteo Celular (CCK-8)

Células sembradas en placa 96 pozos (1 × 10³ células/pozo) e incubadas por diferentes periodos. Tras incubar 24, 48, 72 y 96 h, cada pozo suplementado con 10 μL solución CCK-8 (5 mg/mL), y células de cada grupo incubadas a 37 °C sin luz 2 h. Valores densidad óptica (DO) a 450 nm analizados por lector microplacas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Ensayo Formación de Colonias

Células sembradas a 500 células/pozo en placas 6 pozos tras transfección y cultivadas 14 d. Colonias fijadas con metanol, teñidas con 0,5 % violeta cristal y contadas bajo microscopio invertido.

Ensayo Transwell

Células (5 × 10³) incubadas en medio RPMI 1640 sembradas en cámaras apicales de dispositivos Transwell con membrana sin recubrir o recubierta matrigel (Corning, NY, USA). Tras 24 h, células en cámaras apicales removidas, mientras células en cara inferior fijadas y teñidas con 0,1 % violeta cristal. Microscopio (Olympus Corporation, Tokyo, Japón) usado para contar 3 campos aleatorios y calcular número de células.

Citometría de Flujo

Ciclo celular y apoptosis evaluados por citometría de flujo. Annexin V-fluoresceína isotiocianato (10 µL) y yoduro de propidio (PI; 5 µL, Sigma) incubados con células (5 × 10⁵ células/pozo) en oscuridad a 4 °C 30 min. Porcentaje de células apoptóticas calculado usando citómetro de flujo (BD Biosciences, CA, USA) con software FlowJo versión 10 (FlowJo LLC, OR, USA).

Para evaluar ciclo celular, células (5 × 10⁵ células/pozo) fijadas con 75 % etanol overnight a 4 °C y teñidas con 5 µl PI/ribonucleasa A (Sigma) a 4 °C 30 min en oscuridad. Datos analizados con citómetro de flujo (BD Biosciences). Señales fluorescencia (14.000) de cada muestra recolectadas y calculadas usando software ModFit LT versión 3.2 (Verity Software House, Inc., ME, USA).

Tumorigenesis Subcutánea en Ratones Desnudos

Cuarenta y dos hembras ratones desnudos BALB/c-nu (4 semanas, 16-24 g) obtenidas de Centro Experimental Animales Universidad Jilin (Changchun, China). Ratones separados en 14 grupos (n = 3). Ratones de siete grupos inyectados respectivamente con células KYSE-30 según agrupamiento celular, y resto siete grupos con células Eca109 basado en agrupamiento. Concentración de células KYSE-30 y Eca109 transfectadas ajustada a 5 × 10⁶ células/100 μL. Ratones fijados e inyectados subcutáneamente con células CEE correspondientes bajo condiciones estériles. Longitud mayor (L) y ancho (W) de tumores medidos cada semana y volumen tumoral (V) = 1/2 × L × W². Ratones eutanasia en 5ª semana inyección con tumores reseccionados, pesados y fotografiados. Tasa formación tumoral calculada como ratones con tumor subcutáneo/total ratones inyectados en grupo × 100 %. Tiempo inyección como abscisa, tamaño tumoral como ordenada; así se graficó curva crecimiento tumoral.

Tinción Inmunohistoquímica

Tejidos tumorales de ratones fijados por 10 % formaldehído, incluidos en parafina y seccionados 4 μm. Secciones secadas a 60 °C 2 h, desparafinadas con xileno, deshidratadas con etanol gradiente e incubadas con 50 μL 3 % H₂O₂ 10 min. Después, secciones remojadas en solución tampón ácido cítrico 0,01 M, hervidas a 95 °C 20 min, bloqueadas con suero caprino normal a 37 °C 10 min y añadidas CD₃₄ (1:100, Santa Cruz) a 4 °C overnight. Después, secciones suplementadas con polímero IgG anti-conejo/ratón marcado HRP (ZSGB-Bio, Beijing, China), contra-teñidas con hematoxilina, deshidratadas, permeabilizadas y selladas con bálsamo neutro. PBS usado para reemplazar anticuerpos primarios como NC. Medición densidad microvascular (DMV): secciones observadas bajo microscopio baja magnificación. Célula endotelial o grupo teñido amarillo parduzco y distinguido significativamente de células tumorales circundantes y tejidos conectivos tomado como microvaso. Estructura ramificada también tomada como vaso si desconectada, mientras vasos con luz > 8 eritrocitos, capa muscular o luz más gruesa excluidos. Números de microvaso de 3 campos visuales altos registrados, y promedio fue DMV de cada caso.

Análisis Estadístico

Todos los análisis estadísticos realizados usando SPSS versión 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) y presentados con Graphpad Prism Software 6.0. Datos expresados como media ± desviación estándar. Diferencias entre dos grupos independientes probadas con prueba t Student. ANOVA unidireccional para comparar tres o más grupos. Valor P < 0,05 indicativo de diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

MiR-301 Altamente Expresado, PTEN Pobremente Expresado en Tejidos y Células CEE

Expresión miR-301 y PTEN en tejidos CEE y normales adyacentes evaluada por RT-qPCR y Western blot para revelar roles en CEE, encontrando (Fig. 1a-c) miR-301 sobreexpresado, PTEN subexpresado en tejidos CEE. Pacientes divididos en grupos baja y alta expresión según valor mediano de expresión miR-301 o PTEN para analizar correlación entre expresión miR-301/PTEN y características clinicopatológicas de pacientes CEE. Resultados indicaron que expresión miR-301/PTEN no relacionada con edad, género, tamaño tumoral, localización y diferenciación, mientras correlacionada con estadio TNM y MG de pacientes CEE (Tabla 2).

MiR-301 altamente expresado, PTEN pobremente expresado en tejidos y células CEE. a Expresión miR-301 y ARNm PTEN en tejido CEE detectada por RT-qPCR; b expresión proteica PTEN en tejido CEE por Western blot; c bandas proteicas PTEN en tejido CEE en Western blot; d expresión miR-301 y ARNm PTEN en línea celular CEE por RT-qPCR; e expresión proteica PTEN en línea celular CEE por Western blot; f bandas proteicas PTEN en Western blot. *P < 0,05 vs. HEEC. Datos como media ± DE, prueba t para comparaciones entre dos grupos

Luego, expresión miR-301 y PTEN en 4 líneas celulares CEE y HEEC determinada por RT-qPCR y Western blot. Encontramos (Fig. 1d-f) miR-301 sobreexpresado y PTEN subexpresado en líneas CEE, donde KYSE-30 tuvo mayor expresión miR-301 y menor PTEN, mientras Eca109 tendencia contraria. Así, línea KYSE-30 tratada con miR-301 reducido/PTEN sobreexpresado y línea Eca109 con miR-301 sobreexpresado/PTEN silenciado en experimentos celulares.

PTEN es Diana de miR-301

Software bioinformático (https://www.microrna.org/) predijo PTEN como gen diana de miR-301 (Fig. 2a). Confirmado por ensayo luciferasa dual que actividad luciferasa disminuyó significativamente en células CEE co-transfectadas con vector PTEN-wt y mimic miR-301 comparado con co-transfectadas con PTEN-mut y mimic miR-301, implicando que miR-301 une particularmente a PTEN (Fig. 2b, c).

PTEN es gen diana de miR-301. a Sitios unión miR-301 y PTEN predichos por software online; b relación diana miR-301/PTEN en KYSE-30 por ensayo luciferasa dual; c relación diana en Eca109 por ensayo luciferasa dual; d expresión miR-301 y ARNm PTEN en KYSE-30 por RT-qPCR tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; e expresión proteica PTEN en KYSE-30 por Western blot tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; f bandas proteicas PTEN en KYSE-30 en Western blot tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; g expresión miR-301 y ARNm PTEN en Eca109 por RT-qPCR tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN; h expresión proteica PTEN en Eca109 por Western blot tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN; i bandas proteicas PTEN en Eca109 en Western blot tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN. *P < 0,05 vs. grupo inhibidor-NC, & P < 0,05 vs. grupo oe-NC, #P < 0,05 vs. grupo inhibidor miR-301 + si-NC, a P < 0,05 vs. grupo mimic-NC, b P < 0,05 vs. grupo si-NC, c P < 0,05 vs. grupo mimic miR-301 + oe-NC; N = 3. Datos como media ± DE, prueba t para dos grupos, ANOVA para múltiples grupos

RT-qPCR y Western blot usaron para evaluar expresión miR-301 y PTEN en células transfectadas, encontrando que en KYSE-30 (Fig. 2d-f), células con inhibidor miR-301 redujeron miR-301 y elevaron PTEN; células con pcDNA-PTEN (oe-PTEN) elevaron PTEN, y si-PTEN revirtió efecto de inhibidor miR-301 en expresión PTEN. En Eca109 (Fig. 2g-i), células con mimic miR-301 elevaron miR-301 y redujeron PTEN; células con si-PTEN disminuyeron PTEN, y pcDNA-PTEN (oe-PTEN) revirtió papel inhibitorio de mimic miR-301 en expresión PTEN. Estos datos sugirieron que miR-301 dirige PTEN.

MiR-301 Inhibido o PTEN Sobreexpresado Restringe Viabilidad Células CEE; MiR-301 Elevado o PTEN Reducido Promueve Viabilidad

Viabilidad celular CEE evaluada por ensayos formación colonias y CCK-8. Resultados revelaron que en línea KYSE-30 (Fig. 3a-c), transfección inhibidor miR-301 o oe-PTEN reprimió capacidad formación colonias y viabilidad; transfección PTEN silenciado eliminó impacto de inhibidor miR-301 en viabilidad células CEE; en línea Eca109 (Fig. 3d-f), transfección mimic miR-301 o si-PTEN promovió capacidad formación colonias y viabilidad; sobreexpresión PTEN revirtió papel promotor de elevación miR-301 en capacidad formación colonias y viabilidad células Eca109. Resultados sugirieron que knockdown miR-301 o sobreexpresión PTEN reprimió viabilidad células CEE, promovida por elevación miR-301 o inhibición PTEN.

MiR-301 inhibido o PTEN sobreexpresado restringe viabilidad células CEE; miR-301 elevado o PTEN reducido promueve viabilidad. a Número colonias en KYSE-30 tras transfección por ensayo formación colonias tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; b capacidad formación colonias KYSE-30 tras transfección por ensayo formación colonias tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; c viabilidad KYSE-30 tras transfección por ensayo CCK-8 tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; d número colonias en Eca109 tras transfección por ensayo formación colonias tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN; e capacidad formación colonias Eca109 tras transfección por ensayo formación colonias tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN; f viabilidad Eca109 tras transfección por ensayo CCK-8 tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN; *P < 0,05 vs. grupo inhibidor-NC; & P < 0,05 vs. grupo oe-NC; #P < 0,05 vs. grupo inhibidor miR-301 + si-NC; a P < 0,05 vs. grupo mimic-NC; b P < 0,05 vs. grupo si-NC; c P < 0,05 vs. grupo mimic miR-301 + oe-NC, N = 3. Datos como media ± DE, ANOVA para comparaciones múltiples grupos

MiR-301 Inhibido o PTEN Sobreexpresado Reprime Migración e Invasión Células CEE; MiR-301 Elevado o PTEN Reducido Induce Migración e Invasión

Habilidades migración e invasión células CEE evaluadas por ensayo Transwell. Resultados sugirieron que en línea KYSE-30 (Fig. 4a, b), migración e invasión reprimidas por inhibición miR-301 o sobreexpresión PTEN; papel supresor inhibidor miR-301 en migración e inversión revirtió por si-PTEN. En línea Eca109 (Fig. 4c, d), migración e invasión promovidas tras transfección mimic miR-301 o si-PTEN; PTEN sobreexpresado revirtió impacto mimic miR-301 en migración e invasión. Hallazgos implicaron que migración e invasión células CEE inhibidas por represión miR-301 o elevación PTEN, facilitadas por upregulación miR-301 o downregulación PTEN.

MiR-301 inhibido o PTEN sobreexpresado reprime migración e invasión células CEE; miR-301 elevado o PTEN reducido promueve migración e invasión. a Migración e invasión KYSE-30 transfectadas por Transwell tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; b resultados estadísticos migradas e invasivas KYSE-30 por Transwell tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; c migración e invasión Eca109 entre grupos por Transwell tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN; d resultados estadísticos migradas e invasivas Eca109 por Transwell miR-310 upregulation o PTEN downregulation. *P < 0,05 vs. inhibidor-NC; & P < 0,05 vs. oe-NC; #P < 0,05 vs. inhibidor miR-301 + si-NC; a P < 0,05 vs. mimic-NC; b P < 0,05 vs. si-NC; c P < 0,05 vs. mimic miR-301 + oe-NC, N = 3. Datos como media ± DE, ANOVA para múltiples grupos

MiR-301 Inhibido o PTEN Sobreexpresado Induce Arresto Ciclo Celular y Apoptosis Células CEE; MiR-301 Elevado o PTEN Reducido Suprime Arresto y Apoptosis

Citometría de flujo usada para detectar transición ciclo celular y apoptosis tras transfección, resultados indicaron que en línea KYSE-30 (Fig. 5a-d), transfección inhibidor miR-301 o oe-PTEN promovió tasa apoptosis y aumentó células en fase G0/G1, disminuyendo fases S y G2/M; alteración apoptosis y arresto ciclo inducida por inhibidor miR-301 revirtió por si-PTEN.

MiR-301 inhibido o PTEN sobreexpresado induce arresto ciclo y apoptosis células CEE; miR-301 elevado o PTEN reducido suprime arresto y apoptosis. a Distribución ciclo KYSE-30 en cada grupo por citometría flujo tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; b resultados porcentuales G0/G1, S y G2/GM KYSE-30 en citometría flujo tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; c apoptosis KYSE-30 por citometría flujo tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; d tasa apoptosis KYSE-30 transfectadas por citometría flujo tras downregulation miR-310 o upregulation PTEN; e distribución ciclo Eca109 en cada grupo por citometría flujo miR-310 upregulation o PTEN downregulation; f resultados porcentuales G0/G1, S y G2/GM Eca109 en citometría flujo tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN; g apoptosis Eca109 por citometría flujo tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN; h tasa apoptosis Eca109 transfectadas por citometría flujo tras upregulation miR-310 o downregulation PTEN. *P < 0,05 vs. inhibidor-NC; & P < 0,05 vs. oe-NC; #P < 0,05 vs. inhibidor miR-301 + si-NC; a P < 0,05 vs. mimic-NC; b P < 0,05 vs. si-NC; c P < 0,05 vs. mimic miR-301 + oe-NC, N = 3. Datos como media ± DE, ANOVA para múltiples grupos

Según resultados citometría flujo, en línea Eca109 (Fig. 5e-h), transfección mimic miR-301 o si-PTEN inhibió tasa apoptosis, disminuyó células en G0/G1 e aumentó S y G2/M; sobreexpresión PTEN revirtió efecto mimic miR-301 en tasa apoptosis y arresto ciclo Eca109. Concluimos que downregulation miR-301 o upregulación PTEN promovieron transición ciclo y apoptosis en células CEE, mientras inhibición miR-301 o silenciamiento PTEN efectos opuestos.

MiR-301 Inhibido o PTEN Sobreexpresado Restringe Crecimiento Tumoral y Angiogénesis In Vivo en CEE; MiR-301 Elevado o PTEN Reducido Aumenta Crecimiento y Angiogénesis

Crecimiento y cambios tumores CEE en ratones desnudos observados en cada grupo. Crecimiento tumoral evaluado, resultados implicaron que en línea KYSE-30 (Fig. 6a-e), ratones inyectados con inhibidor miR-301 o oe-PTEN redujeron volumen y peso tumoral; papel represor inhibidor miR-301 en crecimiento tumoral abolido por si-PTEN. En línea Eca109 (Fig. 6f-j), volumen y peso tumoral avanzados en ratones inyectados con mimic miR-301 o si-PTEN; sobreexpresión PTEN revirtió efecto mimic miR-301 en crecimiento tumoral. Mientras tanto, expresión CD34 en xenoinjertos de ratones evaluada por tinción inmunohistoquímica, hallazgos mostraron (Fig. 7a-d) en xenoinjertos KYSE-30, DMV reprimida tras downregulation miR-301 o upregulation PTEN; PTEN silenciado revirtió impacto inhibición miR-301 en DMV. En xenoinjertos Eca109, DMV aumentada tras upregulación miR-301 o downregulation PTEN; aumento DMV inducido por miR-301 upregulado abolido por PTEN sobreexpresado. Datos indicaron que inhibición miR-301 o sobreexpresión PTEN reprimieron crecimiento tumoral y angiogénesis en CEE, mientras elevación miR-301 o silenciamiento PTEN efectos inversos.

MiR-301 inhibido o PTEN sobreexpresado restringe crecimiento tumoral CEE; miR-301 elevado o PTEN reducido aumenta crecimiento. a Figuras representativas crecimiento tumoral observado por tumorigenesis subcutánea en ratones tras transfección KYSE-30; b-d cambios volumen tumoral cada grupo tras transfección KYSE-30; e cambios peso tumoral cada grupo tras transfección KYSE-30; f figuras representativas crecimiento tumoral observado por tumorigenesis subcutánea en ratones tras transfección Eca109; g-i cambios volumen tumoral cada grupo tras transfección Eca109; j cambios peso tumoral cada grupo tras transfección Eca109. *P < 0,05 vs. inhibidor-NC; & P < 0,05 vs. oe-NC; #P < 0,05 vs. inhibidores miR-301 + si-NC; a P < 0,05 vs. mimic-NC; b P < 0,05 vs. si-NC; c P < 0,05 vs. mimic miR-301 + oe-NC, n = 3 ratones. Datos como media ± DE, ANOVA para múltiples grupos

MiR-301 inhibido o PTEN sobreexpresado restringe angiogénesis CEE; miR-301 elevado o PTEN reducido aumenta angiogénesis. a Imágenes representativas tejidos tumorales por tinción inmunohistoquímica en ratones tras transfección KYSE-30; b comparaciones DMV KYSE-30 en tejidos tumorales entre grupos; c imágenes representativas tejidos tumorales por tinción inmunohistoquímica en ratones tras transfección Eca109; d comparaciones DMV Eca109 en tejidos tumorales entre grupos *P < 0,05 vs. inhibidor-NC; & P < 0,05 vs. oe-NC; #P < 0,05 vs. inhibidores miR-301 + si-NC; a P < 0,05 vs. mimic-NC; b P < 0,05 vs. si-NC; c P < 0,05 vs. mimic miR-301 + oe-NC, n = 3 ratones. Datos como media ± DE, ANOVA para múltiples grupos

Discusión

CE es malignidad invasiva en tracto gastrointestinal [16]. Como tipo principal CE, CEE es tumor maligno en células epiteliales esofágicas [17]. Los miARNs, pequeños ARN no codificantes, demostrados funcionan como roles significativos en silenciamiento ARN [18]. Nuestra investigación diseñada para explorar efectos miR-301 y gen diana PTEN en progresión CEE, hallando que miR-301 inhibido suprime angiogénesis y crecimiento celular en CEE elevando PTEN.

Expresión miR-301 evaluada, hallando miR-301 altamente expresado en células CEE vs HEEC, y mayor expresión también en tejidos CEE vs normales adyacentes. Similar, Li et al. identificaron miR-301 alta expresión en tejidos infarto miocárdico [19]. Además, elucidamos PTEN dirigido por miR-301, relación apuntada por literatura existente [20]. Descubrimos PTEN, afirmado diana miR-301, subexpresado en tejidos y células CEE. Similar, investigación previa halló PTEN pobremente expresado en CEE vs tejido epitelial no tumoral [21]. Ma et al. iluminaron expresión PTEN degradada en línea Eca109 [22], también seleccionada para experimentos aquí. Estudios proveen evidencia para alta expresión miR-301 y baja PTEN en CEE.

Otro resultado importante: miR-301 inhibido reprimió capacidad formación colonias y proliferación células CEE via aumento PTEN, y miR-301 elevado o PTEN reducido efectos contrarios. Similar, Han et al. elucidaron downregulation miR-301 mediada por luteolina restringe proliferación en cáncer próstata [6]. Literatura reciente revela sobreexpresión PTEN suprime proliferación cáncer pancreático [23], mismo resultado en cáncer próstata [24]. Además, downregulación miR-301 o elevación PTEN inhibió migración e invasión células CEE, y miR-301 elevado o PTEN reducido tendencias opuestas. Acorde, Shi et al. apoyaron inhibidor miR-301 atenúa migración e invasión cáncer mama [10], y se reportó migración e invasión CEE reprimidas por inhibición miR-130b y elevación PTEN [25]. Publicaciones verificaron papel oncogénico miR-301 y efecto supresor tumoral PTEN en diversos cánceres. Otro resultado: miR-301 inhibido sobreexpresó PTEN promoviendo apoptosis e induciendo arresto ciclo en fase G0/G1 en células CEE, y miR-301 elevado o PTEN reducido resultados inversos. Similar, literatura reciente halló PTEN activado induce arresto ciclo y apoptosis en CEE [26]. Consistentemente, Tian et al. hallaron elevación PTEN inhibió angiogénesis reduciendo expresión factor crecimiento endotelial vascular en carcinoma hepatocelular [27]. Basado en datos, roles miR-301 y PTEN en apoptosis y angiogénesis en diversas enfermedades confirmados. Concluimos downregulation miR-301 restringe crecimiento tumoral CEE through alta expresión PTEN, conclusión similar en cáncer mama [10] y próstata [28]. Contrariamente, miR-301 elevación o PTEN reducción indujo crecimiento tumoral CEE. MiR-301 y PTEN participan en crecimiento células cancerosas in vivo.

Conclusión

En este estudio mostramos que represión miR-301 prohíbe angiogénesis, proliferación, migración e invasión pero promueve apoptosis en células CEE upregulando PTEN. Esta investigación puede avanzar comprensión de mecanismos moleculares potenciales de CEE y proveer nuevas dianas para tratamiento CEE.

Abreviaturas

CEE:

Carcinoma escamoso de esófago

PTEN:

Fosfatasa y tensina homóloga

DMV:

Densidad microvascular

CE:

Cáncer de esófago

miARNs:

MicroARNs

MG:

Metástasis ganglionar

UICC:

Unión para Control Internacional del Cáncer

RT-qPCR:

Reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa cuantitativa

3′UTR:

Región 3′-no traducida

WT:

Tipo salvaje

MUT:

Tipo mutante

HRP:

Peroxidasa rábano picante

FBS:

Suero fetal bovino

OE:

Sobreexpresado

NC:

Control negativo

CCK-8:

Kit conteo celular

DMEM:

Medio modificado Eagle Dulbecco

PI:

Yoduro propidio

FITC:

Fluoresceína isotiocianato

MVD:

Densidad microvascular

ANOVA:

Análisis varianza