Dirigir el eje miR-342-5p/Wnt3a estabiliza placas ateroscleróticas y suprime angiogénesis en ratones ApoE−/−

Resumen

El microRNA-342-5p (miR-342-5p) se ha implicado en aterosclerosis (AS), sin embargo su papel mecanicista permanece incierto. En este estudio, investigamos cómo miR-342-5p regula la vía de señalización Wnt3a e influye en vulnerabilidad de placa y neovascularización en un modelo murino ApoE-/- de AS. Ratones ApoE-/- machos de 24 semanas fueron alimentados con dieta alta en grasa por 16 semanas para inducir placas vulnerables. La expresión de miR-342-5p y Wnt3a se cuantificó por RT-qPCR y Western blot. Efectos funcionales de inhibición de miR-342-5p (antagomir) y sobreexpresión de Wnt3a (vector oe-Wnt3a) se evaluaron en lípidos séricos, citoquinas inflamatorias y de estrés oxidativo, morfología de placa y densidad microvascular (MVD). Resultados revelaron que miR-342-5p estaba up-regulado mientras Wnt3a y β-catenina estaban down-regulados en aortas AS, y miR-342-5p dirigía directamente el 3'-UTR de Wnt3a. Antagonizar miR-342-5p o sobreexpresar Wnt3a redujeron colesterol total, triglicéridos, LDL-C y citoquinas proinflamatorias (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α), aumentaron HDL-C y actividad SOD, redujeron área de núcleo lipídico, aumentaron contenido de colágeno, disminuyeron infiltración de macrófagos y redujeron MVD. En contraste, la sobreexpresión de miR-342-5p exacerbó todos estos parámetros. Así, miR-342-5p promueve inestabilidad de placa y angiogénesis al reprimir Wnt3a; restaurar Wnt3a mitiga estos efectos, sugiriendo un blanco terapéutico para AS.

Introducción

La aterosclerosis (AS) sigue siendo la causa principal de morbilidad y mortalidad cardiovascular mundial. La desestabilización de placa —caracterizada por núcleos necróticos ricos en lípidos, capas fibrosas delgadas, infiltración de macrófagos y colágeno reducido— conduce a ruptura y eventos agudos. Aunque terapias hipolipemiantes han mejorado resultados, muchos pacientes continúan experimentando eventos cardiovasculares, subrayando la necesidad de intervenciones moleculares novedosas.

Los microRNAs (miRNAs) son RNAs no codificantes cortos que regulan post-transcripcionalmente múltiples genes diana. miR-342-5p, ubicado dentro del cluster miRNA 14q32, se ha reportado influir en angiogénesis vía vías TGF-β y VEGF y modular respuestas inflamatorias en enfermedad vascular. Sin embargo, su papel específico en AS e interacción con cascadas de señalización clave permanecen incompletamente definidos.

La vía Wnt/β-catenina es crítica para homeostasis de células vasculares, influyendo proliferación de células musculares lisas, integridad endotelial y composición de placa. Trabajos previos indican que miR-342-5p regula negativamente Wnt3a en otros contextos de enfermedad, sugiriendo un eje regulatorio potencial en AS.

Aquí dilucidamos la interacción miR-342-5p/Wnt3a en AS y evaluamos su impacto en estabilidad de placa y angiogénesis en ratones ApoE-/-.

Materiales y Métodos

Animales y Ética

Ratones ApoE-/- y C57BL/6J machos (8 semanas) se alojaron bajo ciclo 12 h luz/12 h oscuridad y alimentados con dieta estándar o dieta alta en grasa (20 % grasa, 0,25 % colesterol) por 16 semanas. Todos los procedimientos siguieron directrices NIH y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Popular Provincial de Qinghai (número ético 201870726).

Diseño Experimental

Ratones ApoE-/- se asignaron aleatoriamente a seis grupos (n = 12 cada uno): AS, NC (salino), miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir, oe-Wnt3a, y miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a. Tratamientos (40 mg/kg, vena cola) se administraron quincenalmente por 8 semanas. Ratones C57BL/6J sirvieron como controles normales.

Análisis Bioquímicos

Colesterol total sérico (TC), triglicéridos (TG), LDL-C, HDL-C, malondialdehído (MDA) y superóxido dismutasa (SOD) se midieron usando kits comerciales (NanJing JianCheng Bioengineering Institute). Citoquinas (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α) se cuantificaron por ELISA (MultiSciences).

Procesamiento de Tejidos

Tras ayuno de 12 h, ratones fueron eutanasiados; aortas se cosecharon, lavaron en PBS libre de RNA, y dividieron para histología (HE, Rojo Aceite O, Rojo Sirius) o ensayos moleculares (RT-qPCR, Western blot). Muestras para histología se incluyeron en parafina, seccionaron (4 µm) y tiñeron según protocolos estándar.

Análisis de Expresión Génica y Proteica

RT-qPCR cuantificó miR-342-5p, Wnt3a, β-catenina y genes de referencia (U6, β-actina) usando método 2^−ΔΔCt. Western blot evaluó Wnt3a, β-catenina, CD34, α-SMA y β-actina, con densitometría ImageJ.

Inmunohistoquímica

Secciones se inmunotinciónaron para MOMA-2 (macrófagos), α-SMA (células musculares lisas) y CD34 (células endoteliales). Intensidad de tinción se cuantificó via Image Pro Plus 6.0, y el índice de vulnerabilidad de placa se calculó como (macrófagos + % lípidos) / (células musculares lisas + % colágeno). MVD se determinó contando micro-vasos CD34⁺/mm².

Ensayo de Luciferasa Reportero

El 3'-UTR de Wnt3a (tipo salvaje y mutante) se clonó en GP-miRGLO. Células endoteliales aórticas murinas se co-transfectaron con el reportero y concentraciones variables de miR-342-5p agomir; actividad de luciferasa se midió tras 48 h.

Análisis Estadístico

Datos se presentaron como media ± DE. Comparaciones de dos grupos usaron t-test no pareado; múltiples grupos usaron ANOVA de una vía con prueba post-hoc Tukey. Significancia se estableció en *p* < 0,05.

Resultados

miR-342-5p Up-regulado y Wnt3a Down-regulado en Aortas AS

RT-qPCR mostró aumento significativo de miR-342-5p (≈3,5-veces, *p* < 0,01) y disminución concurrente de Wnt3a (≈0,4-veces, *p* < 0,01) en ratones AS vs normales. Western blot confirmó niveles reducidos de proteína Wnt3a y β-catenina. Ensayos de luciferasa demostraron que miR-342-5p une directamente el 3'-UTR de Wnt3a, reduciendo actividad reportero hasta 64 % a 100 pM, efecto abolido al mutar sitio de unión.

Antagomir miR-342-5p o Sobreexpresión Wnt3a Mejoran Perfiles Lipídicos

Antagomir miR-342-5p y oe-Wnt3a redujeron marcadamente TC, TG y LDL-C (≈30–40 % reducción, *p* < 0,01) y aumentaron HDL-C (≈20 % aumento, *p* < 0,05) relativo a grupos AS y NC. Agomir miR-342-5p exacerbó dislipidemia. Sobreexpresión de Wnt3a rescató efectos adversos de sobreexpresión de miR-342-5p.

Marcadores Inflamatorios y de Estrés Oxidativo Suprimidos por Inhibición de miR-342-5p

IL-5 sérico, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α y MDA estuvieron elevados en ratones AS (*p* < 0,01). Antagomir miR-342-5p u oe-Wnt3a redujeron estas citoquinas y MDA ~40 % y aumentaron actividad SOD ~35 % (*p* < 0,01). Agomir miR-342-5p intensificó aún más marcadores inflamatorios y oxidativos.

Morfología de Placa Mejora con Inhibición de miR-342-5p o Sobreexpresión Wnt3a

Tinción HE reveló que grupos antagomir miR-342-5p y oe-Wnt3a exhibieron áreas de placa menores, capas fibrosas más gruesas, núcleos lipídicos reducidos y mayor contenido de colágeno (Rojo Sirius) comparado con grupos AS y NC (*p* < 0,01). Cuantificación Rojo Aceite O confirmó ~30 % disminución de contenido lipídico en grupos tratados. El índice de vulnerabilidad de placa disminuyó 45 % en grupos antagomir y oe-Wnt3a, mientras agomir miR-342-5p lo aumentó 60 % (*p* < 0,01).

Acumulación de Macrófagos y Presencia de Células Musculares Lisas se Modulan

Inmunohistoquímica mostró que antagomir miR-342-5p y oe-Wnt3a redujeron porcentajes de macrófagos MOMA-2⁺ ~50 % y aumentaron células musculares lisas α-SMA⁺ ~30 % relativo a grupos AS y NC (*p* < 0,01). Tratamiento combinado miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a restauró niveles de macrófagos y células musculares lisas hacia línea base.

Angiogénesis se Atenúa al Dirigir Eje miR-342-5p/Wnt3a

Inmunotinción CD34 y Western blot demostraron que antagomir miR-342-5p y oe-Wnt3a redujeron MVD ~55 % comparado con ratones AS (*p* < 0,01). Agomir miR-342-5p aumentó MVD ~70 % (*p* < 0,01). Tratamiento combinado moderó respuestas angiogénicas.

Discusión

Nuestros hallazgos revelan un eje miR-342-5p/Wnt3a previamente no caracterizado que gobierna metabolismo lipídico, inflamación, estrés oxidativo, composición de placa y neovascularización en aterosclerosis. La up-regulación de miR-342-5p en aortas AS suprime directamente Wnt3a, amortiguando señalización β-catenina y promoviendo fenotipo de placa vulnerable. Inversamente, inhibir miR-342-5p o restaurar Wnt3a restablece perfiles lipídicos protectores, reduce citoquinas proinflamatorias, mejora defensas antioxidantes, estabiliza arquitectura de placa y frena angiogénesis patológica.

Estos resultados se alinean con reportes de involucramiento de miR-342-5p en activación de macrófagos e inflamación, y con el papel establecido de señalización Wnt en biología vascular. El potencial terapéutico de modular este eje se subraya por la robusta reversión de hitos AS observada in vivo.

Conclusión

Este estudio es el primero en demostrar que miR-342-5p promueve vulnerabilidad de placa y angiogénesis al dirigir Wnt3a en ratones ApoE-/-. Inhibición farmacológica de miR-342-5p o up-regulación de Wnt3a estabiliza placas ateroscleróticas y puede representar una estrategia prometedora para tratamiento de AS.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos generados durante este estudio están incluidos en el artículo y sus materiales suplementarios. Consultas adicionales pueden dirigirse al autor correspondiente.

Abreviaturas

miR-342-5p

MicroRNA-342-5p

AS

Aterosclerosis

α-SMA

α-Actina de músculo liso

MVD

Densidad microvascular

miRNA

MicroRNA

oe

Sobreexpresión

NC

Control negativo

PBS

Salino fosfato amortiguado

TC

Colesterol total

TG

Triglicérido

LDL-C

Colesterol lipoproteína baja densidad

HDL-C

Colesterol lipoproteína alta densidad

ELISA

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

IL

Interleucina

TNF-α

Factor de necrosis tumoral alfa

IFN

Interferón

MDA

Malondialdehído

SOD

Superóxido dismutasa

RT-qPCR

Reacción en cadena de polimerasa con transcripción reversa cuantitativa