Las nanopartículas de maghemita actúan como nanozimas, mejorando el crecimiento y la tolerancia al estrés abiótico en Brassica napus

Discusión

El uso propuesto de ION como fertilizante de hierro se ha investigado antes en otros sistemas [17,18,19]. En esta investigación, se probó por primera vez si existe un efecto enzimático de un fertilizante similar, adicional al efecto de proporcionar el micronutriente, el hierro, a una importante especie de cultivo. El control recibió una cantidad adecuada de hierro quelado. También probamos un control positivo, en el que se complementó una cantidad equivalente molar de iones de hierro (III) al control negativo con una cantidad adecuada de hierro disponible en la planta. Por lo tanto, los efectos positivos de los ION observados en nuestros experimentos surgen de las propiedades de los ION. Nos gustaría sugerir que son los efectos enzimáticos conocidos de los ION los que están en juego [23, 25, 26]. Todavía no se pueden excluir otros mecanismos:los ION también podrían interactuar con proteínas, lípidos y otras biomoléculas [27], o puede ser que las nanopartículas absorban iones de hierro nativos en la superficie y, por lo tanto, reduzcan las reacciones de Fenton nocivas. El hecho de que los niveles de peróxido de hidrógeno de las hojas se redujeran en los tratamientos con ION es en sí mismo una prueba indirecta de la absorción de nanopartículas. Junto con una mayor concentración de hierro y una magnetización modificada en la maghemita, la imagen se vuelve más completa. El control positivo con iones de hierro (III) tuvo una concentración reducida de contenido de hierro en las hojas, lo que indica que las plantas tienen capacidad para reducir la absorción de iones de hierro como mecanismo de defensa. Esto sugiere además que el aumento de la concentración de hierro en las hojas en los tratamientos con maghemita son de hecho nanopartículas, que no son tan tóxicas para la planta como pueden serlo los niveles elevados de iones de hierro. Las medidas magnéticas muestran un comportamiento superparamagnético y momentos magnéticos de nanopartículas bloqueadas a baja temperatura típicos de γ-Fe ₂ muy pequeños O ₃ en las hojas tratadas con maghemita [28], lo que demuestra claramente la absorción de nanopartículas. La minúscula cantidad de Y administrada no debería producir ningún efecto sobre las plantas; se sabe poco sobre los efectos del Y en las plantas, pero Fu et al. (2014) estableció que 2 mg L ⁻¹ Y fue la dosis letal mediana (LD50) en un sistema hidropónico, y Maksimovic et al. (2014) comenzaron a ver efectos tóxicos a los 10 ⁻⁵ mol L ⁻¹ Y [29, 30]. En la concentración más alta utilizada en nuestros experimentos, una cantidad aproximada de 50 mg (5,6 10 ⁻⁴ mol) de Y se añadió por maceta mediante riego al suelo, del cual sólo se puede esperar que se absorba una fracción. Lo que se absorbe no debe estar fácilmente disponible como iones, sino que debe estar unido a las partículas de maghemita. El propósito de introducir Y en la síntesis es reducir la solubilidad de las nanopartículas de maghemita y también prevenir la transformación en hematita, una forma menos enzimática de óxido de hierro. Sin duda, es beneficioso tener una mayor actividad de la catalasa durante las condiciones de estrés [31], ya que se sabe que una amplia gama de condiciones de estrés causan acumulaciones tóxicas de H ₂ O ₂ [32] _. Además, se ha vuelto cada vez más evidente que H ₂ O ₂ también sirven como una molécula de señalización para el estrés [32, 33]. Aún no se ha corroborado el aumento de la producción de biomasa, preferiblemente también considerando los rendimientos y la calidad de las semillas oleaginosas. Otras características, como una mayor velocidad de crecimiento de las hojas, una propiedad muy buena en un entorno agrícola donde la competencia contra las malas hierbas es crucial, pueden tenerse en cuenta fácilmente. Se ha mostrado en Arabidopsis que las partículas de hierro nanovalente cero pueden inducir la extrusión de protones en el apoplasto de las hojas y, por lo tanto, permitir la expansión de la pared celular impulsada por la turgencia [34]. El mismo efecto también se observó en las raíces, lo que también podría ser beneficioso durante el estrés por sequía [35]. También observaron un aumento en las aberturas estomáticas de las hojas, lo que podría conducir a la pérdida de agua, pero cuando midieron, solo hubo una diferencia marginal en comparación con el control. Es una paradoja conocida que la relación entre la apertura de los estomas y la transpiración de agua no es lineal [36]. Esta relación también se ve muy afectada por el medio ambiente, por ejemplo, la humedad relativa o el viento [37]. Aunque, por supuesto, las nanopartículas de valencia cero no deben considerarse lo mismo que la maghemita, se debe investigar el mecanismo de elongación de la hoja observado en nuestros experimentos. Ghafariyan y col. (2013) observaron, como hicimos nosotros, un aumento en la concentración de clorofila en las hojas tras la adición de ION en comparación con un control negativo sin hierro en absoluto. Cuando lo compararon con el hierro quelado no hubo diferencia. Sin embargo, agregar cantidades iguales de hierro quelado como ION dará como resultado más hierro disponible para las plantas, ya que en el caso de las partículas, gran parte del hierro se almacena en las estructuras cristalinas. Por lo tanto, existe la posibilidad de que las plantas solo fertilizadas con ION en realidad sufran deficiencia de hierro. Encontramos mayores cantidades de clorofila en las hojas (de acuerdo con las mediciones de SPAD, ver Fig. 1) cuando se agregaron ION como auxiliares del hierro quelado. También medimos una cantidad reducida de peróxido de hidrógeno y MDA en las hojas, después de la sequía, cuando agregamos ION. Rui y col. (2016) no midieron el peróxido de hidrógeno sino el MDA y las enzimas relacionadas con el estrés oxidativo. Sugirieron que el estrés oxidativo no ocurre por la adición de ION y, de hecho, también encontraron una cantidad reducida de MDA en las hojas, en comparación con el hierro quelado, en 10 mg kg ⁻¹ concentración. En las raíces, vieron una reducción de MDA a medida que aumentaron la concentración de ION. También midieron una cantidad reducida de superóxido dismutasa y actividad peroxidasa en comparación con el hierro quelado, lo que sugiere que nuestra hipótesis de que los ION pueden funcionar como captadores reactivos de oxígeno, in vivo, podría ser correcta. La eliminación de oxígeno reactivo se demostró aún más mediante nuestra reducción medida de peróxido de hidrógeno en las hojas de Brassica napus . Esto explica la mayor resistencia a la sequía que se observa al agregar ION.

Conclusiones

Nuestros experimentos han proporcionado evidencia del mecanismo de las ION que actúan como nanozimas en planta , revelando un acoplamiento entre una disminución en el contenido de peróxido de hidrógeno en las hojas de Brassica napus e introducción de ION. La mayor resistencia a la sequía que se observa tras la adición de ION puede, por tanto, estar relacionada con el alivio del estrés oxidativo.

Métodos

Diseño y condiciones experimentales

Brassica napus semillas, de la variedad de colza de primavera Larissa (Scandinavian Seed AB, Lidköping, Suecia), se esterilizaron y germinaron en placas de agar durante 3 días antes de que las plántulas de tamaños similares se transfirieran a macetas con S-Soil esterilizado (jardín de Hasselfors, Örebro, Suecia) . Es un suelo para el crecimiento profesional de plántulas con baja cantidad de todos los macro y micronutrientes, perlita para aireación, ácidos húmicos estimulantes del crecimiento y un pH de 6. Las plantas se dejaron asentar en las macetas durante 7 días, regadas con desionizado. agua. Antes de que se iniciaran los tratamientos, las plantas se distribuían entre bandejas, de modo que el tamaño de la planta fuera lo más consistente posible. A partir del día siete, después de la transferencia a macetas, las plantas se regaron con solución nutritiva, solución nutritiva con FeCl ₃ adicional. o solución nutritiva con diferentes concentraciones de γ-Fe ₂ O ₃ ION. Cada maceta se regó con 40 ml todos los días. Las plantas se cultivaron en una cámara de crecimiento con 16 h de luz (180 μE m ⁻² s ⁻¹ ) y 8 h de oscuridad. La temperatura se fijó en 25 ° C durante la irradiación y 22 ° durante la oscuridad y la humedad relativa en 65%. Las plantas se cultivaron en macetas de 8 x 8 cm en bandejas con ocho macetas cada una. Cada tratamiento contó con dos bandejas y 16 réplicas biológicas. Las bandejas se movían en orden rotativo todos los días para compensar cualquier variación en la cámara. El tratamiento continuó durante 5 días agregando un total de 200 ml de 0.5, 0.8, 1 o 2 mg ml ⁻¹ , en total 100, 160, 200 o 400 mg por planta, respectivamente. Después de los 5 días de agregar ION, todos los tratamientos se regaron con una solución nutritiva (Archivo adicional 1:Tabla S1), durante otros 5 días antes de que se iniciaran los 4 días de sequía. Después de 4 días de sequía, se realizaron mediciones de peróxido de hidrógeno y peroxidación lipídica y las plantas se regaron nuevamente con la misma solución nutritiva durante 3 días para estudiar la recuperación. El experimento se repitió cuatro veces.

Caracterización y síntesis de nanopartículas

Las partículas de maghemita se produjeron de acuerdo con el método de [38] con aproximadamente 13% en peso de itrio (Y) y se caracterizaron por difracción de rayos X (XRD), microscopía electrónica de barrido (SEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), espectroscopía infrarroja (FTIR), análisis termogravimétrico (TGA) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Las imágenes SEM se adquirieron con un Hitachi TM1000, con espectrómetro de rayos X de dispersión de electrones (EDS) Oxford μDeX. El tamaño hidrodinámico se midió mediante análisis de seguimiento nano (NTA) en el Nanosight 300 (Fig. 11). Se usó un Perkin-Elmer Spectrum 100 para realizar espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) en gránulos de bromuro de potasio (KBr). Para el análisis termogravimétrico (TGA), se utilizó un Perkin-Elmer Pyris 1 y para la microscopía de fuerza atómica (AFM), un Bruker FastScan (Fig. 12). La XRD se realizó en un difractómetro multipropósito Bruker Smart ApexII con fuente de molibdeno; el tamaño del cristalito se calculó con la ecuación de Sherrer usando el pico más grande en un ángulo de 2θ ° 16,197 con un ancho medio máximo (FWHM) de 1.01358489355378 calculado por la función de búsqueda de picos del software Origin (Fig. 13). Los ION secos se suspendieron en una solución nutritiva, con 3.4 mg L ⁻¹ Hierro quelado, el mismo que se utiliza como control. Para obtener una lista completa de todos los nutrientes, consulte el archivo adicional 1:Tabla S1.

Distribución del tamaño de partícula hidrodinámica en agua, medida por NTA, de γ-Fe ₂ O ₃ sintetizado mediante síntesis sol-gel dirigida por itrio. Los valores se promedian a partir de cuatro mediciones repetidas, y el área dentro de las líneas finas representa el error medio

Nanopartículas de maghemita sintetizadas a través de sol-gel dirigido con itrio, dispersadas en una oblea de silicio y fotografiadas con AFM. La misma imagen está representada en 3D y 2D

Un difractograma de polvo de las nanopartículas de maghemita producidas. Los picos se alinean con las posiciones de la maghemita estándar de la base de datos que se ve como un punto con una línea descendente en la base de la figura. El tamaño de la cristalita se calculó a partir del pico más grande en 16.197 2 θ grados de ángulo

Mediciones de rasgos de plantas

Antes de iniciar el tratamiento, se midió la longitud de la hoja más larga, la primera hoja verdadera, de cada planta. Posteriormente, después de los 5 días de riego secuencial con ION en solución nutritiva o solución nutritiva sola, se volvió a medir la misma hoja. Los resultados se informan como aumento porcentual. La clorofila foliar se evaluó mediante mediciones de SPAD con el medidor de SPAD de Minolta, antes, durante y después del tratamiento y posteriormente después de la sequía. Se promediaron tres mediciones, en dos hojas por planta, para cada una de las 16 réplicas biológicas. Finalmente, la biomasa aérea de todas las plantas se pesó y se colocó en papel de aluminio para secar a 110 ° C durante 72 h.

Contenido de hierro y medidas magnéticas

Después de cinco días de sequía, se terminó el experimento y todo el tejido vegetal por encima del suelo se incineró a 450 ° C durante 24 h. Una vez homogeneizada la ceniza, se pesaron 10 mg por muestra y se disolvieron en 3 ml de ácido clorhídrico al 36% en un agitador durante la noche. Luego, las muestras se diluyeron con 44,74 ml de etanol al 10% en agua Milli-Q y posteriormente se midió el hierro con ICP-AES a 238,204 nm. Para las mediciones magnéticas, se colocó la misma ceniza en el portamuestras y se pesó el peso exacto de cada muestra con una balanza de precisión. Luego, la muestra se enfrió a 2 K y se realizó un barrido de campo magnético de 10,000 a 0 Oersted en un magnetómetro de dispositivo de interferencia cuántica superconductora (SQUID). El momento magnético debido al portamuestras se restó del momento magnético medido antes de normalizarlo con el peso del hierro en la muestra.

Mediciones de peróxido de hidrógeno

El peróxido de hidrógeno en las hojas se midió mediante el método eFOX informado por [39]. Las 16 plantas se combinaron en cuatro réplicas biológicas con cuatro plantas cada una. Se tomaron cincuenta miligramos de la hoja más joven y aún fresca de cada planta. Luego, se pulverizaron 200 mg de material foliar en un mortero preenfriado en nitrógeno líquido. Al polvo, agregamos 4 ml de tampón fosfato 100 mM (pH 6,9) y trituramos el hielo en un líquido homogéneo. De este líquido homogéneo, transferimos 1900 μl a un tubo Eppendorf de 2 ml y agregamos 20 μl de sulfato de amonio ferroso 25 mM (sal de Mohrs), 20 μl de sorbitol 10 mM, 20 μl de xilenol naranja 10 mM, 20 μl de 99 % de etanol y 20 μl de ácido sulfúrico 250 mM. Se tomó un espectro de absorbancia visible completo para cada muestra, pero se utilizó la diferencia entre 550 y 800 nm para la cuantificación del peróxido de hidrógeno. Se realizó una curva de calibración de peróxido de hidrógeno de 2 a 40 μM con R ² valor de 0,9946.

Peroxidación de lípidos

La peroxidación lipídica se midió según el método de [40]. Las muestras se recolectaron de la misma manera que para las mediciones de peróxido de hidrógeno, excepto que se homogeneizaron en 4 ml de w al 0,1%. / v ácido tricloroacético (TCA). La absorbancia se midió a 532 nm y se corrigió por turbidez inespecífica restando la absorbancia a 600 nm. El coeficiente de extinción de 155 mM cm ⁻¹ se utilizó para calcular la concentración de malondialdehído (MDA).

Análisis estadístico

Todas las estadísticas se realizaron en el software Minitab 17. Todos los datos se ejecutaron mediante un ANOVA de una vía con la prueba de Fisher para agrupación. t del estudiante se realizó una prueba para encontrar p específicos valores entre grupos que tienen diferencias estadísticamente significativas.

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