Liberación Génica Mejorada Usando Nanopartículas de Oro Funcionalizadas con Quitosano, Quitosano N-Acilado y Oligosacárido de Quitosano

Resumen

Las nanopartículas de oro (AuNPs) se usan cada vez más en investigación biomédica debido a sus propiedades ópticas únicas, alta densidad y facilidad de modificación superficial. Aquí presentamos una plataforma de liberación génica no viral que combina AuNPs con tres polímeros derivados de quitosano: quitosano nativo (CO), quitosano N-acilado (Acyl-CO) y oligosacárido de quitosano (COS). Se exploraron dos rutas sintéticas: una reducción química convencional con borohidruro de sodio y una síntesis verde en un solo paso donde COS reduce y estabiliza simultáneamente las AuNPs. Los nanocompuestos resultantes se caracterizaron completamente por espectroscopía UV-Vis, potencial ζ, FTIR y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Electroforesis en gel de agarosa confirmó complejación robusta de ADN plasmídico (pDNA), y la eficiencia de transfección en células HEK-293 se evaluó via actividad β-galactosidasa y fluorescencia EGFP. Se alcanzaron tasas de transfección de 27 %, 33 % y 60 % con CO-AuNPs, Acyl-CO-AuNPs y COS-AuNPs, respectivamente, demostrando que la formulación verde basada en COS ofrece rendimiento superior de liberación génica mientras evita agentes reductores tóxicos.

Antecedentes

La terapia génica depende de la entrega de material genético terapéutico en células diana. Mientras los vectores virales proveen altas eficiencias de transfección, sufren de inmunogenicidad, capacidad de carga limitada y complejidad de producción. Los portadores no virales, en contraste, son más seguros, fáciles de producir y más estables durante almacenamiento. El quitosano, un polisacárido natural derivado de quitina, ha emergido como vector no viral prometedor por su carga positiva, baja toxicidad y capacidad para proteger ADN de degradación enzimática. Sin embargo, el quitosano nativo es poco soluble a pH fisiológico y altamente viscoso en soluciones ácidas diluidas, limitando su aplicación biomédica. Modificaciones químicas como N-acilación aumentan hidrofobicidad y ajustan grado de desacetilación, mientras la oligomerización (COS) reduce viscosidad y mejora captación celular debido a longitudes de cadena más cortas.

Las nanopartículas de oro, con su tamaño ajustable, resonancia plasmónica superficial y fuerte afinidad por grupos amina, tiol y cianuro, son candidatos ideales para construir nanotransportadores multifuncionales. Polímeros catiónicos como quitosano pueden injertarse en AuNPs para crear superficies cargadas positivamente que unen electrostáticamente ADN plasmídico, facilitando internalización celular. Además, la alta densidad de AuNPs promueve captación celular rápida, y sus propiedades ópticas permiten monitoreo en tiempo real de la entrega.

Estudios previos han demostrado que conjugados quitosano-AuNP pueden alcanzar eficiencias de transfección más altas que liposomas o nanopartículas poliméricas. Sin embargo, la mayoría de síntesis dependen de agentes reductores tóxicos como borohidruro de sodio o bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB). En este trabajo, introducimos una ruta de síntesis verde que usa COS como agente reductor y estabilizador, eliminando químicos peligrosos mientras preserva las propiedades físico-químicas favorables de los nanocomplejos.

Métodos

Síntesis de Nanocompuestos

Se prepararon tres formulaciones distintas de AuNP (Fig. 2). CO-AuNPs y Acyl-CO-AuNPs se sintetizaron vía reducción química con NaBH₄, mientras COS-AuNPs se produjeron por un método verde en un solo paso donde COS reduce simultáneamente Au³⁺ y recubre las nanopartículas.

Materiales

Cloruro de oro(III) trihidrato (HAuCl₄·3H₂O), borohidruro de sodio (NaBH₄), quitosano de bajo peso molecular (50-190 kDa, 75 % desacetilación) y COS (5 kDa) se compraron de Sigma-Aldrich. Toda la cristalería se limpió con agua regia por 24 h y se enjuagó con agua Milli-Q para remover trazas metálicas.

CO-AuNPs

CO (2 mg mL⁻¹) se disolvió en ácido acético 1 % y se almacenó durante la noche. La solución se filtró (0,22 µm) y se mezcló con HAuCl₄ 10 mM (1 mL) bajo agitación vigorosa por 30 min. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) se añadió gota a gota; el color cambió de amarillo a rojo vino, indicando formación de nanopartículas. La agitación continuó por 2 h.

Acyl-CO-AuNPs

La acilación de quitosano de bajo peso molecular se realizó con cloruro de caproilo siguiendo protocolo modificado. El gel resultante se precipitó con acetona, se lavó con metanol y se secó. El gel (0,33 % en HCl 0,1 M) se mezcló con HAuCl₄ 10 mM (1 mL) y se agitó por 1 h. NaBH₄ (100 mM, 0,4 mL) se añadió entonces, produciendo una solución rosa-roja que se coloreó completamente en 2 h de agitación.

COS-AuNPs

Para la síntesis verde, COS (100-200 mg) se añadió a HAuCl₄ (0,003-0,017 % en peso) y se agitó a 80 °C durante 60 min. Se prepararon cuatro variantes, diferiendo en cantidad de COS y concentración de oro (Tabla 1). Las nanopartículas se purificaron por centrifugación (12 000 g, 30 min).

Caracterización

FTIR

Espectros FTIR (Perkin Elmer Spectrum One) confirmaron presencia de bandas amida y acilación exitosa de Acyl-CO. El grado de sustitución (DS) se calculó como 75 % usando la razón de absorbancias a 1651 cm⁻¹ y 3350 cm⁻¹.

Potencial ζ

Mediciones de potencial zeta (Malvern Nano Z) revelaron cargas superficiales positivas (43-55 mV) para todos los compuestos, confirmando su idoneidad para unión de ADN. Valores post-complejación cayeron, indicando adsorción exitosa de plasmido.

UV-Vis

Espectros UV-Vis (400-700 nm) mostraron picos de resonancia plasmónica superficial localizada (LSPR) a 534 nm (CO-AuNPs), 507 nm (Acyl-CO-AuNPs) y 533-536 nm (COS-AuNPs). Los espectros permanecieron inalterados tras 150 días, evidenciando estabilidad coloidal.

TEM

Imágenes TEM (JEOL JEM-1010) revelaron nanopartículas esféricas con diámetros de 3 a 15 nm. Las distribuciones de tamaño fueron más estrechas para COS-AuNPs, reflejando monodispersidad superior.

Formación de Complejo y Unión de ADN

Plasmidos pSV-β-Gal (6,82 kb) y pIRES2-EGFP (5,3 kb) se purificaron vía lisis alcalina. ADN (200-400 ng) se mezcló con cada nanocompuesto en DMEM, y electroforesis en gel de agarosa (0,8 % agarosa, 90 V, 60 min) demostró retención completa de ADN en los pozos, confirmando complejación electrostática.

Transfección Celular

Cultivo Celular

Células HEK-293 se sembraron a 12 000 células por pozo en placas de 96 pozos, alcanzando ~90 % confluencia tras 24 h.

Transfección EGFP

Complejos (15 µL, 200 ng ADN) se añadieron a células por 2 h, seguidos por 48 h incubación en DMEM completo. Expresión GFP se cuantificó por microscopía de fluorescencia (Carl Zeiss Axio Vert.A1).

Transfección β-Galactosidasa

Tras 24 h incubación, las células se fijaron e incubaron con solución X-gal. Tinción azul, indicativa de actividad β-galactosidasa, se observó por microscopía de campo claro (Motic AE2000). LipofectAMINE™ 2000 sirvió como control positivo.

Viabilidad Celular

Exclusión de azul tripano (0,2 %) evaluó viabilidad 2 h post-transfección. Rangos de concentración fueron 0,1-3 mM para CO-AuNPs y Acyl-CO-AuNPs, 0,5 mM para COS@3-AuNPs y COS@4-AuNPs, y 0,1 mM para COS@1-AuNPs y COS@2-AuNPs.

Resultados y Discusiones

Síntesis y Caracterización de Nanocompuestos

Los COS-AuNPs verdes se produjeron sin reactivos peligrosos, demostrando la factibilidad de una ruta de síntesis totalmente biocompatible. Espectros UV-Vis (Fig. 3) confirmaron formación de AuNPs, con picos LSPR consistentes en todas las formulaciones. Pruebas de estabilidad tras 150 días mostraron ningún desplazamiento espectral, indicando robustez coloidal excelente.

Estabilidad

Espectros UV-Vis tras 150 días: CO-AuNPs (a), Acyl-CO-AuNPs (b), COS-AuNPs (c).

FTIR

Espectros FT-IR de quitosano, quitosano acilado y COS. Bandas clave: 1651 cm⁻¹ (amida I), 1591 cm⁻¹ (amida II).

Potencial ζ

Tabla 2 lista valores de potencial ζ: CO-AuNPs 43,3 mV, Acyl-CO-AuNPs 40,2 mV, COS-AuNPs 46,3-55,3 mV. Todos los valores permanecieron positivos tras unión de ADN, confirmando complejación.

TEM

Micrografías TEM: (a) Acyl-CO-AuNPs 4,7 nm, (b) CO-AuNPs 3,5 nm, (c-f) COS-AuNPs 7,4-15,6 nm.

Complejación de ADN

Geles de agarosa (Fig. 7) mostraron retención completa de ADN en todos los nanocomplejos, mientras plasmido libre migró al fondo. COS-AuNPs mostraron la unión más fuerte, reteniendo hasta 350 ng de plasmido antes de saturación.

Eficiencia de Transfección

En células HEK-293, COS-AuNPs alcanzaron las tasas de transfección más altas: 60 % con β-galactosidasa y 48 % con EGFP. Acyl-CO-AuNPs y CO-AuNPs alcanzaron 33 % y 27 % respectivamente. El rendimiento superior de COS-AuNPs se atribuye a su mayor relación quitosano/oro y tamaño de partícula óptimo.

Viabilidad Celular

Exclusión de azul tripano reveló alta viabilidad (>90 %) para COS-AuNPs, mientras LipofectAMINE™ 2000 y CO-AuNPs mostraron tasas de supervivencia menores (61 % y 78 %). COS-AuNPs por tanto combinan alta eficiencia de transfección con citotoxicidad mínima.

Conclusiones

Hemos fabricado exitosamente conjugados nanopartícula de oro-quitosano vía rutas convencionales y verdes. Los COS-AuNPs, sintetizados sin reactivos tóxicos, mostraron eficiencia de transfección superior (hasta 60 %) y excelente citocompatibilidad (>93 %). Su distribución de tamaño estrecha y carga superficial positiva permiten unión robusta de plasmido y captación celular eficiente. Estos hallazgos posicionan a COS-AuNPs como plataforma prometedora de liberación génica ambientalmente amigable adecuada para desarrollo preclínico adicional.