Mejora de la Biocompatibilidad de Andamios Nanofibrosos de Polianilina/Ácido Poliláctico mediante Morfología de Superficie Controlada vía Dopaje con Ácidos Inorgánicos

Resumen

Los andamios nanofibrosos conductivos y degradables tienen gran potencial para promover crecimiento, proliferación y diferenciación celular bajo campo eléctrico externo. Aunque persiste el problema de conductividad eléctrica inferior en fluidos corporales, las nanofibras degradables basadas en polianilina (PANI) pueden promover adhesión, crecimiento y proliferación celular. Para investigar si el efecto es causado por la morfología de PANI, seleccionamos tres ácidos inorgánicos como dopantes en el proceso de polimerización oxidativa in situ de PANI: ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido perclórico. Las nanofibras compuestas de polianilina/ácido poliláctico (PANI/PLA) obtenidas se caracterizaron mediante SEM, FTIR y análisis XPS, confirmando que las nanofibras de PLA fueron recubiertas exitosamente por PANI sin cambio en la estructura porosa. Las propiedades mecánicas in vitro y degradabilidad indicaron que la oxidación de dopantes ácidos debe considerarse y que probablemente tiene un efecto de degradación oxidativa mayor en nanofibras de PLA. La prueba de ángulo de contacto demostró que nanofibras compuestas PANI/PLA con diferentes morfologías de superficie tienen buena mojabilidad, implicando que cumplen requisitos de andamios para ingeniería de tejido óseo. La rugosidad superficial y viabilidad celular demostraron que diferentes morfologías de PANI en la superficie pueden promover proliferación celular. Cuanto mayor la rugosidad superficial de PANI, mejor la biocompatibilidad. Consecuentemente, la morfología de superficie regulada de nanofibras compuestas PANI/PLA vía dopaje con diferentes ácidos tiene efecto positivo en biocompatibilidad en ingeniería de tejidos.

Introducción

La matriz extracelular (MEC) es un tipo de red macromolecular secretada por células en el estroma extracelular. Presenta la base de células, tejidos y órganos, acompañándolos, y se caracteriza por una estructura de cuadrícula compleja [1, 2]. Además, proporciona un sitio adecuado para la supervivencia y actividad de células, determinando su forma, controlando su diferenciación, participando en su migración y metabolismo, y afectando finalmente su supervivencia, crecimiento y muerte [3, 4]. Las nanofibras por electrohilado pueden simular la acción de la matriz extracelular para regular el comportamiento celular debido a su alta área superficial específica, propiedades mecánicas adecuadas y biodegradabilidad. Además, las nanofibras por electrohilado pueden ser multifuncionales mediante modificación de superficie manteniendo su estructura porosa. Por tanto, las nanofibras por electrohilado se han convertido en material candidato prometedor en ingeniería de tejidos, ampliamente aplicadas en administración de fármacos, regeneración ortopédica, regeneración nerviosa y reparación [5-10].

Los polímeros conductivos (ej. polipirrol [PPy], politiofeno [PTH], polianilina [PANI]) tienen buena biocompatibilidad in vitro e in vivo, afectando significativamente adhesión, proliferación y diferenciación celular así como regeneración tisular [11-13]. Entre estos, PANI se considera material potencial para ingeniería de tejidos y medicina regenerativa debido a su buena procesabilidad, excelente conductividad, buena estabilidad redox y biocompatibilidad [14, 15]. Bajo estimulación eléctrica, PANI puede regular adhesión, proliferación, migración y diferenciación celular [16, 17]. Numerosos informes concluyen que nanofibras compuestas conductoras degradables basadas en PANI promueven comportamiento celular bajo campo eléctrico [18-21]. Sin embargo, esto implica un problema crucial: la conductividad de PANI en ambiente fisiológico (pH = 7,4) se debilita por desdopaje de PANI, lo que, como demuestran estudios previos, disminuye sus ventajas de actividad eléctrica para promover proliferación y diferenciación celular [22]. Aunque esto presenta una limitación de nanofibras conductoras degradables basadas en PANI en ingeniería de tejido óseo bajo estimulación eléctrica externa, aún pueden promover proliferación y crecimiento celular significativamente [23, 24]. Aquí especulamos que la morfología de superficie de PANI aumenta la rugosidad de nanofibras compuestas, lo que favorece adhesión, crecimiento y proliferación celular.

La polianilina dopada con ácidos inorgánicos generalmente tiene buena conductividad eléctrica. Sin embargo, los aniones introducidos por diversos dopantes ácidos inorgánicos afectarán la conductividad y estructura de polianilina [25-27]. En este trabajo, tres ácidos inorgánicos comunes: ácido clorhídrico (HCl, HA), ácido sulfúrico (H₂SO₄, SA) y ácido perclórico (HClO₄, PA), se seleccionaron como dopantes en polimerización oxidativa in situ de PANI. Luego, se investigaron propiedades mecánicas, mojabilidad, morfología de superficie, biocompatibilidad y adhesión celular de nanofibras PANI/ácido poliláctico (PLA) bajo diferentes dopantes ácidos. Los resultados indicaron que mayor rugosidad superficial de PANI mejora proliferación celular, mostrando mejor biocompatibilidad.

Métodos/Experimental

Reactivos

Anilina (AN) se compró en Sigma, PLA (Mw = 60,000) en Solarbio, diclorometano (DCM) en Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., y N,N-dimetilformamida (DMF) en Macklin. Persulfato de amonio (APS) en Aladdin, HCl y H₂SO₄ en Guangzhou Chemical Co., Ltd., y HClO₄ en Macklin.

Preparación de Nanofibras de Polianilina/Ácido Poliláctico

Fabricación de Nanofibras de Ácido Poliláctico por Electrohilado

Partículas de PLA con masa específica se añadieron a solución mixta de DCM y DMF (proporción volumétrica 7:3) antes de agitar hasta disolución, obteniendo solución mixta de 10 % PLA. La solución se dispensó en jeringa conectada a fuente de alto voltaje. La máquina de electrohilado (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) se configuró con voltaje 15 kV y distancia 15 cm. Las nanofibras de PLA obtenidas se secaron al vacío overnight a 40 °C.

Preparación de Nanofibras de Polianilina/Ácido Poliláctico Dopadas con Diferentes Ácidos Inorgánicos

Las nanofibras de PLA se colocaron en cámara de máquina de limpieza por plasma (PCE-6, MTI Corporation, USA) y descargaron 2 min a 30 W potencia RF. En este trabajo, tres ácidos inorgánicos comunes (HCl, H₂SO₄, HClO₄) se usaron como dopantes para polimerización oxidativa in situ en preparación de nanofibras PANI/PLA [24], y las nanofibras PANI correspondientes se marcaron como PANI-HA, PANI-SA, PANI-PA, mientras que nanofibras nanocompuestas PANI/PLA se etiquetaron como PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA, PANI/PLA-PA. El proceso de preparación de nanofibras PLA y compuestas PANI/PLA se muestra en Fig. 1.

Esquema del proceso de preparación de nanofibras PLA y compuestas PANI/PLA

Las nanofibras nanocompuestas PANI/PLA se prepararon en condiciones de baño de hielo [16, 28]. APS y AN se añadieron a solución ácida 1 M según proporción molar 1:1. Tomamos HCl como ejemplo para ilustrar el proceso de preparación de nanofibras PANI/PLA. En baño de hielo, AN (930 mg, 0,01 mol) se añadió gota a gota en APS (2,280 mg, 0,01 mol) disuelto en 50 mL de HCl 1 M. Inmediatamente, la membrana de nanofibras PLA tratada por plasma se sumergió en la solución y agitó 2 h a 0 °C. Tras la reacción, la membrana se lavó varias veces con HCl y etanol para eliminar PANI no adherido antes de secar overnight a 40 °C para obtener nanofibras PANI/PLA-HA, reservadas para uso posterior. Nanofibras compuestas PANI/PLA-SA y PANI/PLA-PA se obtuvieron con enfoque similar.

Caracterización

Las pruebas de tracción uniaxial para nanofibras PLA y compuestas PANI/PLA se realizaron mediante prueba tensión-deformación (Shimadzu AGX-PLUS, Japón). La muestra se cortó en forma de mancuerna, con velocidad de tracción constante 3 mm/min. El módulo de Young se calculó de la región lineal 0-15 % en curva tensión-deformación, y la resistencia a tracción y tasa de fractura se determinaron de la fractura de membrana nanofibrilar.

La morfología de andamios nanofibrilares se caracterizó mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Japón) para observar diferentes morfologías de PANI dopado con diferentes ácidos inorgánicos. Previo a observación SEM, muestras se rociaron con oro 60 s para observación más clara. La rugosidad superficial de nanofibras compuestas PANI/PLA se midió usando microscopía de fuerza atómica (AFM, Bruker Dimension Edge). Para confirmar que PANI se cargó completamente en nanofibras PLA, se usó espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) para medir cambio de longitud de onda 2000-500 cm⁻¹. Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS; Thermo ESCALAB 250) y Al-Kα se usaron como fuentes de emisión de rayos X para determinar composición superficial de nanofibras PANI/PLA, mientras su mojabilidad se midió en términos de ángulo de gotas de agua a temperatura ambiente vía análisis de ángulo de contacto (OCA 15 plus, Alemania). La degradación de nanofibras se evaluó usando método de pérdida de masa [29, 30]. Membranas nanofibrilares se cortaron en discos 16 mm y colocaron en 20 mL de solución salina fosfato (PBS) pH 7,4 antes de incubar andamios a 37 °C por 7, 14 y 21 días y secar a peso constante.

Biocompatibilidad de Andamios Nanofibrosos Compuestos PANI/PLA

Biocompatibilidad

En este trabajo, la biocompatibilidad de andamios nanofibrosos compuestos PANI/PLA se caracterizó por experimento de actividad de células de osteosarcoma humano (HOS). Células HOS se compraron en banco de células de Academia China de Ciencias, Shanghai. Las células HOS se cultivaron en medio DMEM modificado de Eagle de baja glucosa con 10 % suero fetal bovino, 100 U/mL penicilina y 100 U/mL estreptomicina antes de incubar a 37 °C y 5 % CO₂. Cuando el crecimiento celular alcanzó grado de fusión 90 %, las células se pasaron a proporción 1:3.

Las células HOS se sembraron en nanofibras PANI/PLA previo a prueba de proliferación. Las nanofibras se colocaron en placa de 96 pozos cubriendo completamente el fondo antes de esterilizar por UV 30 min y solución etanol 75 % 30 min. Luego se lavaron con PBS. Las nanofibras se inocularon con densidad 1 × 10⁴ por pozo, mientras se establecieron simultáneamente grupo en blanco y control. Las células se incubaron en incubadora a 37 °C por uno, tres y cinco días, renovando medio cada dos días.

La viabilidad celular de nanofibras PANI/PLA se evaluó usando ensayo 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazolio bromuro (MTT). Tras incubación a uno, tres y cinco días, el medio se retiró de placa de 96 pozos y lavó con PBS tres veces antes de añadir 1 mL DMEM con 10 % 5 mg/mL MTT. El medio se incubó a 37 °C 4 h y luego retiró antes de añadir DMSO para disolver metilprednisolona. El medio se vibró 10 min, y luego se determinó absorbancia (BioTek Synergy HTX, USA).

Inmunofluorescencia

Las células HOS se incubaron en incubadora de nanofibras PANI/PLA 24 h y lavaron con PBS tres veces. Luego, las células se fijaron con 4 % paraformaldehído 10 min a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron con PBS tres veces (10 min cada vez) y se añadió 10 μL de péptido marcado con FITC 100 nM antes de incubar 30 min a temperatura ambiente y lavar con PBS tres veces (5 min cada vez). El actina extracelular de células HOS se tiñó, con microscopía confocal (Tipo A1, Nikon, Japón) para observar tinción celular a aumento 20×.

Adhesión Celular

La adhesión de células HOS en andamios nanofibrosos compuestos PANI/PLA se observó vía SEM. El medio de cultivo se retiró tras cultivo 24 h de células HOS en nanofibras PANI/PLA y lavó con PBS tres veces antes de añadir 4 % PFA. El medio se fijó overnight a 4 °C, lavó con PBS tres veces, deshidrató con solución etanol gradiente (30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 90 %, 100 %; 20 min cada vez), y luego liofilizó 24 h. Previo a observación SEM, nanofibras se rociaron con platino 120 s para mejor observación.

Actividad Fosfatasa Alcalina (ALP)

ALP es uno de los marcadores tempranos de diferenciación de osteoblastos que dependen de expresión de enzima fosfatasa alcalina. Aquí, actividad ALP se realizó usando Kit ALP Assay (Beyotime Biotechnology, P0321S). Células HOS se cultivaron en diferentes andamios compuestos PANI/PLA por 7 días designados. Las células lisisaron con 50 μL Tris-HCl (0,1 M, pH 8) con 0,1 % (v/v) triton X-100. La actividad ALP se analiza cuantificando concentración de p-nitrofenol de p-nitrofenil fosfato (PNPP), estimada registrando absorbancia a 405 nm. El porcentaje de actividad ALP de células cultivadas en nanofibras PANI/PLA se calcula comparando actividad ALP de células cultivadas en nanofibras PLA prístinas.

Análisis Estadístico

La significancia estadística de resultados se evaluó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) usando GraphPad Prism (versión 8.02). Se analizaron diferencias en propiedades mecánicas, biodegradabilidad in vitro y viabilidad celular entre diferentes andamios nanofibrosos compuestos PANI/PLA. Resultados se consideraron significativos cuando p < 0,05 (*) y muy significativos cuando p < 0,005 (**).

Resultados y Discusión

Las propiedades mecánicas de andamios de ingeniería tisular son indicadores importantes en evaluación de si andamios pueden resistir dinámica de fluidos. La presencia de ácidos inorgánicos puede afectar propiedades físico-químicas de matriz PLA de nanofibras compuestas PANI/PLA en proceso de polimerización oxidativa química in situ de PANI. Por tanto, explorar propiedades mecánicas de nanofibras compuestas PANI/PLA dopadas con ácidos inorgánicos es necesario. Aquí, propiedades mecánicas se evaluaron mediante prueba de tracción, mostrada en Fig. 2, incluyendo tensión-deformación, módulo de Young, resistencia a tracción y elongación a rotura. Como en Fig. 2a, nanofibras PLA exhibieron comportamiento elástico lineal, y nanofibras compuestas PANI/PLA-HA y PANI/PLA-SA mostraron comportamiento de cedencia claro, mientras nanofibras compuestas PANI/PLA-PA se rompieron inmediatamente tras deformación elástica. El módulo de Young (Fig. 2b) de nanofibras compuestas PANI/PLA fue mayor que nanofibras PLA. Comparado con PLA, el aumento en módulo elástico de PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA y PANI/PLA-PA fue 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 y 28,43 ± 8,34 MPa, respectivamente. En resistencia a tracción (Fig. 2c) y relación de fractura (Fig. 2d), las de PANI/PLA-HA y PANI/PLA-PA disminuyeron, mientras PANI/PLA-SA aumentó ligeramente; resistencia a tracción y elongación a rotura de PANI/PLA-PA fueron las más bajas. Comparado con nanofibras PLA, resistencia a tracción de PANI/PLA-HA y PANI/PLA-PA disminuyó 0,15 ± 0,01 y 0,64 ± 0,03 MPa, respectivamente, mientras PANI/PLA-SA aumentó ligeramente 0,13 ± 0,05 MPa. La elongación a rotura de PANI/PLA-HA y PANI/PLA-PA disminuyó 16,93 ± 1,38 % y 35,42 ± 3,94 %, respectivamente, mientras PANI/PLA-SA aumentó 3,32 ± 0,13 %.

Propiedades mecánicas de nanofibras PLA y compuestas PANI/PLA. a Curvas representativas tensión-deformación, b Módulo de Young, c Resistencia a tracción a rotura, d Elongación a rotura

Como en Fig. 2, los ácidos inorgánicos seleccionados pueden aumentar el módulo elástico de nanofibras PLA mediante conexión del recubrimiento PANI. En resistencia a tracción y elongación a rotura, comparado con nanofibras PLA, propiedades mecánicas de PANI/PLA-HA y PANI/PLA-SA variaron en diferente grado, mientras PANI/PLA-PA disminuyó más claramente, fracturándose en <5 s al aplicar tensión. Estos resultados pueden deberse a oxidación de HClO₄, resultando en cleavage de enlace éster en cadena molecular PLA y descomposición oxidativa de grupo carboxilo, llevando a propiedades mecánicas inferiores [31]. Mientras tanto, diferentes propiedades mecánicas de PANI/PLA-HA y PANI/PLA-SA pueden relacionarse con diferente densidad de PANI dopado por HCl y H₂SO₄, mientras la introducción de APS en proceso de reacción también puede haber tenido ligero impacto en nanofibras PLA, con efecto integral de estos factores exhibiendo diferentes propiedades mecánicas [32].

La adhesión, proliferación y diferenciación celular se ven afectadas por morfología, creyéndose generalmente que superficie rugosa favorece adhesión celular [33]. La hidrofobicidad de nanofibras PLA implica que polimerización uniforme de PANI presenta barrera, mientras tratamiento de superficie de nanofibras PLA con plasma puede mejorar significativamente mojabilidad [34]. Tras polimerización in situ basada en PANI con diferentes dopantes ácidos inorgánicos, se obtuvieron nanofibras compuestas PANI/PLA con deposición superficial uniforme.

La morfología de PANI en superficie de diferentes fibras PANI/PLA se observó vía FE-SEM (Fig. 3). La figura muestra claramente que la superficie de nanofibras PLA fue cubierta por muchas nanopartículas irregulares y que nanofibras compuestas PANI/PLA dopadas con ácidos inorgánicos mantuvieron buena morfología de fibra y estructura porosa nanofibrilar. Las observaciones de morfología revelaron que nanofibras compuestas PANI/PLA se cargaron exitosamente con PANI, proveyendo base para adhesión y proliferación celular. Mientras tanto, AFM se usó para medir rugosidad superficial de nanofibras compuestas PANI/PLA, como en Fig. 4. Ra, valor medio de rugosidad superficial en tres posiciones diferentes de cada muestra, se usa generalmente para evaluar rugosidad superficial. Además, Ra de nanofibras compuestas PANI/PLA fue mayor que nanofibras PLA, y Ra de PANI/PLA-PA fue el más alto. Este aumento de rugosidad aceleró área superficial y polaridad, proveyendo potencialmente más sitios de crecimiento para células y promoviendo adhesión celular.

Morfología de a nanofibras PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA y d nanofibras compuestas PANI/PLA-PA

Imagen AFM y rugosidad superficial (Ra) de a nanofibras PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA y d nanofibras compuestas PANI/PLA-PA

La adhesión, migración y proliferación celular se ven afectadas significativamente por mojabilidad de andamios [35, 36]. Generalmente, mojabilidad se evalúa en términos de ángulo de contacto entre andamio y agua. Dado que PLA es hidrofóbico, medimos ángulo de contacto de gotas de agua en membrana nanofibrilar dentro de 1 s, como en Fig. 5, y se encontró que ángulos de contacto de nanofibras PANI/PLA tras tratamiento disminuyeron significativamente. Los ángulos de contacto correspondientes de PLA, PANI/PLA-HA, PANI/PLA-SA y PANI/PLA-PA fueron 112°, 61,6°, 36,7° y 37,2°, respectivamente. La morfología PANI de PANI/PLA aumentó energía superficial del sistema, con área de contacto aumentando al contacto inicial con agua, resultando en disminución de ángulo de contacto y mejora de mojabilidad. El ángulo de contacto de nanofibras compuestas cambió a 0° tras 5 s de contacto con agua, demostrando buena hidrofilicidad. Este andamio hidrofílico también proveyó condiciones favorables para adhesión y difusión celular [37] ya que grupos funcionales oxigenados (ej. -OH y -COOH) en superficie PLA se unieron más a superficie nanofibrilar tras tratamiento de plasma, y morfología PANI y grupos oxigenados trabajaron juntos para asegurar que nanofibras compuestas PANI/PLA fueran completamente mojadas [38, 39].

Ángulo de contacto de a nanofibras PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA y d nanofibras compuestas PANI/PLA-PA

Los espectros FTIR de PANI puro y nanofibras compuestas PANI/PLA dopadas por diferentes ácidos inorgánicos se muestran en Fig. 6. En espectro PANI puro dopado (Fig. 6a), picos característicos fuertes a 1.565, 1.485, 1.298 y 1.125 cm⁻¹ corresponden a estiramiento C=C de anillos quinonoides y estiramiento C=C, C-N y =C-H de anillos benzenoides, respectivamente. En espectro PANI puro dopado (Fig. 6b), además del pico característico PANI, también se ve pico PLA (picos vibración estiramiento C-O 1092 y 1184 cm⁻¹, pico vibración estiramiento C=O 1757 cm⁻¹). Estos resultados indican que PANI se cargó exitosamente en superficie de nanofibras PANI/PLA dopadas con ácidos inorgánicos. Para investigarurther composición química de nanofibras PANI/PLA, se usó XPS para analizar su composición superficial. En espectros XPS (Fig. 7a), picos N1s claros visibles ~ 400 eV en nanofibras compuestas PANI/PLA. Además, picos Cl2p visibles ~ 200 eV en PANI/PLA-HA y PANI/PLA-PA, mientras intensidad de pico Cl2p con PANI/PLA-PA fue mayor que con PANI/PLA-HA. Pico S2p apareció ~ 210 eV en espectros XPS en PANI/PLA-SA. Espectros XPS indicaron que Cl⁻, SO₄²⁻ y ClO₄⁻ se doparon en nanofibras PANI/PLA correspondientes. Además, átomos de nitrógeno imina de PANI se oxidaron completa o parcialmente para producir serie de estados de oxidación acompañados por variados grados de protonación. Cambios en estado de oxidación y nivel de protonación de PANI se midieron en términos de espectros de nivel nuclear N1s (Fig. 7b-d). Cada espectro N1s puede descomponerse en cuatro componentes principales con energías de enlace ~398,7, 399,6, 400,4 y 401,8 eV, atribuibles a imina quinonoide (–N=), amina benzenoide (–NH–), amina protonada (–N⁺) e imina protonada (=N⁺), respectivamente [40, 41]. Con referencia a estudio de Kumar [42], el pico de ajuste del espectro N1s se consideró afectado por carga en aniones unidos por átomos N protonados, resultando en deslocalización y ligero desplazamiento.

Espectros FTIR de a PANI, b PLA y nanofibras compuestas PANI/PLA

Espectros XPS (a) de andamios nanofibrosos compuestos PANI/PLA preparados y PANI/PLA-HA (b), PANI/PLA-SA (c) y PANI/PLA-PA (d) de señal de nivel nuclear N1s

Como plantilla para reparación y regeneración tisular, andamios bioactivos se degradan y excretan del cuerpo tras inducir reparación celular y tisular [43]. En este trabajo, propiedades de degradación de andamios nanofibrilares se evaluaron usando método de pérdida de masa, como en Fig. 8. La pérdida de masa de todas las muestras aumentó a 7, 14 y 21 días, y tasas de pérdida de masa de nanofibras PLA fueron 4,34 ± 0,41 %, 7,84 ± 1,57 % y 12,65 ± 0,83 %, respectivamente. Mientras tanto, la pérdida de masa de nanofibras compuestas PANI/PLA-PA aumentó gradualmente tras polimerización oxidativa in situ, con tasas 31 ± 2,15 %, 34 ± 1,86 % y 40 ± 2,54 % a 7, 14 y 21 días, respectivamente, significativamente mayores que PANI/PLA-HA y PANI/PLA-SA. En proceso de polimerización oxidativa in situ de PANI, la presencia de oxidante APS pudo haber destruido enlace éster en PLA e inducido reacción de hidrólisis, resultando en microgrietas en nanofibras PLA. Con prolongación de tiempo de inmersión PBS, microgrietas se acumularon gradualmente y matriz PLA comenzó a degradarse gradualmente. El PANI cargado en superficie también se desprendió, resultando en pérdida de calidad de nanofibras. Con aumento de tiempo, la relación de pérdida de masa se volvió más clara. Aquí, la fuerte oxidación de HClO₄ agravó degradación de PLA y aceleró pérdida de masa de nanofibras PANI/PLA-PA, consistente con propiedades mecánicas en Fig. 2.

Propiedades de degradación de nanofibras PLA y PANI/PLA

La biocompatibilidad de andamios bioactivos es base para promover adhesión, crecimiento y proliferación celular [44]. Aquí estudiamos proliferación celular de HOS en nanofibras PLA y compuestas PANI/PLA para ilustrar adhesión y biocompatibilidad adjuntas. Durante tratamiento químico y funcionalización [45], varios factores potenciales de influencia podrían intervenir en preparación de andamios bioactivos. Por tanto, investigar su biocompatibilidad es clave para evaluar aplicación práctica.

Para investigar biocompatibilidad de nanofibras compuestas PANI/PLA, su viabilidad celular se evaluó usando método MTT. Figura 9 muestra actividad celular incubada en nanofibras PLA y compuestas PANI/PLA tras 1, 3 y 5 días. La figura muestra claramente que con prolongación de tiempo de incubación, actividad celular de nanofibras aumentó gradualmente; células PANI/PLA-PA exhibieron mejor actividad, y actividad tras cultivo cinco días fue la más alta.

Viabilidad celular HOS cultivadas 1, 3 y 5 días en nanofibras PLA y compuestas PANI/PLA (*p < 0,05; **p < 0,005)

PLA es biodegradable pero hidrofóbico, no favoreciendo adhesión, crecimiento y proliferación celular. Tras tratamiento de plasma, superficie de nanofibras compuestas PANI/PLA se cargó con grupos oxigenados, y superficie funcional demostró buena hidrofilicidad. Los resultados de morfología y AFM indican que PANI dopado con diferentes ácidos inorgánicos exhibió diferentes morfologías y niveles de rugosidad en superficie de nanofibras PLA. Mientras tanto, nanofibras compuestas PANI/PLA exhibieron excelente mojabilidad. Por tanto, consideramos que diferentes morfologías de PANI dopado con ácidos inorgánicos llevaron a aumento de energía superficial y polaridad de nanofibras compuestas PANI/PLA, lo que consecuentemente afectó crecimiento, migración y proliferación celular, resultando en mejor rendimiento de actividad celular [46].

Para estudiarurther comportamiento celular de nanofibras compuestas PANI/PLA, el crecimiento y adhesión en nanofibras se observaron vía inmunofluorescencia (Fig. 10) y SEM (Fig. 11). Comparamos actina y morfología celular en superficie de diferentes nanofibras. Cuando células crecieron en fibras PLA y nanofibras PANI/PLA, los haces de actina demostraron buen estado de estiramiento. Mientras tanto, densidad celular de nanofibras compuestas PANI/PLA fue mayor que nanofibras PLA de grupo control, con orden de densidad de crecimiento: PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA. Las células HOS crecieron en nanofibras PANI/PLA y adhirieron en forma multipolar plana. Claramente, muchas células se incrustaron en poros de fibras PANI/PLA pero se estiraron pobremente en nanofibras PLA y no pudieron expandirse completamente. Estos resultados indican que nanofibras compuestas PANI/PLA podrían promover adhesión y proliferación de células HOS.

Imágenes micrográficas de fluorescencia en a nanofibras PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA y d nanofibras compuestas PANI/PLA-PA tras incubación 24 h

Micrografías SEM de HOS sembradas en a nanofibras PLA, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA y d nanofibras compuestas PANI/PLA-PA tras 24 h

Mientras tanto, resultados de tinción inmunofluorescente y adhesión celular indicaron que diferentes morfologías de PANI en superficie de nanofibras compuestas PANI/PLA afectaron crecimiento, adhesión y proliferación de células HOS, consistente con resultados anteriores.

Como marcador osteogénico temprano, prueba ALP se realizó en andamios de nanofibras PLA y compuestas PANI/PLA por 7 días. Comparado con nanofibras PLA puras, el resultado (Fig. 12) mostró que actividad ALP mejoró significativamente en nanofibras compuestas PANI/PLA. Obviamente, actividad ALP de nanofibras compuestas PANI/PLA-PA es la mejor. Estos resultados probaron que nanofibras compuestas PANI/PLA exhibieron mejor biocompatibilidad, consistente con resultados anteriores de adhesión, crecimiento y proliferación celular.

Actividad fosfatasa alcalina en andamios de nanofibras compuestas PANI/PLA (ns = sin significancia)

Conclusiones

En este trabajo, nanofibras compuestas PANI/PLA de diferentes morfologías de superficie se prepararon usando tres tipos de ácido inorgánico como dopante en polimerización in situ. Confirmamos que PANI pudo cargarse exitosamente en superficie de PLA sin cambiar estructura porosa de nanofibras. Los experimentos de propiedades mecánicas y degradación in vitro demostraron que ácidos oxidantes pueden debilitar significativamente propiedades mecánicas y acelerar degradación de nanofibras de poliéster. Mientras tanto, superficie más rugosa resultó en mejor mojabilidad y promovió adhesión, crecimiento y proliferación celular, indicando mejor biocompatibilidad. En conclusión, la morfología PANI regulada vía dopaje con diferentes ácidos tiene efecto positivo en biocompatibilidad en ingeniería de tejidos.

Disponibilidad de datos y materiales

Los autores declaran que materiales y datos están disponibles a lectores sin calificaciones indebidas para acuerdos de transferencia de material. Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo.

Abreviaturas

PANI:

Polianilina

PLA:

Ácido poliláctico

MEC:

Matriz extracelular

PPy:

Polipirrol

PTH:

Politiofeno

AN:

Anilina

DCM:

Diclorometano

DMF:

N,N-Dimetilformamida

APS:

Persulfato de amonio

HOS:

Células de osteosarcoma humano

DMEM:

Medio modificado de Eagle de Dulbecco

PBS:

Solución salina fosfato

MTT:

3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazolio bromuro

FITC:

Fluoresceína isotiocianato

FTIR:

Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier

FE-SEM:

Microscopía electrónica de barrido de emisión de campo

XPS:

Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X

ALP:

Fosfatasa alcalina