Detección avanzada de miRNA-335-5p usando electrodos interdigitales para evaluar gravedad de aneurisma aórtico abdominal

Resumen

El aneurisma aórtico abdominal (AAA) se refiere a la dilatación de la arteria inferior de la aorta abdominal, y se necesita urgentemente una herramienta de detección temprana para diagnóstico. En el estudio actual, una superficie de electrodo interdigital (IDE) se usó para identificar miRNA-335-5p, que refleja la formación de AAA. La uniformidad del material de sílice se observó por profilometría 3D, y la superficie químicamente modificada altamente conductiva mejoró la detección vía modo I-V. El miRNA-335-5p objetivo se detectó de manera dependiente de la dosis y, basándose en regresión lineal y análisis 3σ, la sensibilidad se determinó en 1 fM con sonda biotinilada. La alta especificidad se mostró discriminando la secuencia objetivo de secuencias no complementarias y con mismatches simples y triples. Estos resultados demostraron detección de alto rendimiento de miRNA-335-5p con buena reproducibilidad para determinar gravedad de AAA.

Introducción

Los aneurismas aórticos abdominales (AAA) son enfermedades potencialmente mortales definidas como aorta abdominal con diámetro > 3 cm o mayor que lo normal. Esta condición ocurre con aterosclerosis o acumulación de placa, debilitando paredes de la aorta abdominal y resultando en abultamiento hacia afuera, similar a un globo. Con el tiempo, la pared arterial se ensancha, situación comparable al envejecimiento de mangueras de jardín. La presión de la sangre bombeada a través de la aorta causa que esta área debilitada se abulte, lo que se llama aneurisma. AAA se forma cuando la porción debilitada de la aorta lleva a complicaciones. AAA puede llevar a muerte por rotura en aneurismas pequeños. Actualmente, exámenes físicos, tomografías axiales computarizadas, resonancias magnéticas y ecografías se usan para diagnosticar esta condición. Sin embargo, no hay métodos de detección para AAA, que comúnmente se identifica al analizar otros problemas de salud. Esto resulta en identificación tardía de AAA, causando problemas de salud innecesarios. Para superar esto, investigadores necesitan desarrollar métodos de detección temprana, y una estrategia potencial es el desarrollo de un sistema de sensado.

La detección temprana, rápida y sensible de enfermedades de manera cuantitativa es meta vital para diagnósticos clínicos. Las plataformas de biosensores actuales han satisfecho varias demandas y requieren configuraciones de laboratorio y entrenamiento adecuados. Así, la mayoría de métodos no son portables, lo requerido para detección point-of-care ideal. Además, para asistir a médicos en toma de decisiones de manera precisa y rápida, un análisis de cambios en niveles de biomarcadores es altamente deseable. Biomarcadores circulantes expresados en áreas específicas deben investigarse más para diagnosticar AAA y seguir progreso del tratamiento. La identificación de estos biomarcadores circulantes ayudará a diagnosticar la enfermedad y realizar seguimiento de pacientes tras tratamiento. Para satisfacer estas necesidades, este estudio propone generar sensores de biomarcadores apropiados para AAA. El sensor (electrodo interdigital) propuesto tiene potencial para análisis de alto rendimiento con amplia gama de biomarcadores. Es un sistema dieléctrodo con gaps y dedos alternados que operan bajo mediciones dieléctricas.

Los biomarcadores pueden ser cualquier biomolécula: DNA, RNA, proteínas, carbohidratos, lípidos y sus formas modificadas. Además, investigadores han propuesto que diferentes biomarcadores, como RNAs no codificantes, se expresan en el sistema celular pero no se traducen en proteínas. Los RNAs no codificantes generalmente no se traducen y tienen secuencias cortas. Diferentes clases: microRNAs (miRNAs), RNAs ribosomales, RNAs de transferencia, pequeños RNAs nucleolares, pequeños RNAs nucleares, RNAs telomerasa, snRNAs, Xist RNAs, vault RNAs, 7SL RNAs. Los miRNAs funcionan principalmente en regulación transcripcional y post-transcripcional de expresión génica, resultando a menudo en silenciamiento génico. Recientemente, investigadores describieron importancia de miRNAs para predicción de AAA y reportaron reducción en expresión de miRNA-335-5p en pacientes con AAA. Se ha probado que combinación de factores clínicos y expresión de microRNAs mejora drásticamente predicción de enfermedades con mayor precisión. Investigadores se enfocaron en miRNA-335-5p, que mostró rango significativamente mínimo en individuos con AAA de rápido crecimiento. Una disminución en niveles de miRNA-335-5p aumentó confianza en detección de AAA creciente. En otras palabras, salida negativa (niveles altos) de miR-335-5p indica gravedad de AAA y minimiza cribado laborioso. Este hallazgo fue demostrado por Wanhainen et al. y reveló que miRNAs son biomarcadores útiles para cribado de AAA y eliminación de riesgo de AAA de rápido crecimiento. El estudio actual demuestra aplicación de detección de miRNA-335-5p por sensor de electrodo interdigital (IDE) para determinar gravedad de AAA en individuos afectados.

Materiales y métodos

Reactivos y biomoléculas

Estreptavidina, 1,1'-carbonyldiimidazol (CDI), y solución tampón fosfato (PBS) de Sigma-Aldrich, EE. UU. Etanolamina de Fisher Scientific, UK. Todos los oligos se sintetizaron comercialmente de Apical Scientific Sdn. Bhd., Malasia.

Diseño de patrón en máscara de cromo

Inicialmente, el patrón del sensor dieléctrico se diseñó usando software AutoCAD. Dimensiones deseadas: longitud 7500 μm, ancho 4100 μm, 20 pares dedo-gap, tamaño gap 85 μm, tamaño electrodo 100 μm, espesor electrodo 40 nm, longitud dedo 4000 μm. El patrón se imprimió en fotomáscara en blanco y pegó en superficie de vidrio de cromo. Este vidrio se fijó bajo sistema de exposición UV para transferencia de patrón. Un sustrato de dióxido de silicio depositado con capa fina de aluminio se colocó en dirección opuesta contra vidrio de cromo y expuesto a luz UV 10 s. El patrón se transfirió seguido por proceso de revelado usando revelador de resist.

Fabricación del electrodo interdigital

El electrodo de superficie se produjo vía proceso convencional de microelectrónica: (i) Wafer 4 pulgadas con óxido nativo existente. (ii) Limpieza con BOE y solución piraña para eliminar óxido nativo y contaminantes inorgánicos. (iii) Capa óxido 2800 Å crecida via oxidación térmica húmeda 1 h a 1000 °C. (iv) Wafer con capa óxido dividido en cuatro para mejor manejo. (v) Capa metálica depositada con l como capa de adhesión para capa conductora. Capa aluminio (40 nm) producida a 3 cm largo con diámetro 0,5 mm via deposición física por evaporación térmica. (vi) Capa de fotoresist positivo spin-coat en sustrato. (vii) Soft-bake 90 °C 60 s. (viii) Alineación con máscara de cromo y exposición UV 10 s. (ix) Enjuague en solución revelador RD6 15 s para eliminar área no expuesta, resultando patrón IDE con óxido. (x) Hard-bake 90 °C 120 s. (xi) Grabado con agua regia para eliminar área expuesta de ambas capas. (xii) Patrón de superficie producido, fotoresist restante lavado con acetona. Luego, análisis profilometría 3D (Hawk 3D-profilometría, EE. UU.) para observar imagen clara de gaps entre electrodos. Medidas de corriente (A) realizadas con Keithley 6487 con barrido lineal 0-2 V paso 0,1 V (a 20 s).

Funcionalización química de superficie: Estrategia tetravalente estreptavidina-biotina

Para funcionalización química, superficie de sílice se lavó a fondo con 1 M hidróxido de potasio (pH 9,0) para activar superficie. Esta se modificó con CDI (0,5 M) incubación 1 h para reaccionar con 100 nM estreptavidina (1 h), diluida de stock original en 10 mM PBS (pH 7,4). Tras esto, espacios no reaccionados se bloquearon con 1 M etanolamina (1 h). Luego, estreptavidina tetravalente reaccionó con 1 μM sonda biotinilada miRNA-335-5p (10 min) a temperatura ambiente. Tras cada modificación, superficie se lavó a fondo con PBS salvo indicación contraria.

Diseño de secuencias sonda y objetivo desde miRNA-335-5p

El miRNA-335-5p completo (5'-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3') con código acceso MIMAT0000765, se obtuvo de banco de datos. Región deseada como objetivo: 5'-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3'. Para capturar región objetivo, sonda diseñada: 5'-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3'. En extremo 3', biotina etiquetada para interactuar con estreptavidina inmovilizada en superficie sensora. Estructura secundaria del miRNA-335-5p completo predicha por software mfold online.

Interacciones sonda-objetivo: secuencias miRNA-335-5p

Tras unión de sonda biotinilada a superficie estreptavidina, objetivo miRNA-335-5p interactuó (10 min) a temperatura ambiente desde bajo femtomolar a bajo nanomolar. Concentraciones variaron 1 fM a 1 nM con diluciones seriadas 10x en PBS. Los ensayos se probaron independientemente de menor a mayor concentración, y tras formación dúplex, superficie se lavó con 5 volúmenes PBS, tomándose medidas.

Medidas I-V

Caracterizaciones eléctricas se realizaron por medidas I-V usando picoamperímetro Keithley 6487 con fuente voltaje/corriente. Medidas registradas en voltajes mencionados en superficie desnuda seguida por cada modificación química de superficie. Similarmente, para análisis interactivo entre sonda y objetivo miRNA-335-5p a cada concentración, medida realizada tras paso de lavado con 10 volúmenes de reacción. Todas las modificaciones, interacciones y medidas se mantuvieron en condiciones húmedas salvo indicación contraria.

Resultados y discusión

Fabricación del sensor IDE y análisis de superficie

El estudio actual usó miRNA-335-5p como herramienta para elucidar gravedad de AAA por análisis interactivo en sensor de electrodo interdigital (IDE) (Fig. 1). Para análisis interactivo con sonda y objetivo diseñados de longitud completa miRNA-335-5p, superficie IDE se diseñó y fabricó usando técnicas fotolitográficas convencionales. Modificaciones superficiales paso a paso se realizaron y midieron por amperímetro (Fig. 2b, c). Alineación de máscara para fabricación IDE y uniformidad confirmadas por análisis profilometría 3D nano de alta resolución. Esta observación confirmó que fabricación y distancia entre cada dedo estaban bien alineados (Fig. 2d). IDEs tienen tamaño electrodo ~100 μm con espaciado ~85 μm, y gran red intercalada con millones de biomarcadores en serie/paralelo se forma. Para asegurar éxito de IDEs fabricados, se usaron diferentes dispositivos desnudos para determinar reproducibilidad bajo sistema dieléctrico. Este sistema mide vibraciones moleculares entre dieléctrodos causadas por momento dipolar (Fig. 2c). Este IDE dieléctrico es sistema bien aceptado ampliamente usado para análisis biomoleculares y químicos. En este estudio, todas las modificaciones químicas de superficie y análisis interactivos se midieron por modo corriente I-V.

Ensamblaje molecular de alta densidad en superficie: Estrategia estreptavidina-biotina

Adjuntos moleculares de alta densidad en superficie sensora o biochips son cruciales y dependen altamente de funcionalización de superficie. Este estudio determinó superficie apropiada para alto número de acomodos moleculares, obligatorio para expresión génica, descubrimiento y análisis molecular. Para estas aplicaciones potenciales, la generación de superficies de sistemas analíticos requiere acoplamiento adecuado de moléculas para inmovilizarlas en formatos apropiados. Estas superficies de materiales se estudiaron para investigar mecanismo interactivo de superficie, ya que son baratas y proporcionan variados grados de densidades de empaquetamiento, morfología y espesor. Este hallazgo facilitará adjunto adecuado de moléculas y prevendrá pérdida de actividad biomolecular. Además, la orientación correcta de inmovilización biomolecular se retiene con confirmación estructural secundaria adecuada.

Para lograr moléculas de alta densidad en superficie, se lavó a fondo superficie de sílice con solución alcalina y modificó con CDI. Para capturar altos niveles de sondas biotiniladas en superficie CDI, se inmovilizó sonda con estreptavidina. La estreptavidina es proteína tetravalente con cuatro sitios para unir biotina, considerada molécula de alta afinidad en ciencias biológicas. Superficie IDE tuvo nivel corriente 2,08E-10 A, y tras adjunto CDI aumentó a 9,2E-06 A. Esto indica claramente que superficie IDE modificada con CDI es apropiada para nuestros análisis. Al añadir estreptavidina, nivel corriente aumentó a 2,36E-05 A. Usando esta estrategia, inmovilizamos mayor número de sondas biotiniladas diseñadas de miRNA-335-5p completo en superficie IDE (Fig. 3a). Interacciones biotina realizadas tras paso de bloqueo en superficie IDE para enmascarar áreas no reaccionadas. Con cada modificación de superficie, se determinaron cambios en corriente (Fig. 3b). Como muestra Fig. 3c, tras adición de etanolamina, cambios de corriente fueron 2,53E-05 A, y al añadir 1 nM secuencia biotinilada de captura, nivel corriente disminuyó a 1,29E-08 A. Este cambio confirmó inmovilización de sonda de captura en superficie sensora IDE. Generalmente, un oligonucleótido monocatenario lleva carga más negativa con esqueleto fosfato 5-carbonatado expuesto (sonda), mientras carga neta de etanolamina es neutra, según proveedor. Esta gran diferencia de carga resultó en variación aparente en corriente medida (Fig. 3c). Además, este parámetro revirtió nuevamente tras formación dúplex con hebra objetivo. Esto se debe a reducción en exposición de esqueleto fosfato y cargas positivas adicionales originadas de nucleobases en hebra miRNA (Fig. 4a).

Análisis interactivo dependiente de dosis en IDE

Tras adjunto de sonda biotinilada en superficie sensora, análisis interactivo objetivo se realizó con diferentes dosis. Validación realizada desde bajo femtomolar a bajo nanomolar. Para asegurar rango, análisis preliminar con 1 nM secuencias objetivo miRNA-335-5p. Tras adición 1 nM objetivo en superficie modificada con sonda de captura, nivel corriente cambió de 1,29E-08 A a 1,29E-07 A (Fig. 4a); indicó hibridación entre sonda captura y secuencia objetivo. Tras confirmación, para determinar límite de detección, se tituló secuencia objetivo 1 fM a 1 nM, depositada independientemente en superficies modificadas con sonda captura. Cambios de corriente detectados antes y después de inmovilización. Diferencias de corriente para hibridaciones 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM fueron 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21, 11,61E-08 A respectivamente. Basado en resultados, claros cambios de corriente dependientes de dosis detectados en todas las concentraciones probadas (Fig. 4b).

Alto rendimiento analítico: Sensibilidad, especificidad y reproducibilidad

Basado en resultados con incrementos dependientes de concentración, se realizó análisis regresión lineal. Sensibilidad de detección estimada usando cálculo 3σ, resultando 1 fM (Fig. 5a, b). Concentración menor a 1 fM mostró señal de fondo y valores menores. Además, análisis especificidad realizado para discriminar secuencias objetivo de no complementarias y con mismatches simples y triples. Fue aparente que sonda diseñada mostró reacción más fuerte con secuencias complementarias perfectas miRNA-335-5p que otras secuencias (Fig. 6a). Secuencia con mismatch simple resultó en mayor respuesta de corriente que no complementaria y triple mismatch debido a formación dúplex parcial por mismatch simple en secuencia sonda. Análisis reproducibilidad realizados con todas las modificaciones químicas y biológicas en superficie IDE en triplicado, promediando datos. Datos promediados indican no hubo cambios significativos al realizar diferentes experimentos (Fig. 6b). Además, para apoyar rendimiento IDE, se compararon características de métodos disponibles actualmente (Tabla 1).

Conclusiones

Desarrollo de método analítico usando biomarcadores biológicos ayuda a diagnosticar AAA durante exámenes físicos. En la investigación actual, detección mediada por miRNA-335-5p para predecir gravedad de AAA se desarrolló, ya que miRNA-335-5p se expresa con AAA. La salida de detección IDE generada mostró niveles de detección bajos a altos para facilitar predicción de gravedad AAA. Nivel inferior detección 1 fM con alta especificidad y reproducibilidad para análisis alto rendimiento. Método tetravalente estreptavidina-biotina usado en esta investigación dio buen resultado y puede utilizarse para otros análisis de biomarcadores.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos están disponibles sin restricción.

Abreviaturas

AAA:

Aneurisma aórtico abdominal

CDI:

1,1'-Carbonyldiimidazol

PBS:

Solución tampón fosfato

IDE:

Electrodo interdigital

UV:

Ultravioleta