Nanopartículas de fósforo negro promueven la diferenciación osteogénica de EMSC a través de la expresión TG2 regulada hacia arriba

Materiales y métodos

Nanopartículas de fósforo negro

Bulk BP fue comprado por Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd. Dimetilsulfóxido (DMSO), hidróxido de sodio (NaOH) y N -metil-2pirrolidona (NMP) fue proporcionada por Aladdin Industrial Co., Ltd. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) se obtuvo de Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. Mezcla de medio / nutrientes de Eagle modificado por Dulbecco F12 (DMEM / F12; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences), estreptomicina, penicilina, suero fetal bovino (FBS), se obtuvieron de BI Science and Technology Co., Ltd.

La síntesis de BP fue similar a la de informes anteriores con modificaciones menores [24]. Primero, se sumergieron 20 mg de BP a granel en una solución saturada de NaOH / NMP y se refinó con un método mecánico de trituración. Después, la mezcla se centrifugó durante 10 min a 1500 rpm, después de lo cual se desechó el precipitado. Posteriormente, la mezcla se sonicó durante 6 h en un baño de hielo / agua, y luego la mezcla se filtró a través de un filtro BD Falcon de 100 μm (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Finalmente, se realizó una centrifugación adicional de la suspensión (10 min a 13.000 rpm, 4 ° C) y se recogió el precipitado.

Tinción por inmunofluorescencia de los EMSC en la mucosa nasal

Para mostrar las EMSC in vivo, se disecó la mucosa respiratoria del tabique nasal y luego se fijó en PFA al 4% durante la noche para la tinción por inmunofluorescencia. Los tejidos se lavaron con PBS y luego se deshidrataron con soluciones de sacarosa en gradiente. Los tejidos se incrustaron en OCT (Sakura Finetek, Japón) para la criosección y se cortaron en secciones en serie coronales con un grosor de 25 mm utilizando un crio-microtomo Leica. Estas secciones se lavaron en PBS durante 10 min y se permeabilizaron con albúmina de suero bovino al 1% y Triton-X 100 al 0,1% en PBS. Las EMSC en la mucosa nasal se tiñeron por inmunofluorescencia con el anticuerpo primario anti-nestina y el anticuerpo secundario conjugado con Cy3. Los controles negativos paralelos se sometieron a los mismos procedimientos sin anticuerpos primarios. Los tejidos teñidos se observaron bajo un microscopio de inmunofluorescencia (AxioObserver, ZEISS, Alemania).

Cultivo celular

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética y Cuidado Animal de la Universidad de Jiangnan, y en este estudio se siguieron estrictamente las Directrices internacionales para la investigación animal. Las células madre ecto-mesenquimales primarias se aislaron de la mucosa respiratoria de rata de acuerdo con nuestros estudios anteriores [17, 25]. Brevemente, se anestesiaron 100 g de ratas Sprague Dawley (SD) adultas con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico (0,05 g / kg). El tercio medio del tabique nasal se trituró y luego se incubó en una solución de tripsina al 0,25% (Hyclone; GE Healthcare Life Sciences) a 37 ° C durante 25 minutos, después de lo cual se quitó cuidadosamente la mucosa del tabique nasal. Finalmente, el tejido de la mucosa del tabique nasal se cortó en pedazos. La suspensión resultante de los tejidos se pasó a través de un tamiz de malla de nailon de 100 µm, se centrifugó a 1000 g durante 5 min y luego se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La suspensión de tejido se colocó en un matraz de cultivo celular en medio de crecimiento (DMEM / 12 contiene 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina) y se cultivó a 37 ° C en 5% de CO ₂ y 95% de aire con humedad saturada. El medio se reemplazó cada tres días y las células se pasaron cada semana. Se utilizaron células en su tercer pase para todos los estudios de caracterización. Se llevó a cabo inmunofluorescencia para caracterizar las células cultivadas con anticuerpos contra marcadores de células madre, como vimentina y nestina [26].

Identificación de la capacidad de diferenciación multidireccional de los EMSC

Las EMSC se sembraron en las placas de 6 pocillos y se cultivaron con medio DEME / F12 durante 24 h hasta una confluencia del 70%. A continuación, se cambió el medio con medio de diferenciación osteogénica (DMEM suplementado con FBS al 10%, dexametasona 0,1 mM, β-glicerofosfato disódico 10 mM y ácido l-ascórbico 0,2 mM) para inducir la osteogénesis. El medio se cambió cada siete días y la tinción con Alizarin Red S se realizó con Alizarin Red S al 0,5% (Sigma-Aldrich) el día 28. Se cultivaron EMSC que crecieron en un 90% de confluencia en medio de diferenciación adipogénica para inducir la adipogénesis durante 21 días. La tinción con rojo aceite se realizó con el kit de tinción con rojo aceite (Solarbio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Caracterización de los BP

Se utilizó microscopía electrónica de barrido (SEM) para caracterizar la morfología y el tamaño de la PA. Las muestras se prepararon colocando una gota de la solución de BP a una concentración de 1 mg / ml en agua desionizada sobre una rejilla de cobre recubierta de formvar y luego secando al aire. Las muestras se fotografiaron mediante microscopía electrónica de barrido (H-7500; Hitachi, Tokio, Japón). El tamaño medio de los BP se analizó utilizando el software image Pro Plus (Media Cybernetics Inc., MD, EE. UU.). La evaluación del potencial zeta fue confirmada por Malvern zeta sizer (ZEN3600). La difracción de rayos X (XRD) se realizó con un difractómetro Bruker D8 Discover en una geometría paraenfocada de Bragg-Brentano y radiación Cu Kα. Se recolectaron patrones de difracción entre 10 ° y 80 ° de 2 θ con un paso de 0.01 ° 2 θ y tiempo de adquisición de 0,2 s por paso. Los datos resultantes se evaluaron utilizando el software HighScore Plus 3.0e. Se utilizó un espectrómetro Raman (LabRam HR800) con excitación láser de 514 nm para medir los espectros Raman de la muestra. La composición de la superficie de la muestra se midió mediante espectroscopia de fotoelectrones de rayos X ([XPS] Omicron NanoTechnology GmbH, Alemania).

Ensayo del kit de recuento celular-8 (CCK-8)

El efecto de los BP sobre la proliferación celular se evaluó utilizando el ensayo del kit de recuento celular (CCK-8). Brevemente, EMSC (3000 células / pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con BP (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 y 512 μg / ml) durante 24 horas a 37ºC. ° C. Para la detección de CCK8, se añadieron 10 µl de reactivo CCK8 al medio de cultivo 4 h antes del análisis. La densidad óptica (DO) a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (Thermo Fisher Scientific, Madrid, España) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de BP utilizada para una investigación adicional se seleccionó en función de los resultados del ensayo CCK-8. En cuanto a la tinción Ki-67, EMSC (1 × 10 ⁴ ) se cultivaron en placas de 24 pocillos y se tiñeron mediante inmunofluorescencia para Ki-67 (policlonal de conejo; nº de cat. ab15580; abcam; 1:300). Se utilizó DAPI para teñir los núcleos. Las imágenes se capturaron mediante microscopía de fluorescencia (aumento, 200 ×; eclipse Ti; nikon corporation) y se analizaron con el software Image Pro Plus.

Diferenciación osteogénica

Para la diferenciación osteogénica, se sembraron EMSC a una densidad de 3.000 células / cm ² y se cultivó en medio de crecimiento hasta una confluencia del 70%. A continuación, se indujeron las células con medio de diferenciación de osteogénesis durante 2 semanas. En particular, para evitar la influencia del β-glicerofosfato de sodio, el medio de diferenciación de osteogénesis se complementó con FBS al 10%, dexametasona 0,1 mM y ácido l-ascórbico 0,2 mM (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) Pero no con β-glicerofosfato de sodio. Después de inducir la diferenciación, se utilizaron tinción con fosfatasa alcalina (ALP) y rojo de alizarina y RT-qPCR para evaluar los efectos de los BP sobre la diferenciación osteogénica de las EMSC. Las EMSC se sembraron a una densidad de 2 × 10 ⁵ células / pocillo en placas de 6 pocillos y se incubaron con medio osteogénico. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la tinción de ALP se evaluó usando un kit de tinción de ALP (Instituto de Bioingeniería de Nanjing Jiancheng) el día 14. Se aplicó tinción con rojo de alizarina S para visualizar la deposición de fosfato de calcio. Brevemente, las células fijadas se lavaron nuevamente con agua desionizada y se incubaron con 1 ml / pocillo de solución de tinción de rojo de alizarina (0.5% (p / v) Alizarin Red S (Sigma-Aldrich) en PBS durante 10 min a 37 ° C. Después se retiró la solución, se lavó nuevamente la muestra con agua desionizada. Se contó el área de tinción positiva que indica los nódulos calcificados por campo con el software Image-Pro plus y se normalizó al control respectivo.

RT-qPCR

La RT-qPCR se realizó como se describió previamente. Brevemente, el ARN total se aisló de los monocultivos o se clasificó utilizando el kit de purificación de ARN (TaKaRa, Japón), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sometieron a transcripción inversa dos microgramos de ARNm en ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc (Fermentas). Los cebadores utilizados para RT-PCR fueron diseñados y construidos por Nanjing GenScript Bioengineering Technology and Services Co., Ltd (Nanjing, China), que se muestra en la Tabla 1. La RT-PCR se manipuló con un kit de mezcla maestra de qPCR SYBR Green / Fluorescein (Fermentas) con el sistema ABI Prism 7500. Los datos se normalizaron a gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) para indicar niveles de expresión relativos. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.

Western Blot

Las células cultivadas se lavaron dos veces con PBS y luego se lisaron en hielo durante 30 min con tampón de lisis RIPA que contenía un cóctel inhibidor de fosfatasa y proteasa. Para recolectar el TG2 total, los lisados ​​celulares y la ECM en las placas de 6 pocillos se recolectaron mediante un raspador de células. Las placas se lavaron con PBS y también se recogieron los fluidos de lavado de células. Los lisados ​​se recogieron del sobrenadante mediante centrifugación a 12.000 x g durante 5 min, se mezcla con un volumen igual de tampón de carga de SDS y luego se hierve durante 5 min. Las concentraciones de proteína se determinaron usando un kit de ensayo de proteína BCA (Beyotime, Shanghai, China, P0012). Las proteínas se extrajeron en tampón de lisis RIPA, se separaron en geles de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS) y se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa (Millipore, LA, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% en solución salina tamponada con Tris (TBS) 0,01 M que contenía Tween 20 al 0,5% (Suolaibao, Beijing, China) y se transfirieron con los anticuerpos indicados, incluyendo anti-TG2 (1:200; sc-48387, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-FN (1:500; cat. no. BA1772; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.) y anti-LN (1:500; cat. no. BM4921; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), anti-OCN (1:200; sc-390877, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-OPN (1:200; sc-73631, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti- COL I (1:500; cat. Nº BA0325; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), a 4 ° C durante 12 h. A continuación, las membranas se hicieron reaccionar con anti-IgG de conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:5000; Boster, Wuhan, China) durante 2 ha temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un sustrato Pierce ECL Plus (Thermo Fisher Scientific) y luego se escanearon con un sistema de imágenes de quimioluminiscencia (Clinx Science Instruments, Shanghai, China).

Experimentos de inhibición

Para confirmar la participación de TG2, se llevaron a cabo experimentos de inhibición de TG2 en EMSC. Los experimentos de neutralización se realizaron con un anticuerpo neutralizante anti-TG2 (de BD Biosciences, San Diego, CA). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos con medio de cultivo normal durante 24 h para que se adhirieran y se trataron con anticuerpo anti-TG2 (10 μg / ml). Al mismo tiempo, se estableció el grupo de control. Después de sembrar en placas de 6 pocillos durante 24 h, se indujo la osteogénesis EMSC durante 14 días utilizando medio osteogénico con BP (2 μg / ml), y el medio de cultivo que contenía inhibidores se cambió por medio osteogénico fresco cada 7 días. Se aplicó tinción con rojo de alizarina S para visualizar la deposición de fosfato de calcio. Se utilizó transferencia Western para evaluar los niveles de osteocalcina, osteopontina y colágeno tipo 1 (expresión de OCN, OPN y COL I, respectivamente).

Tinción por inmunofluorescencia

Las células cultivadas se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 8 ha 4 ° C. Las células fijadas se lavaron tres veces con PBS y se permeabilizaron durante 30 min en PBS que contenía Triton X-100 al 0,2% y BSA al 1% (Suolaibao, Beijing, China). Después de la permeabilización, estas células fijadas se lavaron con PBS y luego se incubaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante 8 h, seguido de la eliminación de todos los anticuerpos primarios. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 2 ha temperatura ambiente con anticuerpos secundarios Alexa Fluor-594 (1:800, Life Technologies Molecular Probes, Carlsbad, CA, EE. UU.) A 37 ° C durante 2 h. Los núcleos se tiñeron por contraste con 4'6-diamidino-2-fenilindol ([DAPI]; Sigma-Aldrich). Todos los grupos evaluados se observaron bajo un microscopio de inmunofluorescencia.

Análisis estadístico

Los datos se obtuvieron de los tres experimentos separados descritos anteriormente y se presentaron como media ± desviación estándar (DE). El análisis de la distribución de datos se realizó utilizando la t del estudiante -prueba para analizar la importancia de las diferencias entre los grupos tratados y de control. Se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba post-hoc de Tukey para evaluar las diferencias significativas entre los grupos. p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización de los BP

La distribución del tamaño de la PA medida por la dispersión dinámica de la luz (DLS) fue relativamente estrecha en el rango de 100 a 200 nm con un valor máximo a 132 nm. El resultado se muestra en la Fig. 1A. El potencial zeta de las PA se determinó como - 23,7 ± 0,65 mV (Fig. 1B), lo que confirma la estabilidad de las PA. El tamaño de las partículas se investigó más a fondo mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) (Fig. 1C). Los resultados se corresponden bien con la medición de la distribución del tamaño de partículas mediante DLS.

Caracterización de BP. A Distribución de tamaño de nanopartículas de fósforo negro (BP); B informe de potencial zeta de PA con un potencial zeta de - 23,7 ± 0,65 mV; C Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de las nanohojas de BP (BPN). D Espectros Raman de BP; E Difractograma de rayos X y F Espectros de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) de alta resolución P 2p de BP; G Espectros XPS de BP

La dispersión Raman (Fig. 1D) reveló tres picos prominentes a 362,3, 438,5 y 466,9 cm ⁻¹ asociado con el modo de teléfono fuera del plano ( A ¹ _g ) y dos modos en el plano ( B ² _g y A ² _g ) de BP, [17, 18], respectivamente. XRD (Fig. 1E) muestra la pureza de fase del material preparado, con un tamaño cristalino medio de 102,7 nm. La ampliación del patrón de difracción indica el tamaño nanométrico de los cristalitos individuales. Los espectros XPS de alta resolución de P 2 p (Fig. 1F) muestran el pico principal a 130 eV correspondiente al enlace P – P del fósforo negro, además de un pico adicional a 135 eV que se origina a partir de enlaces P – O provocados por la oxidación de la superficie. de los BP. Las superficies de BP se examinaron mediante rayos X de barrido amplio (Fig. 1G).

Caracterización de EMSC

La tinción por inmunofluorescencia de la mucosa nasal mostró que las EMSC positivas para nestina estaban ubicadas en la lámina propia debajo del epitelio respiratorio del tabique nasal (Fig. 2A). Las EMSC cultivadas en el tercer pase aparecieron como células de tipo fibroblástico y proliferaron rápidamente en placas de plástico (Fig. 2B). Evaluamos la diferenciación osteogénica en medio osteogénico mediante tinción con rojo de alizarina el día 28 (Fig. 2C). La diferenciación adipogénica en medio de inducción adipogénica se evaluó el día 21 mediante tinción con solución de aceite rojo-O (Fig. 2D). La tinción de inmunofluorescencia mostró que casi todos los EMSC expresaban marcadores de células de la cresta neural, tales como nestina (> 95%) como se muestra en la Fig. 2E y vimentina (> 95%) como se muestra en la Fig. 2F. Los resultados de la coexpresión de marcadores de células madre indican que estas EMSC son un tipo de célula madre mesenquimatosa.

Identificación de las células madre mesenquimales ectodérmicas (EMSC). A Las EMSC positivas para nestina (cy3, rojo) se ubicaron en la lámina propia debajo del epitelio respiratorio del tabique nasal; B Una imagen de contraste de fase mostró que las EMSC cultivadas en el tercer paso aparecían como células de tipo fibroblástico y proliferaban rápidamente en placas de plástico; C Las EMSC diferenciadas osteogénicas en medio osteogénico se tiñeron con rojo de alizarina; D Las EMSC adipogénicas diferenciadas en medio de inducción adipogénica se tiñeron con aceite rojo-O; E , F La tinción por inmunofluorescencia de los marcadores de células de la cresta neural mostró que casi todas las EMSC expresaban nestina y vimentina. Se usó IgG-Cy3 (rojo) como segundo anticuerpo para la tinción por inmunofluorescencia y los núcleos se tiñeron con contraste con Hoechst 33342 (azul)

Citotoxicidad

Como experimento preliminar, se realizó el ensayo CCK-8 para evaluar la citotoxicidad de los BP. La viabilidad de los EMSC después de 24 h de exposición a los BP se muestra en la Fig. 3. No se observó citotoxicidad significativa después de la exposición a hasta 32 µg / ml de BP. Sin embargo, la exposición a BP causa una citotoxicidad significativa a dosis más altas (> 32 μg / ml). La expresión de Ki-67 en el nucleolo y los cromosomas se observó en el grupo de dosis bajas (Fig. 4A-C). Sin embargo, la relación entre los núcleos positivos para Ki-67 y la población total de núcleos no mostró diferencias significativas en las EMSC tratadas con BP a dosis bajas en comparación con los controles no tratados (Fig. 4D). Por lo tanto, en el presente estudio, elegimos concentraciones de 2 y 4 μg / ml de BP en los siguientes experimentos en los que no se observó citotoxicidad significativa.

La citotoxicidad de los BP. Las células se trataron con BP (0, 2, 4, 8, 16, 32, 64,128, 256 y 512 µg / ml) durante 24 h, y la viabilidad de EMSC se probó mediante el ensayo de proliferación del kit de recuento celular (CCK-8) ( n =9). Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE). ** p <0.01.

La evaluación de la proliferación celular del grupo tratado con BP. Los EMSC se trataron con BP (0, 2 y 4 μg / ml) durante 24 h. La proliferación celular se midió mediante tinción inmunofluorescente con anticuerpo anti-Ki67 (rojo) y DAPI (azul), y se mostraron imágenes fusionadas ( A - C ). Las células positivas para Ki67 entre las células positivas para 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se contaron en dos campos de alta potencia en cada una de las tres placas. Los datos se expresan como la media ± DE ( D ).

Tinción con rojo de alizarina S

Como se muestra en la Fig. 5A, la mineralización en las células se evaluó mediante tinción con rojo de alizarina S después de ser tratadas con el medio acondicionado durante 14 días. Todos los nódulos de calcio se observaron en tres grupos, mientras que los nódulos de calcio sin forma estaban presentes en el grupo de control. En comparación con el grupo de control, los nódulos de calcio depositados en los grupos de 2 y 4 μg / ml fueron más grandes ( p <0.05), pero no se observaron diferencias obvias entre los grupos de tratamiento ( p > 0.05) como se muestra en la Fig. 5C.

Ensayos de tinción de fosfatasa alcalina (ALP) y rojo de alizarina. A EMSC diferenciadas osteogénicas teñidas con solución de rojo de alizarina el día 14; B La tinción de ALP se visualizó al microscopio; C el gráfico muestra la cuantificación de las áreas de depósito de rojo de alizarina; D Se mostró una actividad de ALP significativamente mayor en el grupo de EMSCs tratados con BP que en el grupo de control. Los datos se expresaron como la media ± DE. ** p <0.01

Pruebas de ALP

La tinción de ALP se realizó para estudiar la diferenciación osteogénica de EMSC. En comparación con los del grupo de control, las EMSC en los grupos de BP de 2 y 4 μg / ml eran de color más oscuro (Fig. 5B), lo que sugiere que la adición de BP provocó un aumento de la expresión de ALP en las EMSC. Las células tratadas con BP tenían una actividad ALP más alta que el grupo de control el día 7 ( p > 0.05), pero no se observaron diferencias significativas entre 2 y 4 μg / ml ( p > 0.05) como se muestra en la Fig. 5D.

RT-qPCR

Los principales marcadores de diferenciación, incluido el factor de transcripción 2 relacionado con el runt (RUNX 2), ALP, COL 1, OCN, OPN y la proteína morfogénica ósea 2 (BMP-2), se analizaron el día 14 como se muestra en la Fig. 6. Expresión de todos estos marcadores genéticos se encontró en los tres grupos de células el día 7. No se encontraron diferencias obvias en la expresión génica entre grupos de 2 y 4 µg / ml. Sin embargo, en comparación con las células de control, la expresión de los genes descritos anteriormente en las células tratadas con BP aumentó significativamente.

BP potencia la osteogénesis de EMSC. Las EMSC se cultivaron en medio osteogénico con 0 μg / ml, 2 μg / ml, 4 μg / ml de BP durante 14 días. La expresión de genes implicados en la osteogénesis de EMSC se cuantificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-qPCR). ** p <0.01, * p <0.05.

Los BP mejoran la osteogénesis de los EMSC regulando al alza la expresión de TG2

Dado que se demostró un impacto significativo de TG2 en la diferenciación mediada por integrinas y la deposición de ECM para una amplia gama de células, investigamos si las BP promoverían la diferenciación osteogénica de las EMSC mediante la regulación positiva de la expresión de TG2. Como se muestra en la Fig. 7, detectamos una regulación positiva obvia del TG2 intracelular y extracelular en los grupos tratados con BP. La laminina (LN) y la fibronectina (FN) en las células tratadas con BP a 2 y 4 µg / ml tenían niveles más altos que los del grupo de control (Fig. 7A). Los EMSC expuestos a BP mostraron un aumento de aproximadamente el doble en los niveles de TG2 en comparación con el grupo de control, pero no se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados con BP (Fig. 7B). Como proteína macromolecular, el anticuerpo anti-TG2 no pudo atravesar las membranas celulares. Por tanto, el TG2 extracelular fue bloqueado por el anticuerpo y no logró reticular varios factores de crecimiento y proteínas ECM. Los resultados de Alizarin Red S (Fig. 8A, C) mostraron que el anti-TG2 suprimió marcadamente el aumento de calcio mediado por BP y la deposición de ECM. Mientras tanto, como se muestra en la Fig. 8D, el anti-TG2 inhibió significativamente el aumento de la actividad ALP de las células tratadas con BP. Moreover, anti-TG2 effectively abolished the effects of BPs on the bone matrix proteins expression, including OCN, OPN, and COL I (Fig. 9).

Transglutaminase 2 (TG2) was involved in the osteogenic differentiation of EMSCs. EMSCs were incubated with BPs (2 and 4 μg/ml) for 14 days, and fibronectin (FN), LN, and TG2 levels were assessed by immunoblotting. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05.

Osteogenic differentiation of EMSCs with TG2 neutralizing antibody. A ALP staining. B ARS staining performed to examine extracellular mineralization. C Quantitative ALP analysis. D Quantitative Alizarin red staining analysis. **p  < 0.01

Anti-TG2 inhibited BP-induced EMSC osteogenic differentiation. A Representative western blots of osteoponin, osteocalcin, and collagen 1 (OPN, OCN, LN, FN, and COL I, respectively) in differentiated EMSCs following treatment with 2 μg/ml BPs and 2 μg/ml anti-TG2 or 2 μg/ml BPs alone. B Quantification of OPN, OCN, and COL I protein expression. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05

Discussion

To the best of our knowledge, modification of phosphorus was first exhaustively studied as early as 1914; unfortunately, these studies did not receive much attention for an entire century [27]. Phosphorus is one of the essential elements making up about 1% of the total body weight as a bone component in the human body [28], while most of the other materials cannot warrant such a natural biocompatibility. In 2014, BP was introduced as a new member of the 2D layered materials.

In this study, the BP nanoparticles were prepared on a large scale from bulk BP crystals by using an improved mechanical grinding and continuous ultrasound method. Compared with other methods, this ultrasound and mechanical grinding synthesis is facile and efficient and enables production of BPs on a large scale. For characterization of BPs, SEM was carried out to examine the morphology of BPs. SEM images illustrated that BPs were successfully synthesized, and the typical sizes of BPs are about 100 to 150 nm. The size of particles was further investigated using DLS in the relatively narrow range around 133 nm. The result of SEM corresponded well with the measurement of particle size measurements based on DLS. Interestingly, previous studies demonstrated that BP with larger lateral size has higher cytotoxicity than small BP, while ultra-small BPs were even considered nontoxic up to the high concentration of 1000 μg/ml [29, 30]. Thus, for biomedical applications, the BP nanomaterials still need further study. In addition, Raman scattering revealed the presence of three prominent peaks at 361.5, 437.1, and 465.2 cm ⁻¹ that were associated with the out-of-plane phonon mode (A ¹ _g ) and two in-plane modes (B ² _g and A ² _g ) of BPs. These results were consistent with previous reports [31] in which showed that the BPs had been prepared successfully from bulk BP. XRD shows the phase purity of the prepared BPs. Broadening of the diffraction pattern indicates the nanometer size of individual crystallites.

To evaluate the stability and degradation rate of BPs, Wang and co-workers performed an experiment in which normalized absorption spectra of the BP nanosheets were dispersed in water and exposed to air. After 6 days, they found that the absorbance of the BP nanosheets at 450 nm decreased by 43% compared to the initial value, indicating that BP is easily degraded in the physiological environment [32]. Also, it is well-known that BP is sensitive to water and oxygen, but this shortcoming is considered a merit for biomedical applications. Because of these special characteristics compared with other biomaterials, BPs could potentially avoid material accumulation in human body and then reduce cytotoxicity caused by such material noumenon.

Since MSCs play key roles in bone formation, there is no doubt that transplanting MSCs in animal models of bone defects enhance bone regeneration and promotes functional recovery via BMSC acquisition [33]. Unfortunately, BMSC acquisition procedures are painful for the donor and frequently cause surgical site infection, and the number of harvested BMSCs is low [34]. Previous studies from our laboratory and other reports have shown that EMSCs could be isolated from several adult tissues, such as dental pulp and the nasal mucosa, without causing invasive injury. Moreover, EMSCs were easily induced into osteoblasts, rendering those cells as promising seed cells for bone tissue engineering. Therefore, EMSCs were used in this study. We attempted to obtain the maximum safety BP concentration for EMSCs. As shown in the results, we achieved the maximum safe concentration of BPs (less than 64 μg/ml). The concentrations of 2 and 4 μg/ml of BPs were chosen for further study to avoid any possible potential toxic. The Ki-67 assay was also used to quantify and evaluate EMSC proliferation in these samples after treating these cells with BPs (2 and 4 μg/ml) for 24 h. We did not observe any statistically significant suppression of EMSCs growth in the case of BPs. Meanwhile, our results indicate that during treatment with safe concentrations of BPs, promotion of EMSCs proliferation also occurred.

Some reports have shown that the concurrent binding of BP and calcium ions may benefit osteogenic differentiation, thereby leading to enhanced bone regeneration [35, 36]. To investigate these effects, in vitro EMSCs exposed to BPs were used in osteogenic differentiation experiments. Interestingly, the results of the ALP test and Alizarin Red S staining show that exposure to BPs could promote rather than compromise osteogenetic differentiation of EMSCs compared to the control group. Similar findings have been reported in which phosphorus-rich materials can stimulate mineralization and bone regeneration. Co-expression of osteogenesis-related genes, including ALP, OPN, OCN, COL1, and RUNX2, in differentiated EMSCs was detected at days 7 and 14 by RT-qPCR. Indeed, the expression levels of these osteogenic genes significantly increased in differentiated EMSCs treated with BPs, also providing confirmation of the osteogenic potential of the BPs. Similar results were reported in which BP could induce both the proliferation and osteogenic differentiation of human pre-osteoblast cells. Together these results indicate that the BPs were able to induce osteogenic differentiation of EMSCs.

It can be asked, “How do BPs promote osteogenetic differentiation of EMSCs?” It is well accepted that phosphorus can capture Ca ²⁺ in vivo to form calcium phosphate deposits that accelerate bone regeneration, while BP can be the resource of phosphorus ions [36]. Tong et al. believes that BP generate mild heat (40–42 °C), which causes up-regulation of heat shock protein (HSPs) expression and stimulates bone regeneration [37, 38]. Moreover, in this study, the upregulated activation of TG2 levels was also observed in BPs treatment groups. To the best of our knowledge, TG2 has important enzymatic and non-enzymatic functions at these locations in which it crosslinks various ECM proteins and modulates the interactions of cells with the ECM and soluble growth factors by non-covalent interactions with and regulation of integrins [39,40,41]. Obviously, the BPs can react strongly with oxygen and water and finally degrade to non-toxic phosphate in aqueous solutions, which is a crucial component of ATP. Nakano Y et al. reported that ATP can act as a significant phosphate (Pi) source for mineralization in MC3T3-E1 osteoblast cultures, indicating that ATP-hydrolyzing enzymes could induce mineral deposition [42]. They also found that TG2 could not only act as a phosphatase but could be involved in ATP hydrolysis in the osteoblast cultures thus further contributing to the elevation in Pi levels required for mineral deposition, which may be beneficial to EMSC energy metabolism. This process may be part of the contribution that BPs makes toward enhancement of EMSC osteogenic differentiation. On the other hand, thanks to TG2 bio-functions, a wide variety of ECM adhesion proteins, including LN, COL I, and FN, could maintain a stable state. Indeed, in the present study, we observed that ECM (FN, COL I, and LN) were significant higher in BP-treated EMSC groups. BPs provide a favorable ECM microenvironment for promoting greater osteogenic EMSC differentiation and proliferation.

Until now, no secretory signal sequences and hydrophobic or transmembrane domains have been clearly identified in TG2 because the protein is not localized in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi compartments [39, 43], and only few studies reported about these factors that control TG2’s secretion. Therefore, it remains unclear as to the exact mechanism of BP regulation of expression patterns of TG2 in the progress of EMSC osteogenic differentiation.

Conclusion

In the present study, BPs were successfully fabricated using mechanical grinding and continuous ultrasound method. At bio-safe concentrations, BPs activated TG2, and promoted the expression of ECM, which further promoted osteogenic differentiation of EMSCs. From these results, we can conclude that BPs would be suitable for incorporation into tissue-engineered scaffolds that utilize EMSCs to repair bone defects. Although our research highlights the great potential of BPs in nano-biomedicine, large-scale preclinical and clinical studies concerning its safety are needed before any clinical applications are established.

Disponibilidad de datos y materiales

The datasets generated during and/or analyzed during the study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abreviaturas

BPs:

Black phosphorus nanoparticles

EMSCs:

Ectodermal mesenchymal stem cells

TG2:

Transglutaminase 2

2D:

Two-dimensional

ECM:

Extracellular matrix

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

NMP:

N -Methyl-2pyrrolidone

PBS:

Phosphate-buffered saline

DMEM/F12:

Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F12

FBS:

Fetal bovine serum

SD:

Sprague Dawley

SEM:

Scanning electron microscopy

XPS:

X-ray photoelectron spectroscopy

CCK-8:

Cell counting kit

OD:

Optical density

RT-qPCR:

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

GAPDH:

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

BSA:

Bovine serum albumin

TBS:

Tris-buffered saline

DAPI:

4′6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamic light scattering

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