Los estudios de establecimiento y aplicación de un indicador de pH de lisosoma preciso basado en nanopartículas autodescomponibles

Resultados y discusión

En primer lugar, detectamos la expresión génica diferencial cuando las células se alimentaban con nanopartículas de sílice porosa negra funcional PEG dual (NP BPSi) (ofrecidas por nuestro laboratorio colaborador [12]). El cambio del potencial zeta de -18,5 a + 2,8 mV también indicó que la PEGilación dual de superficie fue exitosa (Fig. S1a). El diámetro medio de las nanopartículas de BPSi fue de 156 nm (Fig. S1b). Basándonos en el mapa de calor de grupos de expresión génica diferencial (Fig. S2), seleccionamos más de 2 veces las expresiones génicas diferenciales para una investigación adicional. Se introdujeron Go y KEGG para analizar los genes diferenciales. A partir de los mapas de burbujas de enriquecimiento de Go (Fig. 1a), se seleccionaron los genes metabólicos y asociados a lisosomas, incluidos el ensamblaje de fagolisosomas, la fagocitosis y el proceso metabólico xenobiótico para su análisis adicional. En particular, las expresiones génicas asociadas a TFEB-CLEAR [17] aumentaron significativamente. Los resultados de RT-PCR (Fig.1b) también verificaron los resultados de secuenciación de genes, los genes en TFEB, la expresión lisosomal coordinada, y la vía de regulación (CLEAR) aumentaron significativamente, como CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2 y TPP1. . Estos genes se han marcado en la ruta del lisosoma, como se muestra en la Fig. S3. Su expresión es superior a la del grupo de control y tiene significación estadística ( P _{Control BPSi VS} <0,05). Y TFEB regula positivamente la expresión de genes lisosomales, controla la población de lisosomas y promueve la degradación celular de sustratos lisosomales.

La autofagia se activa en las células HepG-2 después de la alimentación con BPSi. un GO mapa de burbujas de enriquecimiento de los genes expresados ​​diferencialmente encontrados por secuenciación del transcriptoma. b Verificación de cambios genéticos en la red de genes TFEB-CLEAR después de BPSi tratado mediante experimentos RT-qPCT. c Expresión de la proteína P62, TFEB, LC3B II / I después del tratamiento con BPSi. d Intensidad gris de banda normalizada de proteína P62, TFEB, LC3B II / I en grupos tratados con BPSi según el grupo de control. Los datos se presentaron como media ± DE.

Además, TFEB regula la autofagia, y su sobreexpresión conduce a un aumento significativo en la producción de autofagosomas en células cultivadas debido al hecho de que la función principal del gen TFEB es inducir la biosíntesis de lisosoma y promover la aparición de autofagia [20]. También se empleó el análisis de transferencia Western para atestiguar si la autofagia ocurrió cuando las células se alimentaron con NP de BPSi. El propósito de la prueba de Western fue confirmar además que la expresión de TFEB aumentó y la aparición de autofagia celular después de la alimentación con BPSi. Las proteínas LC3B y P62 son ambas marcadores de autofagia. Cuando se produce la autofagia, aumenta la expresión de la proteína asociada a microtúbulos 1A / 1B-cadena ligera 3B (LC3B) II / I. p62 es un receptor de vesículas que se degradarán por autofagia y también es un receptor de agregados de proteínas ubiquitinados que se eliminarán, y su expresión disminuye cuando ocurre la autofagia. Entonces medimos la expresión de estas proteínas en el experimento occidental.

A partir de los resultados de la transferencia Western que se muestran en la Fig. 1c, d, TFEB ( P _{80 μg / ml de control VS} =0,000008), LC3B II / I ( P _{80 μg / ml de control VS} =0.000297) y p62 ( P _{80 μg / ml de control VS} =0,000016) proteínas todas significativamente reguladas positivamente. Como la regulación positiva de las proteínas TFEB y LC3B II / I indica la activación de la autofagia [18], sospechamos que la endocitosis BPSi promueve la aparición de autofagia. Sin embargo, se supone que la proteína p62 está regulada negativamente durante el proceso de autofagia, debido a la naturaleza de la proteína transportadora que llevó los endosomas a los lisosomas y finalmente se degradaron. En nuestro estudio, la importante regulación positiva de p62 indicó la terminación de la degradación durante el proceso de fusión de endolisosoma [21], que probablemente se debe al aumento del pH en las vesículas de endosomas. Por lo tanto, la endocitosis de BPSi puede primero inducir la aparición de autofagia, luego inhibir el proceso de autofagia al aumentar los valores de pH del endo / lisosoma, debido a su alcalinidad de amida.

Para atestiguar las características de aumento de pH en endo / lisosomas por endocitosis BPSi, se emplearon dos sondas fluorescentes de pH comerciales en nuestro estudio, pHrodo ™ Red Transferrin Conjugate (Thermo Fisher ^# P35376) y RatioWorks ™ PDMPO.

pHrodo ™ Red, como indicador comercial de pH intracelular, generalmente presenta una fluorescencia débil a pH neutro, pero aumenta la fluorescencia a medida que desciende el pH. Se suponía que debía cuantificar el pH citosólico celular en el rango de 9–4 con un pKa de ~ 6,5 con excitación / emisión de 560/585 nm. Pudimos obtener una conclusión de análisis cualitativo a partir de 6 determinaciones de líneas celulares de que la endocitosis de NP de BPSi tiene la capacidad de aumentar los valores de pH en endo / lisosomas, debido al debilitamiento de las señales fluorescentes rojas (Fig. S4 y S5). Sin embargo, después de repetir los experimentos varias veces siguiendo los protocolos de operación del producto, apenas analizamos cuantitativamente el valor exacto del pH que disminuyó entre las diferentes líneas celulares antes o después de la alimentación con NP BPSi debido a que no había correlación entre la intensidad y los valores de pH establecidos.

Luego se empleó PDMPO como una mejor solución para indicar los cambios del valor de pH después de la endocitosis de BPSi, que introduce técnicas de formación de imágenes de relación en la medición cuantitativa del pH. PDMPO [2- (4-piridil) -5 - ((4- (2-dimetilaminoetilaminocarbamoil) metoxi) fenil) oxazol] se caracteriza como sonda de pH acidotrópica de doble excitación y doble emisión. Emite una fluorescencia verde intensa a un pH más bajo y da una fluorescencia azul intensa a un pH más alto. Esta fluorescencia única dependiente del pH hace que la PDMPO sea una sonda de pH ideal para orgánulos ácidos con pKa =4,47. PDMPO marca selectivamente los orgánulos ácidos (como los lisosomas) de las células vivas y los dos picos de emisión distintos se pueden utilizar para controlar las fluctuaciones del pH de las células vivas en las mediciones de proporción. Sin embargo, todavía fallamos en medir los valores de pH en 6 líneas celulares antes y después de la alimentación con BPSi. Como se muestran los resultados en la Fig. S6, no se observaron diferencias significativas en las 6 líneas celulares antes y después de la alimentación con BPSi. Aunque se ha establecido una correlación entre la relación azul / verde y los valores de pH (Fig. S7), la correlación no lineal de pH 4-5 hace que el método PDMPO falle en el análisis cuantitativo de endo / lisosomas antes y después de las alimentaciones con BPSi.

A partir de los datos de dos indicadores de pH comerciales anteriores, demostramos en primer lugar nuestro sospecha de que las nanopartículas decoradas con PEG con amida en la cadena de PEG podrían hacer que el pH del endo / lisosoma aumente debido a la naturaleza alcalina de la amida. Sin embargo, sin el análisis cuantitativo de los cambios precisos del pH (rango de pH 0,1), todavía no podemos establecer las correlaciones entre el estado de autofagia y los valores de pH del endo / lisosoma, por lo que no se pudo predecir la autofagia.

Basándonos en nuestro estudio anterior sobre nanopartículas autodescomponibles [13, 14] [15, 22], mantuvimos la misma concentración de hidróxido de amonio en etanol al 75%, pero ajustamos las concentraciones de MB y TEOS. Se han establecido dos series de cantidades de TEOS en 100 μL y 80 μL, para obtener diferentes espesores de capa y tamaño de poro. Se han establecido diez series de cantidad de MB para obtener diferentes tamaños de la estructura central hueca y la eficacia de carga de MB.

Las cantidades de MB y TEOS agregadas en los protocolos se describen en la Tabla 1 a continuación.

Como se muestra en la Fig. 2a, b, el tamaño de las nanopartículas aumentó con el aumento de la cantidad de MB, en ambas concentraciones de TEOS (100 μL y 80 μL). A la misma concentración de MB, el tamaño de partícula aumentó con el aumento de la cantidad de TEOS. Moreover, with the increase of the TEOS amount, the shell thickness grew up, which has been proved by the element mapping (shown as Fig. 2c). The polydispersity index (PDI) and surface charge of the nanoparticles are shown in Fig. S8 and Table S1. The morphology studies predicted that with the increase of MB amount, the loading efficiency will grow up, leading to the faster release profile, while with the increase of TEOS amount, the release will slow down. And we need to find out the appropriate MB and TEOS concentration, with which we could obtain the optimized nanoparticle systems, that we may be able to make the MB release profile linear correlated with the pH changes.

Morphology characterization of 10 different self-decomposable nanoparticles with specific MB or TEOS amount. un STEM figures. b Nanoparticle size distribution analysis. c Si mapping of 10 self-decomposable nanoparticles. Scale bars in all figures are 100 nm. The size distribution analysis was performed by randomly chosen 100 nanoparticles from STEM figures and measured by ImageJ software. Data was presented as mean ± S.D.

The MB loading efficiency was determined by UV-Vis spectrum. The standard curve (Fig. S9) of MB was firstly drawn using series concentrations of MB solution (from 6.25 to 46.88 μg/mL), with the equation as y  = 67.63x  + 0.10919, R ²  = 0.9987. As calculated with the equation above, we obtain MB loading efficiency of 10 self-decomposable nanoparticles with specific parameters, detailed data shown in Fig. S10.

Before the study of the MB release profiles in different pH solutions, the release profiles in pure water have been studied. As shown in Fig. S11 and Fig. S12, all the nanoparticles with TEOS amount of 80 μL presented increased MB release along with the duration increase, which was reflected by the UV–Vis absorption. Moreover, with the MB encapsulated amount increase, the growth trend of MB release becomes more significant. Also, the release velocity grows faster. However, as the TEOS amount increase to 100 μL, the particle surface became more densed and the release becomes slower when the MB amount below 3.0 mg; almost no increase trend could be observed in the MB release in water during 14 days of release. As long as the MB amount increases to above 4.0 mg, an obvious increase trend of MB release could be observed. One thing to be noticed is that the nanoparticle parameter of both NPs_7.5/80 and NPs_6.0/100 presented solid growth as the time prolongs, almost showed a linear increase trend during the first 7 days, and then reached the platform.

Then, we focused on the MB release behavior in different pH buffers to figure out whether self-decomposable nanoparticles with specific parameters could have the linear pH-dependent MB release.

Firstly, we carried out the MB release experiments at pH 4.0 buffer solution. From Fig. S13, we could easily reach the conclusion that with the same TEOS amount of 100 μL, the MB release velocity presented a similar trend was observed in the 5 nanoparticle systems of TEOS at 80 μL (Fig. S14), the center positive correlation with the MB encapsulated amount.

Concentrated MB diffuses into the surrounding solution via diffusion due to concentration difference. The bigger concentration gradient makes the faster MB release. Compared with the MB release in pure water, we found that the acidic environment speeded up the release of MB (Fig. S13 and S14 compared with Fig. S11 and S12), indicating that the MB release is not only driven by diffusion; however, in acidic solutions, electrostatic repulsion is also an important driven force due to the positive charge nature of MB. We then calculated the release percentage of each nanoparticle parameter according to the MB loading efficiency, MB standard curve, and the dilution ratio at measurements. The release percentage reflected the release speed of MB in pH 4.0 acidic solution, and the results (Fig. 3) showed that only the release percentage of NPs_7.5/80 presented linear release in pH 4.0 solution. Other nanoparticle systems with specific MB and TEOS parameters showed similar release trends, and the release percentage did not have a linear growth. One exception is NPs_6/100 , and the MB release reached the platform in only 72 h; thus, it was hard to tell whether the MB release could grow linear before that duration at this stage.

MB release percentage of 10 series self-decomposable nanoparticles after a specific duration in pH 4.0 buffer. All experiments were triple repeated, and the data were shown as mean ± S.D.

Meanwhile, we tested the MB release profiles in near-neutral and alkali buffers (pH 6.86 and pH 9.18). The results in both Fig. S15, S16, Fig. S17, and S18 demonstrated that the MB release slowed down with the solution pH increase to 6.86; moreover, with the central MB concentration increased, the MB release percentage decreased. At pH 9.18, all nanoparticles with 10 specific parameters presented a very slow MB release (Fig. S19 and S20); no matter in UV–Vis absorption or the release percentage, the trend was similar with the one in pH 6.86 buffer, but with even lower release percentage. So, it was clear that the self-decomposable nanoparticles only presented MB release linear growth in acidic solutions. We thought back to the endo/lysosomes pH, from 4 to 5, which is exactly the pH range of MB linear growth as a function of time in a specific MB/TEOS parameter. Thus, we get more confident that the self-decomposable nanoparticle system may be an accurate measuring tool for quantitative determining the endo/lysosome average pH, then provide evidence on the exact pH value of autophagy status.

The precondition of using the specific self-decomposable nanoparticles as an endo/lysosome pH indicator is that the nanoparticles stay stable in the endo/lysosome during the whole measurement process. Secondly, the MB release in endo/lysosome should occur smoothly when the measurement carried out.

The colocalization of the nanoparticle in the endo/lysosomes by cell TEM study and the MB release in 6 different cell lines were studied. From the cell TEM results, all of the 10 series nanoparticles stayed in the endo/lysosomes without escaping, after 24-h incubation with the HepG-2 cells (Fig. 4). Since the diameter of HepG2 cells used in Fig. 4 is about 10–20 μm and the diameter of MB@SiO₂ nanoparticles is between 75 and 200 nm, it will be very difficult to clarify the nanoparticle morphologies using the images with low magnification (as shown in Fig. S21). We also investigated the intracellular location of the nanoparticles in the other 5 cell lines, and 4 nanoparticles were randomly selected to demonstrate the nanoparticles were trapped in the endo/lysosomes (Fig. S22). The nanoparticles with all parameters showed a central hollow structure in all other 5 cell lines after 24-h incubation, indicating the MB release. Moreover, under more precise observation, we noticed the MB release may be different due to different hollow sizes, pointing to the fact that (1) the endo/lysosome pH in different cells is different and (2) the MB release from the nanoparticles is very sensitive to the endo/lysosomes pH, especially for the NPs_6/100 and NPs_7.5/80 . From Fig. S23, we can find that nanoparticles have already realized the endocytosis and stayed in the vesicles 2 h after nanoparticle feeding, then nanoparticles gradually accumulated in lysosomes.

The colocalization of the nanoparticle in the endo/lysosomes by cell TEM study after 12 and 24 h incubation with the 10 series nanoparticles. The scale bar is 200 nm in the TEM images

We then evaluated the correlation between the pH values and the OD values in pH 4.0–4.8. From the results in Fig. 5 and Fig. S24, for NPs_6/100 and NPs_7.5/80 nanoparticle systems, the MB release presented a linear decrease as a function of pH in the pH range from 4.0 to 4.8.

MB release as a function of pH values in NPs6/100 and NPs7.5/80 after specific incubation duration, 6 h, 12 h, and 24 h. The linear correlation equations were also calculated for 6 h and 12 h for MB release from both NPs6/100 and NPs 7.5/80 as a function of pH values. All experiments were carried out triplicated, and the data were shown as mean ± S.D.

We then converted the OD value to the MB release percentage according to the MB loading efficiency and feeding amount. As shown in Fig. S25, in the first 6 h, the MB release percentage in NPs_6/100 and NPs_7.5/80 nanoparticle systems also presented as a function of pH values. We then calculated the residual sum of squares and Pearson’s related coefficient at 6 h and 12 h release duration, respectively, as the residual sum of squares present a negative correlation with closeness of linear fitting, while the closer the absolute value of Pearson’s related coefficient to 1, the more linear it is. As shown in Table S2 and S3, the highest degree of linearity is the fitting of NPs_6.0/100 nanoparticle systems, followed by the one of NPs_7.5/80 at 6 h release.

Till then, we were so excited by the results that the method for precisely monitoring the pH values has been established, especially with the accuracy less than or equal to 0.1 pH value interval. That means, we have great possibilities to figure out the correlation between endo/lysosome pH values and the autophagy status, which is of great significance for better studying the autophagy mechanism and predicting the autophagy process. As we can see in Fig. S26, the MB release in HepG-2 cells have already reached the plateau after incubation for 4 h. Thus, we chose 6 h as the observation time point.

We then carefully investigated the MB release of NPs_6.0/100 in 6 cell lines in the nanoparticle cell interaction duration of 6 h, including liver cancer HepG-2 cell line, colon cancer HCT8, HCT 15, and HCT 116 cell lines, lung cancer A549 cell line, and myomelanocytic cancer B16 cell line.

As shown in Table 2, we clearly differentiate the endo/lysosomes in 6 cancer cell lines, with the accuracy at 0.01 pH values, which is impossible to be done with the commercial intraocular pH indicator kits.

Moreover, we re-evaluated pH values in endo/lysosomes of the HepG2 cells before and after cultured with BPSi nanoparticles. We reached the conclusion that BPSi uptake significantly increases the endo/lysosome pH values, from 4.70 ± 0.09 to 5.59 ± 0.05, perfectly illustrating the reason for BPsi uptaken induced the autophagy initially then terminated the autophagy flux. The intracellular uptake of BPSi makes the quantities of the endo/lysosomes increased, which was consistent with the results of gene sequencing, that autophagy-related genes (TFEB-CLEAR) were activated. Meanwhile, the autophagy termination by the increased pH values in endo/lysosomes also coincide with the results of p62 proteins upregulation in Western blot study.