Desarrollo de un Sensor Preciso de pH Lisosomal mediante Nanopartículas de SiO₂ Autodescomponibles

Resumen

El pH ácido de los lisosomas está estrechamente relacionado con la autofagia; por tanto, conocer con precisión los cambios de pH lisosomales dará más información sobre el proceso y estado autofágico. Hasta ahora, sin embargo, solo se podían indicar cambios de pH en rangos relativamente amplios; la detección exacta del pH lisosomal nunca se había logrado. En nuestro estudio, establecimos un indicador de pH endolisosomal basado en sistema de nanopartículas de SiO₂ autodescomponibles con parámetros de síntesis específicos. El azul de metileno (AM) concentrado en el centro de nanopartículas huecas estructurales mostró liberación sensible en función de valores pH 4.0–4.8, exactamente el rango pH lisosomal. Se estableció correlación lineal entre valores densidad óptica (DO) y pH, usada para detectar pH lisosomal en 6 líneas celulares distintas. Además, con este sistema logramos detectar precisamente los cambios promedio de pH lisosomal antes y después de endocitosis de nanopartículas de silicio mesoporoso negro (BPSi), clarificando el mecanismo de terminación de autofagia tras endocitosis BPSi. Así, el indicador de pH luminal basado en nanopartículas autodescomponibles puede proporcionar nueva metodología y estrategia para conocer mejor el pH lisosomal, indicando más detalles sobre el proceso autofágico u otras señalizaciones importantes del metabolismo.

Introducción

Los lisosomas sirven como destino final de macromoléculas, donde estas son degradadas por enzimas hidrolíticas activadas por bajo pH. El pH ácido lisosomal mantenido por ATPasa vacuolar tipo H⁺ (v-ATPasa) que bombea protones del citoplasma al lumen lisosomal mantiene actividad de ~60 tipos enzimas hidrolíticas. Además, literatura reciente revela que pH ácido lisosomal está estrechamente relacionado con autofagia, por lo que conocer con precisión cambios pH lisosomal dará más información sobre proceso y estado autofágico. Basado en nuestros estudios y revisión bibliográfica, la endocitosis de nanopartículas con carga positiva amina probablemente aumentará cambio pH en endolisosomas, como nanopartículas decoradas con PEG amina primaria/secundaria o decoración hidrofílica en superficie partícula.

El aumento pH inducido por endocitosis nanopartículas amina aumentará dramáticamente localización nuclear factor transcripción EB (TFEB), resultando no solo en upregulación transcripcional vía, sino también disfunción lisosomal, bloqueando finalmente flujo autofágico. TFEB regula autofagia, y su sobreexpresión conduce a aumento significativo producción autofagosomas en células cultivadas.

Así, para predecir proceso autofagia y detalles, medición precisa pH lisosomal y sus cambios es crucial. Hasta ahora, revisiones literatura indicando valor pH endolisosomal y productos comerciales para detectar pH endolisosomal solo indican cambios pH rango amplio; detección exacta pH lisosomal nunca ha llegado. Para conocer detalles insight autofagia, establecer método detección preciso cambio pH luminal es enfoque importante.

Basado en experiencias previas con nanopartículas SiO₂ autodescomponibles, establecimos indicador pH preciso que realiza detección cambios pH luminal. NPs SiO₂ tienen ventajas tamaño ajustable y biocompatibilidad. Estableciendo parámetros síntesis específicos, el indicador pH SiO₂ autodescomponible establecido libera sensible carga azul metileno (AM) en pH 4.0–4.8, exactamente rango pH lisosomal. Además, liberación AM presentó correlación lineal con cambios valor pH (esquema 1). Probamos factibilidad indicador pH nivel celular introduciendo 6 líneas celulares distintas, logrando determinar cambios promedio pH lisosomal antes y después endocitosis NPs BPSi, clarificando mecanismo terminación autofagia tras endocitosis BPSi. Así, indicador pH luminal basado en nanopartículas autodescomponibles puede proporcionar nueva metodología y estrategia para conocer mejor pH lisosomal, indicando más detalles proceso autofagia u otras señalizaciones importantes metabolismo.

Ilustración esquemática medición pH lisosoma en células vivas con AM@SiO₂.

Materiales y Métodos

Sección Materiales

Silicida sódica (NaSi) y obleas Si (diámetro 20 cm, p+ (100), 0.01–0.02 Ω cm) proveídas por SiGNa Chemistry Inc. y Ocmetic Inc. Bromuro amonio (NH₄Br, 99 %), bromuro sodio (NaBr, 99 %), tolueno (anhidro, 99.8 %), ácido clorhídrico (HCl, 37 %), AM, y ortosilicato tetraetilo (TEOS) de Sigma-Aldrich. Metoxi-PEG-silano 0.5 kDa y 2 kDa de Fluorochem Ltd. y Laysan Bio Inc. Medio RPMI 1640 Life Technologies. Suero fetal bovino (SFB) TianHang biotecnología. Bicarbonato sodio, sulfato estreptomicina, penicilina G, HEPES, Solución Lisozima, CellLight Endosomas Tempranos-GFP, LysoTracker™ Red DND-99, Kit Pierce® BCA Ensayo Proteína, quimioluminiscencia mejorada, conjugado pHrodo™ Red Transferrina, Solución Imagen Celular Viva, reactivo Trizol de Thermo Fisher Scientific. Etanol y agua amoníaco Sinopharm. Kit BioRT Master HiSensi cDNA Primera Cadena Síntesis Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd. Lisado RIPA Heart Biological Technology Co., Ltd. Anticuerpos P62, TFEB, β-actina Proteintech Group, Inc. Anticuerpo LC 3B Abcam. 2-(4-Piridil)-5-((4-(2-dimetilaminoetil-aminocarbamoil) metoxi) fenil) oxazol (PDMPO) Yeasen Biotech Co., Ltd.

Objetivo, Diseño y Configuración del Estudio

Objetivo: (1) explorar influencia NPs BPSi en autofagia células HepG2, (2) hallar mecanismo subyacente cambios valor pH lisosomal afectando autofagia, (3) establecer indicador preciso pH lisosomal que mida pH lisosomas precisamente, y (4) indicar influencia fluctuación pH en autofagia. Para realizar propósito, empleamos experimento secuenciación transcriptoma explorar cambios genes transcriptoma células HepG2 tras alimentar NPs BPSi y verificamos con RT-qPCR y Western. Colorantes fluorescentes como PDMPO usados medir cambio pH lisosomal células HepG2 tras alimentar BPSi. Para medir pH lisosomas precisamente, desarrollamos NPs AM@SiO₂ con 10 parámetros y probamos caracterizaciones estos 10 tipos NPs mediante experimentos DLS y HR-TEM. Eficiencia carga AM y cinética liberación 10 series sistemas nanopartículas autodescomponibles probadas en soluciones diferentes pH y células HepG2. Verificar localización intracelular NPs tras entrar célula, experimento TEM celular y microscopía confocal vivo. Finalmente, medimos cambios pH lisosomal en 6 tipos células tras alimentar BPSi verificar universalidad NPs AM@SiO₂ medir cambios pH lisosomal.

Síntesis Nanopartículas BPSi

NPs BPSi preparadas por método previo [12] y suministradas por colaborador (Wujun Xu, Depto. Física Aplicada, Universidad Oriental Finlandia). Preparación BPSi, NaSi, sal amonio, NaBr (NaSi:NH₄Br:NaBr 1:4:4 p/p/p) molido en caja guante atmósfera Ar. Reaccionaron horno tubular atmósfera N₂ 240 °C 5 h (Ec. 1). Enfriados temperatura ambiente, micropartículas obtenidas purificadas enjuagando 0.5 M HCl y 1.0 M HF separadamente. Micropartículas molidas bola etanol 1000 rpm 15 min, NPs BPSi diámetro deseado recolectadas ajustando velocidad centrifugación.

NaSi + NH₄Br → NaBr + NH₃ + Si/H + H₂ (1)

Mediante experimento Dispersión Luz Dinámica, se estudiaron distribución diámetro y carga superficial NPs. Todos NPs dispersados medio tras esterilización ultrasonicación ligera (5 s dispersar uniformemente solución, Limpiador ultrasónico SB-5200DT, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.) justo antes introducción células.

Establecimiento Sistema 10 Series Nanopartículas Autodescomponibles

10 series NPs autodescomponibles sintetizadas metodologías reportadas antes [13–16], con parámetros modificados. Procedimiento típico: cierta cantidad AM añadida mezcla etanol (75 mL) con solución agua amoníaco (25 %, 3.4 mL), tras lo cual cierta cantidad TEOS añadida. Series NPs AM@SiO₂ obtenidas tras agitación 24 h y lavado 3 veces antes secado. Cantidades AM y TEOS en protocolos descritas Tabla 1. Significado 1.0/100 en NPs₁.₀/₁₀₀ representó inventario AM y TEOS al sintetizar NPs, con 1.0 mg AM y 100 μL TEOS. Significados 1.5/100 en NPs₁.₅/₁₀₀ y otros consistentes con 1.0/100.

Cultivo Celular

Para probar eficiencia y universalidad indicador pH basado en NPs autodescomponibles, probamos en líneas celulares tumorales cancerígenas específicas. Seleccionamos líneas cáncer hígado, pulmón, colon, melanocitoma. Líneas células cáncer colon humano HCT116, HCT8, HCT15; cáncer hígado humano HepG-2; cáncer pulmón humano A549; melanoma ratón B16 mantenidas medio RPMI 1640 (Life Technologies) suplementado 10 % SFB inactivado calor, 2.0 g/L bicarbonato sodio, 0.1 g/L sulfato estreptomicina, 0.06 g/L penicilina G, 5.958 g/L HEPES. Células mantenidas incubadora estándar 37 °C atmósfera humidificada 5 % CO₂.

Caracterizaciones 10 Series Sistemas Nanopartículas Autodescomponibles

Morfología todas series NPs caracterizada HR-TEM modo STEM, mapeo Si estudiado mapeo elemental EDS. Análisis distribución tamaño NPs realizado software ImageJ calculando diámetros NPs en imágenes STEM seleccionadas aleatoriamente. Potencial zeta e índice polidispersidad (PDI) medidos estudio dispersión luz dinámica (DLS) en buffers serie con valores pH específicos. Datos analizados SPSS15.0, resultados presentados media ± DE.

Eficiencia Carga AM y Estudio Cinética Liberación 10 Series Sistemas Nanopartículas Autodescomponibles

Para estudiar eficiencia carga AM y cinética liberación, primero curva estándar AM concentraciones serie establecida. Absorción AM realizada espectro UV-Vis absorbancia 660 nm, λmax monómero AM. Eficiencia carga AM (%) = cantidad AM encapsulada / (cantidad total AM entrada).

Liberación AM 10 series NPs estudiada agua pura y buffers pH diferentes (pH 4.0, 6.86, 9.18) y Solución Lisozima (Thermo Scientific #90082). Cinética liberación AM tras duración específica diferentes buffers pH también investigada. Valores DO 660 nm y porcentajes liberación AM función tiempo estudiados.

En detalle, estudios liberación AM realizados protocolos: disolver 10 series NPs 15 mL buffer estándar pH 4.0, 6.86, 9.18 con solución lisosoma respectivamente; liberación AM mezclador Hula 37 °C. Durante 15 días, 1 mL cada muestra recolectado, centrifugado 12000 rpm 10 min. Sobrenadante y precipitado medidos espectros absorción 200–800 nm.

Además, liberación AM en buffers pH precisos con solución lisozima rango pH 4.1–5.5 investigada mismos protocolos. Duraciones específicas (6 h, 12 h, 24 h) puntos observación. Absorciones 660 nm registradas cada muestra. Relación lineal absorción cada solución pH y suma cuadrados residuos contados cada punto tiempo.

Detectar perfiles liberación AM en células, células HepG-2 cultivadas frasco 75 cm² alimentadas NPs (300 μg/mL) al 70 % confluencia. Cada 30 min, células recolectadas. Células congeladas y descongeladas repetidamente liberar AM completamente. Lisados celulares centrifugados 12000 r/min 10 min. Sobrenadante obtenido medido absorbancia 660 nm calcular cantidad total AM liberado. En este estudio, células HepG2 elegidas objeto investigación por rápida proliferación minimizando varianza entre 10 grupos probados.

Colocalización Celular 10 Series NPs y Rendimiento Liberación 6 Líneas Celulares Diferentes

TEM celular empleado estudiar colocalización NPs endolisosomas protocolos estándar TEM celular. Células sembradas 1×10⁶ células/frasco incubadas 24 h permitiendo adhesión. 10 series NPs medio misma concentración (100 μg/mL) incubadas células 12 y 24 h respectivamente. Células lavadas PBS 3 veces eliminar NPs exceso, fijadas 2.5 % glutaraldehído >1 día. Células fijadas lavadas teñidas tetróxido osmio 1 % agua desionizada 1 h, seguido lavado PBS 3 veces y agua DI 2 veces. Protocolo TEM celular clásico [17, 18] realizado, secciones 90 nm espesor recolectadas observación TEM. Liberación AM función valores pH estudiada 6 líneas celulares con NPs₆/₁₀₀ y NPs₇.₅/₈₀. Valores DO liberación AM y porcentajes liberación registrados análisis datos.

Investigación Captación Intracelular NPs AM@SiO₂

Microscopía confocal vivo usada evaluar captación celular y destino intracelular NPs AM@SiO₂. Endosomas tempranos células HepG-2 teñidos (CellLight Endosomas Tempranos-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher C10586, ex/em ~488/510 nm) 16 h. Luego células incubadas NPs₆/₁₀₀ (AM ex/em: 640/650–700 nm) concentración 100 μg/mL intervalos tiempo específicos (2 h, 2.5 h, 3 h, 5 h, 6 h). Antes tomar imágenes, lisotracker teñido LysoTracker™ Red DND-99 (Thermo Fisher L7528, ex/em: 577/590 nm) 40 min. Eliminar solución tinte lavar células 2–3 veces PBS. Imágenes tomadas microscopio confocal Nikon A1R.

Secuenciación Transcriptoma Evaluar Cambio Expresión Génica tras Alimentación BPSi

Extracción ARN total grupo control y grupo BPSi-tratado realizada reactivo Trizol procedimientos estándar. Calidad ARN inicial total experimento secuenciación detectada espectrofotómetro NanoDrop ND-2000. ARN total pasó control calidad usado experimentos secuenciación subsiguientes. Comparación expresión génica realizada secuenciación nueva generación. Programas secuenciación realizados BGI-Shenzhen Corporation (Shenzhen, China) plataforma BGISEQ-500. Datos brutos secuenciación control calidad determinar idoneidad análisis subsiguiente. Si pasó, análisis cuantitativo genes basado niveles expresión y análisis enriquecimiento significativo funciones ontología génica (GO) genes diferencialmente expresados entre muestras seleccionadas.

Ensayo RT-qPCR Confirmar Activación Red Génica TFEB-CLEAR

ARN total extraído células HepG-2 cultivadas control y grupos BPSi-tratados reactivo Trizol y retrotranscrito cDNA usando Kit BioRT Master HiSensi cDNA Primera Cadena Síntesis (Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd.) con primers aleatorios. cDNA usado amplificar red génica TFEB-CLEAR PCR cuantitativo con sistema Applied Biosystems™ 7500 PCR tiempo real (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) con actina control referencia. Primers usados RT-PCR cuantitativo listados Tabla S4.

Ensayo Western Blot Confirmar Activación Autofagia tras Alimentación BPSi

Proteínas celulares grupo control y grupos BPSi-tratados diferentes concentraciones extraídas lisado RIPA (Heart Biological Technology Co., Ltd.). Inhibidor proteasa añadido lisado RIPA pre-enfriado hielo. Lavadas células 3 veces PBS pre-enfriado. Eliminado líquido completamente plato hielo 2 min. 400 μL lisado RIPA añadido superficie plato, pipeteado varias veces, incubado hielo 30 min agitando plato varias veces lisar completamente células. Fluido lisado transferido tubos Eppendorf 1 mL centrifugado 13000 rpm 10 min 4 °C. Sobrenadante obtenido hervido agua 10 min colocado –20 °C uso posterior. Concentración proteína cuantificada Kit Pierce® BCA Ensayo Proteína (Thermo scientific).

Extractos celulares 25 μg proteína total sometidos directamente SDS-PAGE y transferidos. Membranas bloqueadas 5 % leche desnatada e incubadas anticuerpos primarios reconocen P62 (Proteintech #18420–1-AP), TFEB (Proteintech #13372–1-AP), LC 3B (Abcam #ab192890), β-actina (Proteintech #20536–1-AP). Anticuerpos secundarios elegidos según especie origen primarios detectados quimioluminiscencia mejorada (Pierce) o sistema Bio-Rad ChemiDoc XRS + Imagen Gel (Bio-Rad, USA). Intensidad banda normalizada P62, TFEB, LC 3B relativa β-actina cuantificada densitometría software ImageJ grupos BPSi, datos media ± DE tres experimentos independientes.

Medición pH Celular PDMPO y pHrodo™ Red Transferrina Conjugado Microscopía Confocal

Estudio PDMPO

1×10⁵ células HepG-2 cultivadas placas confocales estériles overnight, NPs BPSi alimentadas concentración 100 μg/mL. Día siguiente, antes inmunofluorescencia, láminas lavadas 3 veces PBS 0.01 M pH 7.4, añadido 1 μM tinte PDMPO (Ex/Em = 329/440). Tras lavado PBS 3 veces, células incubadas medio fresco RPMI-1640 observadas microscopio fluorescencia (Nikon A1R, Japón) cámara CCD fotos dentro 5 min, razón intensidad fluorescencia azul/verde lisosomas calculada según procedimiento Chen et al. [19].

Estudio pHrodo™ Red Transferrina Conjugado

Células HepG-2 sembradas placas confocales misma forma adhesión 24 h, placas hielo 10 min. Lavadas células fría Solución Imagen Celular Viva 20 mM glucosa 1 % BSA. Añadido conjugado pHrodo™ Red Transferrina (Ex/Em = 560/585 nm) 25 μg/mL Solución Imagen Celular Viva incubar 37 °C 20 min, lavar células Solución Imagen Celular Viva. Observación también microscopía confocal. Análisis cuantitativo intensidad imágenes microscopía software ImageJ.

Detección pH Lisosomal Celular

Células A549, HepG-2, HCT8, HCT15, HCT116, B16 cultivadas frasco 75 cm² alimentadas NPs al 70 % confluencia, 6 h después células recolectadas. Células congeladas/descongeladas repetidamente liberar AM completamente. Lisados centrifugados 12000 r/min 10 min. Sobrenadante obtenido medido absorbancia 660 nm calcular cantidad total AM liberado. Absorbancia NPs₆.₀/₁₀₀ pH estándar comparada obtener valor pH cada célula.

Análisis Estadístico

Análisis estadístico SPSS15.0 usando ANOVA bidireccional grupos independientes y método Tukey HSD comparaciones múltiples. Significancia estadística valor P < 0.05.

Resultados y Discusión

Primero detectamos expresión génica diferencial células alimentadas NPs BPSi doblemente funcionalizadas PEG poroso negro sílice (BPSi NPs) (ofrecidas laboratorio colaborador [12]). Cambio potencial zeta −18.5 a +2.8 mV indicó PEGilación dual superficial exitosa (Fig. S1a). Diámetro medio NPs BPSi 156 nm (Fig. S1b). Basado mapa calor clúster expresión génica diferencial (Fig. S2), seleccionamos >2-veces expresiones diferenciales investigación adicional. GO y KEGG introducidos analizar genes diferenciales. Mapas burbuja enriquecimiento GO (Fig. 1a), genes metabólicos y asociados lisosoma incluyendo ensamblaje fagolisosoma, fagocitosis, proceso metabólico xenobiótico seleccionados análisis adicional. Notablemente, expresiones génicas asociadas TFEB-CLEAR [17] aumentaron significativamente. Resultados RT-PCR (Fig. 1b) verificaron resultados secuenciación génica, genes red TFEB-CLEAR (expresión lisosomal coordinada regulada) aumentaron significativamente: CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2, TPP1. Estos genes marcados vía lisosoma Fig. S3. Expresión mayor grupo control significancia estadística (P_BPSi VS Control < 0.05). TFEB regula positivamente expresión genes lisosomales, controla población lisosomas, promueve degradación celular sustratos lisosomales.

Autofagia activada células HepG-2 tras alimentar BPSi. a Mapa burbuja enriquecimiento GO genes diferenciales secuenciación transcriptoma. b Verificación cambios genes red TFEB-CLEAR tras BPSi RT-qPCR. c Expresión proteínas P62, TFEB, LC3B II/I tras BPSi. d Intensidad banda gris normalizada P62, TFEB, LC3B II/I grupos BPSi según control. Datos media ± DE.

Adicionalmente, TFEB regula autofagia, sobreexpresión conduce aumento significativo producción autofagosomas células cultivadas porque función principal gen TFEB inducir biosíntesis lisosoma y promover autofagia [20]. Western blot también empleado testificar si autofagia ocurrió células alimentadas NPs BPSi. Propósito Western confirmar expresión TFEB aumentada y ocurrencia autofagia celular tras alimentación BPSi. Proteínas LC3B y P62 marcadores autofagia. Cuando autofagia ocurre, expresión proteína cadena ligera 3B asociada microtúbulos 1A/1B (LC3B) II/I aumenta. p62 receptor vesículas degradadas autofagia y receptor agregados proteína ubiquitinada eliminados, expresión disminuye cuando autofagia ocurre. Medimos expresión estas proteínas Western.

Resultados Western blot Fig. 1c, d: TFEB (P_80 μg/ml VS control = 0.000008), LC3B II/I (P = 0.000297), p62 (P = 0.000016) proteínas todas significativamente upreguladas. Upregulación TFEB y LC3B II/I indicando activación autofagia [18], sospechamos endocitosis BPSi promueve autofagia. Sin embargo, proteína p62 se supone downregulada durante autofagia, por naturaleza proteína transportadora lleva endosomas lisosomas finalmente degradados. En nuestro estudio, upregulación significativa p62 indicó terminación degradación durante fusión endolisosoma [21], probablemente causada por aumento pH vesículas endolisosomales. Así, endocitosis BPSi puede inducir primero autofagia, luego inhibir proceso autofagia aumentando valores pH endolisosomas, debido alcalinidad amida.

Para testificar características aumento pH endolisosomas endocitosis BPSi, dos sondas fluorescentes pH comerciales empleadas: pHrodo™ Red Transferrina Conjugado (Thermo Fisher #P35376) y RatioWorks™ PDMPO.

pHrodo™ Red indicador pH intracelular comercial usualmente presenta fluorescencia débil pH neutro pero creciente fluorescencia pH baja. Supuesto cuantificar pH citosólico celular rango 9–4 pKa ~6.5 ex/em 560/585 nm. Obtuvimos conclusión cualitativa 6 líneas celulares: endocitosis NPs BPSi capaz aumentar valores pH endolisosomas, por debilitamiento señales fluorescencia roja (Fig. S4, S5). Sin embargo, repitiendo experimentos varias veces siguiendo protocolos producto, difícilmente analizamos cuantitativamente valor pH exacto disminuido entre líneas celulares antes/después alimentar NPs BPSi por no tener correlación establecida intensidad-valores pH.

PDMPO empleado mejor solución indicar cambios valor pH tras endocitosis BPSi, introduce técnicas imagen ratio medición cuantitativa pH. PDMPO [2-(4-piridil)-5-((4-(2-dimetilaminoetil-aminocarbamoil) metoxi) fenil) oxazol] caracterizado sonda pH dual-excitación/emisión acidotrópica. Emite fluorescencia verde intensa pH bajo y fluorescencia azul intensa pH alto. Esta fluorescencia pH-dependiente única hace PDMPO sonda pH ideal orgánulos ácidos pKa = 4.47. PDMPO etiqueta selectivamente orgánulos ácidos (lisosomas) células vivas y dos picos emisión distintos usados monitorizar fluctuaciones pH células vivas mediciones ratio. Sin embargo, aún fallamos midiendo valores pH 6 líneas celulares antes/después alimentación BPSi. Resultados Fig. S6: no diferencias significativas observadas 6 líneas celulares antes/después BPSi. Aunque correlación establecida razón Azul/Verde vs valores pH (Fig. S7), correlación no lineal pH 4–5 hace método PDMPO fallar análisis cuantitativo endolisosomas antes/después alimentación BPSi.

Datos dos indicadores pH comerciales arriba, primero demostramos sospecha: NPs decoradas PEG con amida en cadena PEG pueden aumentar pH endolisosoma por naturaleza alcalina amida. Sin análisis cuantitativo cambios precisos pH (rango 0.1 pH), no podemos establecer correlaciones entre estado autofagia y valores pH endolisosoma, fallando predicción autofagia.

Basado estudio previo NPs autodescomponibles [13,14][15,22], mantuvimos misma concentración hidróxido amonio 75 % etanol, ajustamos concentraciones AM y TEOS. Dos series cantidad TEOS 100 μL y 80 μL para obtener diferente espesor capa y tamaño poro. Diez series cantidad AM para obtener diferentes tamaños estructura hueca central y eficacias carga AM.

Cantidades AM y TEOS protocolos descritas Tabla 1.

Fig. 2a, b: tamaño NPs aumentó con aumento cantidad AM, ambas concentraciones TEOS (100 μL y 80 μL). Misma concentración AM, tamaño partícula aumentó con aumento TEOS. Además, aumento TEOS creció espesor capa, probado mapeo elemental (Fig. 2c). Índice polidispersidad (PDI) y carga superficial NPs Fig. S8 y Tabla S1. Estudios morfología predijeron: aumento cantidad AM, eficiencia carga crece, perfil liberación más rápido; aumento TEOS, liberación se ralentiza. Necesitamos encontrar concentraciones AM y TEOS apropiadas para obtener sistemas NPs optimizados, que liberación AM linealmente correlacionada con cambios pH.

Caracterización morfológica 10 NPs autodescomponibles diferentes con cantidades específicas AM o TEOS. a Figuras STEM. b Análisis distribución tamaño NPs. c Mapeo Si 10 NPs autodescomponibles. Barras escala 100 nm. Análisis distribución tamaño 100 NPs aleatorias figuras STEM medido ImageJ. Datos media ± DE.

Eficiencia carga AM determinada UV-Vis. Curva estándar (Fig. S9) AM trazada concentraciones serie AM (6.25–46.88 μg/mL), ecuación y = 67.63x + 0.10919, R² = 0.9987. Calculado ecuación arriba, eficiencia carga AM 10 NPs autodescomponibles parámetros específicos, datos Fig. S10.

Antes estudio perfiles liberación AM diferentes soluciones pH, perfiles liberación agua pura estudiados. Fig. S11, S12: todas NPs cantidad TEOS 80 μL presentaron liberación AM aumentada con duración, reflejada absorción UV-Vis. Además, aumento cantidad AM encapsulada, tendencia crecimiento liberación AM más significativa. Velocidad liberación crece más rápido. Sin embargo, TEOS 100 μL, superficie partícula más densa, liberación más lenta cuando AM < 3.0 mg; casi no tendencia aumento liberación AM agua 14 días. Cuando AM > 4.0 mg, tendencia aumento obvia liberación AM observada. Parámetros NPs₇.₅/₈₀ y NPs₆.₀/₁₀₀ presentaron crecimiento sólido prolongando tiempo, casi aumento lineal primeros 7 días, luego meseta.

Luego, nos centramos comportamiento liberación AM diferentes buffers pH averiguar si NPs autodescomponibles parámetros específicos liberación AM lineal dependiente pH.

Primero, experimentos liberación AM pH 4.0 buffer. Fig. S13: misma cantidad TEOS 100 μL, velocidad liberación AM tendencia similar observada 5 sistemas NPs TEOS 80 μL (Fig. S14), correlación positiva central cantidad AM encapsulada.

AM concentrado difunde solución circundante vía difusión por diferencia concentración. Mayor gradiente concentración = liberación AM más rápida. Comparado liberación AM agua pura, ambiente ácido aceleró liberación AM (Fig. S13, S14 vs Fig. S11, S12), indicando liberación AM no solo impulsada difusión; en soluciones ácidas, repulsión electrostática también fuerza impulsora importante por naturaleza carga positiva AM. Calculamos porcentaje liberación cada parámetro NPs según eficiencia carga AM, curva estándar AM, ratio dilución mediciones. Porcentaje liberación reflejó velocidad liberación AM solución ácida pH 4.0, resultados (Fig. 3) mostraron solo porcentaje liberación NPs₇.₅/₈₀ presentó liberación lineal pH 4.0. Otros sistemas NPs parámetros específicos AM/TEOS mostraron tendencias liberación similares, porcentaje liberación no crecimiento lineal. Excepción NPs₆/₁₀₀, liberación AM alcanzó meseta solo 72 h; difícil saber si liberación AM crecería lineal antes esa duración.

Porcentaje liberación AM 10 series NPs autodescomponibles tras duración específica buffer pH 4.0. Experimentos triplicados, datos media ± DE.

Mientras, probamos perfiles liberación AM buffers cuasi-neutro y alcalino (pH 6.86 y 9.18). Resultados Fig. S15, S16, S17, S18: liberación AM se ralentizó aumento pH 6.86; además, aumento concentración AM central, porcentaje liberación AM disminuyó. pH 9.18, todas NPs 10 parámetros presentaron liberación AM muy lenta (Fig. S19, S20); tendencia similar pH 6.86 pero porcentaje liberación aún menor. Quedó claro NPs autodescomponibles solo presentan crecimiento lineal liberación AM soluciones ácidas. Recordamos pH endolisosomas 4–5, exactamente rango pH crecimiento lineal AM función tiempo parámetro AM/TEOS específico. Así, más confianza sistema NPs autodescomponibles herramienta medición precisa cuantitativa determinando pH promedio endolisosoma, proveyendo evidencia valor pH exacto estado autofagia.

Precondición usar NPs autodescomponibles específicas indicador pH endolisosoma: NPs estables endolisosoma durante todo proceso medición. Segundo, liberación AM endolisosoma ocurra suavemente cuando medición realizada.

Colocalización NPs endolisosomas estudio TEM celular y liberación AM 6 líneas celulares estudiadas. Resultados TEM celular: todas 10 series NPs permanecieron endolisosomas sin escapar, tras 24 h incubación células HepG-2 (Fig. 4). Diámetro células HepG2 ~10–20 μm, diámetro NPs AM@SiO₂ 75–200 nm, difícil clarificar morfologías NPs imágenes bajo aumento (Fig. S21). Investigamos localización intracelular NPs otras 5 líneas celulares, 4 NPs seleccionadas aleatoriamente demostraron NPs atrapadas endolisosomas (Fig. S22). NPs todos parámetros mostraron estructura hueca central todas otras 5 líneas celulares tras 24 h incubación, indicando liberación AM. Observación más precisa: liberación AM puede ser diferente debido diferentes tamaños hueco, indicando (1) pH endolisosoma diferente células distintas y (2) liberación AM NPs muy sensible pH endolisosomas, especialmente NPs₆/₁₀₀ y NPs₇.₅/₈₀. Fig. S23: NPs ya endocitosis permanecieron vesículas 2 h tras alimentación NPs, luego NPs acumularon gradualmente lisosomas.

Colocalización NPs endolisosomas estudio TEM celular tras 12 y 24 h incubación 10 series NPs. Barra escala 200 nm imágenes TEM.

Evaluamos correlación valores pH y valores DO pH 4.0–4.8. Resultados Fig. 5 y Fig. S24: sistemas NPs NPs₆/₁₀₀ y NPs₇.₅/₈₀, liberación AM presentó disminución lineal función pH rango 4.0–4.8.

Liberación AM función valores pH NPs₆/₁₀₀ y NPs₇.₅/₈₀ tras duración incubación específica 6 h, 12 h, 24 h. Ecuaciones correlación lineal calculadas 6 h y 12 h liberación AM ambos NPs₆/₁₀₀ y NPs₇.₅/₈₀ función valores pH. Experimentos triplicados, datos media ± DE.

Convertimos valor DO porcentaje liberación AM según eficiencia carga y cantidad alimentación. Fig. S25: primeras 6 h, porcentaje liberación AM NPs₆/₁₀₀ y NPs₇.₅/₈₀ también presentado función valores pH. Calculamos suma cuadrados residuales y coeficiente Pearson relacionado 6 h y 12 h liberación, respectivamente, suma cuadrados residuales correlación negativa cercanía ajuste lineal, mientras valor absoluto coeficiente Pearson cercano 1 más lineal. Tabla S2, S3: mayor linealidad ajuste NPs₆.₀/₁₀₀, seguido NPs₇.₅/₈₀ a 6 h liberación.

Entonces, emocionados resultados: método monitorear precisamente valores pH establecido, especialmente precisión ≤0.1 intervalo pH. Grandes posibilidades averiguar correlación valores pH endolisosoma y estado autofagia, gran significado estudiar mecanismo autofagia y predecir proceso. Fig. S26: liberación AM células HepG-2 ya meseta tras incubación 4 h. Elegimos 6 h punto observación.

Investigamos cuidadosamente liberación AM NPs₆.₀/₁₀₀ 6 líneas celulares duración interacción NPs-célula 6 h: cáncer hígado HepG-2, cáncer colon HCT8, HCT15, HCT116, cáncer pulmón A549, cáncer miomelanocítico B16.

Tabla 2: diferenciamos claramente endolisosomas 6 líneas cáncer, precisión 0.01 valores pH, imposible kits indicadores pH intraoculares comerciales.

Re-evaluamos valores pH endolisosomas células HepG2 antes/después cultivo NPs BPSi. Conclusión: captación BPSi aumenta significativamente pH endolisosomas, de 4.70 ± 0.09 a 5.59 ± 0.05, ilustrando perfectamente razón BPSi indujo autofagia inicialmente luego terminó flujo autofagia. Captación intracelular BPSi aumenta cantidad endolisosomas, consistente resultados secuenciación génica: genes autofagia (TFEB-CLEAR) activados. Terminación autofagia por aumento pH endolisosomas coincide upregulación proteínas p62 Western blot.

Discusión

NPs generalmente causan autofagia células [23], estudios muestran respuesta autofágica NPs superficie neutra/aniónica implica clearance mejorado carga autofágica. Exposición células NPs superficie catiónica resulta upregulación transcripcional vía TFEB, pero también disfunción lisosomal, bloqueando flujo autofágico [7]. Nuestros resultados consistentes conclusiones previas. Encontramos expresión genes y proteínas autofagia células HepG2 aumentada tras alimentación NPs BPSi mediante secuenciación transcriptoma, RT-qPCR, Western. Sin embargo, nivel expresión proteína P62 autofagia no disminuye al activarse autofagia. Sospechamos PEG-amina superficie NPs BPSi eleva pH lisosoma, inhibiendo degradación P62. Indicadores pH lisosomales existentes no verifican conjetura. Medir precisamente pH lisosomal células vivas, establecimos nuevo método determinación cualitativa pH endolisosomas basado sistemas NPs autodescomponibles. 10 sistemas NPs parámetros AM/TEOS específicos empleados obtener método medición optimizado sensible pH. Gradiente concentración radial AM interior-exterior fuerza impulsora principal liberación AM. Liberación fármaco procedió simultánea descomposición portador, mecanismo controlado difusión. Además, al disminuir pH, concentración ion H⁺ aumenta, interacción electrostática mejorada promueve AM interior liberar más rápido solución neutra [24]. Sistema NPs hueco central optimizado libera AM central concentrado función lineal valores pH precisos rango pH 4.0–4.8, exactamente pH lisosomas. Finalmente, indicador pH cualitativo basado NPs autodescomponibles, logramos detección valores promedio pH lisosomas 6 líneas celulares. Además, sistema diferenciamos cualitativamente cambios pH lisosomas antes/después endocitosis NPs BPSi células HepG-2, clarificando mecanismo ocurrencia y terminación autofagia tras endocitosis BPSi. Sistemas NPs autodescomponibles abren nueva vía estudio valores pH luminal, nuevas herramientas conocer mejor señalización celular y metabolismo, nuevas vías métodos tratamiento cáncer [25, 26].

Conclusión

En este estudio, hallamos BPSi promueve autofagia celular secuenciación transcriptoma, pero grupos amino superficie NPs aumentan pH lisosoma inhibiendo degradación flujo autofágico. Así, pH lisosoma influye significativamente etapas autofagia. Adquirir precisamente información pH lisosoma promoverá percepción autofagia. Sin embargo, indicadores fluorescentes pH lisosomales existentes solo determinan rango amplio pH lisosomal; así, establecimos indicador preciso pH lisosomal basado sistema auto-disolución. Ajustando parámetros síntesis AM@SiO₂, liberación AM cargada NPs correlacionada lineal y negativamente con pH. NPs permanecen principalmente lisosoma tras entrar célula. Midiendo cantidad AM liberada células, valor pH lisosoma calculado exactamente según función lineal. Indicador preciso pH establecido proporcionó nueva herramienta y metodología estudiar precisamente valores pH lisosomal y adquirir más información autofagia.

Disponibilidad Datos y Materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio incluidos en artículo publicado y archivos información suplementaria.

Abreviaturas

BPSi:

Silicio mesoporoso negro

SFB:

Suero fetal bovino

GO:

Ontología génica

HCl:

Ácido clorhídrico

KEGG:

Enciclopedia Kyoto Genes y Genomas

AM:

Azul metileno

NaBr:

Bromuro sodio

NaSi:

Silicida sódica

NH₄Br:

Bromuro amonio

NPs:

Nanopartículas

DO:

Densidad óptica

PBS:

Salino fosfato amortiguado

PDMPO:

2-(4-Piridil)-5-((4-(2-dimetilaminoetil-aminocarbamoil) metoxi) fenil) oxazol

RT-qPCR:

Reacción en cadena polimerasa transcripción reversa cuantitativa

TEOS:

Ortosilicato tetraetilo