El miR-326 exosomal de macrófagos M1 suprime la progresión del carcinoma hepatocelular modulando la señalización NF-κB

Resumen

Evidencia acumulada muestra que microARN (miR) derivados de exosomas de macrófagos M1 pueden regular la progresión del carcinoma hepatocelular (CHC). Sin embargo, el efecto del miR-326 derivado de exosomas de macrófagos M1 sobre el CHC no se había reportado. El objetivo fue explorar el mecanismo del miR-326 exosomal de macrófagos M1 en la regulación de la progresión de células de CHC. RT-qPCR detectó expresión de miR-326 en líneas celulares de CHC. La expresión de miR-326 en CHC se alteró por transfección, evaluando su efecto en expresión de CD206 y NF-κB, proliferación, formación de colonias, migración, apoptosis e invasión. Posteriormente, se aislaron exosomas de macrófagos M1. RT-qPCR identificó expresión de miR-326 en exosomas derivados de M1. La expresión de miR-326 en exosomas M1 se modificó por transfección. Exosomas derivados de M1 se co-cultivaron con células de CHC para determinar sus efectos en la progresión biológica. Finalmente, experimentos in vivo verificaron los resultados in vitro. El miR-326 estaba disminuido en células de CHC y enriquecido en exosomas derivados de macrófagos M1. La sobreexpresión de miR-326 inhibió proliferación, formación de colonias, migración, invasión, y expresión de CD206 y NF-κB, y promovió apoptosis, inhibiendo el crecimiento de tumores CHC in vivo; la down-regulación mostró efectos opuestos. Los exosomas derivados de M1 inhibieron proliferación, formación de colonias, migración, invasión, y expresión de CD206 y NF-κB, y aumentaron apoptosis; la sobreexpresión de miR-326 potenció el efecto de los exosomas M1 sobre células de CHC. Se revela que el miR-326 exosomal derivado de macrófagos M1 suprime proliferación, migración e invasión y promueve apoptosis de CHC mediante down-regulación de la expresión de NF-κB.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más común globalmente y el cáncer primario de hígado más frecuente. Según el Registro Nacional de Cáncer de China, la mortalidad por cáncer primario de hígado ocupa el tercer lugar, mientras que la incidencia es la cuarta entre malignidades comunes. Los principales factores de riesgo son infección crónica por virus de hepatitis C y B, alimentos contaminados con aflatoxinas, obesidad, tabaquismo, consumo excesivo de alcohol y diabetes tipo 2. La quimioembolización transarterial es tratamiento establecido para CHC en etapa intermedia, mejorando supervivencia en la mayoría de pacientes en etapas intermedias o avanzadas. El diagnóstico depende principalmente de biomarcadores séricos e imágenes. La supervivencia a 5 años es solo ~60% y la incidencia aumenta anualmente. Por tanto, investigar dianas terapéuticas precisas es prioritario.

Los macrófagos son células efectoras y reguladores principales del sistema inmune, con funciones en remodelación y reparación tisular, y funciones metabólicas en casi todos los tejidos. Se ha revelado que macrófagos M1 ejercen efectos promotores de tumor y aumentan la motilidad de células de CHC. Los exosomas son vesículas discoidales de 40–150 nm. Según Xu et al., microARNs exosomales (miARNs) afectan proliferación, invasividad, metástasis y resistencia a fármacos de CHC modulando expresión génica en células diana. Un estudio demostró que exosomas con miR-326 podrían ser diana clínica en esclerosis múltiple. Los miARNs pueden actuar como oncogenes o supresores tumorales modulando numerosos genes codificantes de proteínas mediante degradación de ARNm y bloqueo de traducción. Un estudio discutió que miR-326 suprime crecimiento de células CHC alterando progresión del ciclo celular y aumentando apoptosis, además suprime invasión disminuyendo fenotipo de transición epitelio-mesénquima. Otro reportó que miR-326 podría ser diana terapéutica para pacientes con CHC. Por ello, este estudio discute el mecanismo del miR-326 exosomal regulando invasión y migración de células CHC.

Materiales y métodos

Declaración ética

Todos los experimentos con animales cumplieron la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio por Comités Internacionales. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Tercer Hospital de la Universidad de Jilin.

Inducción e identificación de macrófagos

La línea celular monocítica humana THP-1 (Instituto de Zoología de Kunming, CAS, Kunming, China) se cultivó en medio RPMI 1640 (Gibco, CA, USA; Thermo Fisher Scientific, MA, USA) con 10% suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor. Células THP-1 se trataron con 150 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA; P8139, Sigma-Aldrich, SF, CA, USA) e incubaron en medio RPMI 24 h para obtener macrófagos M0. La morfología antes y después de inducción se observó por tinción de Wright. Células THP-1 y macrófagos inducidos se resuspendieron en 5 μL PBS, se depositaron en portaobjetos, se tiñeron con solución de tinte de Wright y se mezclaron con solución tampón 1:2. Tras teñir 10 min y enjuagar con agua corriente, se observaron al microscopio. Además, marcadores M0 (CD68 y CD206) se midieron por RT-qPCR. Luego, macrófagos se indujeron a M1 mediante incubación con 20 ng/mL Interferón (IFN)-γ (#285-IF; R&D Systems, MN, USA) y 10 pg/mL LPS (#8630; Sigma-Aldrich) 18 h. Marcadores M1 (IDO1 e IL-12 p35) se examinaron por RT-qPCR.

Extracción de exosomas

Los exosomas se extrajeron con kit de separación de exosomas (ExoEasy Maxi Kit, Qiagen, Hilden, Alemania). Surnadante de macrófagos se recogió en tubo de centrifugación de 15 mL en condiciones asépticas y filtró por película de 0.8 μm. Surnadante celular de cada grupo se mezcló con tampón XBP (1:1) y centrifugó con columna de afinidad de membrana exoEasy a 500 g. Células se suplementaron con 10 mL tampón XWP y centrifugaron a 3000–5000 g. La columna se incubó con 400 μL tampón de elución XE y centrifugó a 500 g. El tampón de elución se transfirió a la columna y centrifugó a 500 g. El tampón se almacenó 24 h a 4 °C y luego se usó para identificación. El resto se guardó a −80 °C.

Observación por TEM y análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)

Los exosomas obtenidos se depositaron en malla de cobre con membrana de carbono y se añadió ácido fosfotúngstico 2%. La muestra se observó bajo TEM y se recogió la imagen óptima. Impurezas y partículas en PBS se eliminaron con filtro microporoso de 0.22 μm. Según densidad de partículas de exosomas, PBS filtrado se diluyó a concentración apropiada y detectó usando detector de nanopartículas Nanosight NS300 (Malvern, Westborough, MA, USA). Tras identificación, exosomas derivados de macrófagos transfectados con inhibidor de miR-326 y control negativo (NC) de inhibidor, mimético de miR-326 y NC de mimético, se extrajeron con kit de separación de exosomas (Invitrogen).

RT-qPCR

ARN total se extrajo con Reactivo Trizol (Thermo Fisher), y PCR en tiempo real se realizó usando SYBR-Green PCR Master Mix (Roche) y sistema ABI 7500 Real-Time PCR (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Las secuencias de cebadores se muestran en Tabla 1. El análisis cuantitativo usó el método 2^(−ΔΔCt).

Análisis Western Blot

Proteína total de células y exosomas se extrajo. Concentración se determinó por kit BCA (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, China). Proteína se mezcló con tampón de muestra y hirvió a 95 °C, cargando 30 µg por pozo. Separación por electroforesis en gel de poliacrilamida 10% (Boster) y transferencia a membrana PVDF, seguida de bloqueo en 5% albúmina sérica bovina (BSA). Membrana se incubó con anticuerpos primarios anti-CD63 (1:1000, Developmental Studies Hybridoma Bank, Universidad de Iowa, Ames, IA, USA), CD181 (1:1000, R&D Systems), GAPDH (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, USA) y anticuerpos secundarios (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories) marcados con peroxidasa de rábano. Imágenes se obtuvieron por sistema de escaneo de fluorescencia infrarroja de doble color Odyssey, y valores de gris de bandas se midieron con software Quantity One.

Cultivo y cribado celular

Línea celular hepática normal HL-7702 y líneas de CHC BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 y QGY-7703 se cultivaron en medio Gibco RPMI 1640 con 10% SFB, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 mg/mL). Expresión de miR-326 se detectó por RT-qPCR y se cribaron líneas adecuadas.

Marcado y captación de exosomas

Exosomas se resuspendieron en 250 μL Diluente C y trituraron suavemente. Tinte PKH67 (1 μL, Sigma-Aldrich) se añadió a 250 μL Diluente C para alcanzar 500 μL e incubó. Solución se mezcló con 500 μL 1% BSA e incubó 37 °C 1 min. Exosomas se obtuvieron por centrifugación 120,000 g 4 °C 2 h. Exosomas marcados con PKH67 se obtuvieron por centrifugación 120,000 g 4 °C 2 h. Exosomas se resuspendieron en 6 mL medio RPMI-1640 evitando luz. Exosomas marcados se co-cultivaron con células CHC 12 h. Medio se retiró y lavó con PBS 3 veces, 5 min/cada, eliminando exosomas fluorescentes no internalizados. Exosomas se fijaron con 4% paraformaldehído y tiñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Tras sellado, distribución de fluorescencia se observó por microscopio confocal láser.

Agrupamiento y tratamiento celular

Células HepG2 y SMMC-7721 se sembraron en placa de 12 pocillos a 0.5–1 × 10⁶ células/pocillo. Con 50–60% confluencia, se transfirieron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). HepG2 se distribuyeron en grupo miR-326-mimético (transfectado con mimético miR-326) y NC-mimético (transfectado con NC mimético). SMMC-7721 en grupo miR-326-inhibidor (transfectado con inhibidor miR-326) y NC-inhibidor (transfectado con NC inhibidor). Mimético, inhibidor y sus NCs se mezclaron con Lipofectamine 2000 para transfección. Células sin tratamiento fueron grupo control. Mimético, inhibidor y NCs fueron diseñados por Guangzhou RibBio Co., Ltd. (Guangzhou, China) (Tabla 1).

Co-cultivo de exosomas derivados de macrófagos M1 con células CHC

Concentración de proteína de suspensión de exosomas derivados de M1 se detectó por método BCA, calculando volumen correspondiente con 50 μg proteína. Células HepG2 y SMMC-7721 se sembraron en placa de 12 pocillos a 1 × 10⁵ células/mL por pocillo. HepG2 en 4 grupos: control (sin co-cultivo con exosomas), Exo (co-cultivo con exosomas derivados de M1), Exo-miR-326-mimético (co-cultivo con exosomas M1 transfectados con mimético miR-326), Exo-NC-mimético (co-cultivo con exosomas M1 transfectados con NC mimético). SMMC-7721 en 4 grupos: control, Exo, Exo-miR-326-inhibidor (co-cultivo con exosomas M1 transfectados con inhibidor miR-326), Exo-NC-inhibidor (co-cultivo con exosomas M1 transfectados con NC inhibidor).

Ensayo MTT

Células se desprendieron con tripsina y sembraron en placa de 96 pocillos a densidad 4 × 10⁴ células/pocillo. Medio se descartó tras cultivar 12, 24, 36, 48, 60 h. Incubadas con 500 μL solución MTT 0.5 g/L, se añadió 200 μL DMSO, trituró e incubó. Densidad óptica (DO, 490 nm) se midió con lector de microplacas.

Ensayo de formación de colonias

Cultivadas 24 h y desprendidas con tripsina, células se sembraron en plato de 35 mm con 300 células/plato. Solución se cambió cada 3 días. Tras 10 días, células se fijaron con paraformaldehído 40 g/L⁻¹ y tiñeron con violeta de cristal 1 g/L⁻¹ y secaron. Número de colonias (>50 células) se contó al microscopio.

Ensayo Transwell

Células (1 × 10⁵) se suspendieron en 200 μL medio sin suero. Experimentos siguieron instrucciones de cámara Transwell (Corning Glass Works, Corning, NY, USA) (matrigel necesario para invasión, no para migración). RPMI 1640 (10% SFB, 600 μL) se añadió a cámara inferior. Cámaras separadas por membrana Transwell pre-recubierta con matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Cultivo 24 h, cámara se fijó con alcohol 95%. Tras tinción con violeta de cristal, células se observaron en cinco campos visuales al microscopio.

Citometría de flujo

Ciclo celular: células desprendidas por tripsina. Células (1 × 10⁶) suspendidas en 0.5 mL PBS y trituradas a suspensión única. Mezcladas con 4.5 mL etanol 70% pre-enfriado en hielo, centrifugadas 3000 g, enjuagadas con 5 mL PBS y centrifugadas 3000 g. Seguidas, suspendidas en 1 mL solución tinción PI/Triton X-100 (20 μg PI/0.1% Triton X-100) con 0.2 mg RNasa A. Ciclo celular detectado por citometría de flujo.

Apoptosis: Células tripsinizadas (1 × 10⁶) suspendidas en 1 mL PBS, trituradas y centrifugadas 3000 g. Enjuagadas con tampón incubación (10 mmol/L Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl₂) y centrifugadas 3000 g. Incubadas con 100 μL solución marcaje (FITC-Annexin V y PI añadidos a tampón incubación para alcanzar 1 μg/mL), centrifugadas 3000 g, lavadas una vez con tampón incubación e incubadas con solución fluorescente (SA-FLOUS). Apoptosis detectada por citometría de flujo. Longitud de onda 488 nm, fluorescencia FITC detectada por filtro de banda 515 nm, PI con longitud >560 nm. Resultados analizados automáticamente por computadora.

Xenotrasplante tumoral en ratones nude

Cuarenta ratones (Facultad de Ciencia Animal, Universidad de Jilin, Jilin, China) de 4–6 semanas se distribuyeron aleatoriamente en 8 grupos, 5 ratones/grupo. Ratones se mantuvieron en laboratorio SPF 1 semana, renovando alimento, cama y agua. Estado de salud se observó diariamente. Una semana después, células CHC se prepararon en suspensión e inyectaron subcutáneamente en cuello y espalda a 0.1 mL (1 × 10⁶ células). Crecimiento tumoral se observó tras 3–5 días. Ratones se pesaron cada 4 días y se midió volumen tumoral. Ratones se eutanasia 20 días post-inyección.

Análisis estadístico

Datos interpretados por SPSS 17.0 (SPSS Statistics, Chicago, IL, USA). Datos de medida como media ± desviación estándar. Comparaciones entre dos grupos por t-test; entre múltiples grupos por ANOVA unidireccional. P < 0.05 indicó diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

Identificación de macrófagos M1 y exosomas

Tinción de Wright observó morfología de células THP-1 inducidas por PMA. Volumen de THP-1 antes de inducción era pequeño con mayor proporción carioplasma; tras inducción, morfología irregular, volumen mayor, proporción carioplasma menor; citoplasma más rico, azul claro, con abundantes partículas y algunas vacuolas; núcleo rojo púrpura, a menudo inclinado, mostrando características morfológicas típicas de macrófagos (Fig. 1a).

Para verificar inducción exitosa, expresión CD68 y CD206 antes y después se probó por RT-qPCR. CD68 y CD206 se elevaron tras inducción PMA, indicando inducción exitosa a M0 (Fig. 1b). Luego, M0 se polarizaron a M1 por LPS e IFN-γ. Morfología y marcadores superficiales M1 (IDO1 e IL-12 p35) se observaron y probaron. M0 mostraron morfologías adherentes variadas e irregulares (redondas, elípticas, fusiformes). Morfología de macrófagos estimulados por IFN-γ mostró más pseudópodos y protrusiones, forma fusiforme (Fig. 1c). RT-qPCR (Fig. 1d) mostró aumento de marcadores M1 (IDO1 e IL-12p35) tras tratamiento LPS e IFN-γ.

Exosomas derivados de macrófagos se observaron por TEM. Eran abundantes, redondos u ovalados, con estructura membranosa, tamaño uniforme y pocos contaminantes (Fig. 1e). NTA mostró pico centralizado de curva MODE y línea suave, indicando diámetro concentrado y menos impurezas (Fig. 1f). Western blot mostró que frente a macrófagos, proteínas marcadoras específicas CD63 y CD181 aumentaron en exosomas derivados de macrófagos (Fig. 1g). Resultados indican inducción exitosa de monocitos a macrófagos y polarización a M1.

Exosomas derivados de macrófagos M1 entregan miR-326 a células CHC y afectan su expresión

Para verificar si exosomas de M1 transportan miR-326 a células CHC, HepG2 y SMMC-7721 se co-cultivaron con exosomas. Gran número de exosomas fueron asimilados por HepG2 y SMMC-7721 a las 4 h bajo microscopio de fluorescencia (Fig. 2a, b).

Luego, miR-326-mimético/inhibidor se transfirió a macrófagos y se verificó expresión miR-326 en sus exosomas antes y después. Frente a exosomas de M0, expresión miR-326 aumentó en exosomas derivados de M1. Expresión elevada en exosomas M1 con tratamiento mimético miR-326. Expresión reducida en exosomas M1 con tratamiento inhibidor miR-326 (Fig. 2c).

Expresión miR-326 en líneas CHC se probó. Disminuida en BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703 vs HL-7702; HepG2 con menor expresión, SMMC-7721 con mayor (Fig. 2d).

Mimético miR-326 e inhibidor se transfirieron a HepG2 y SMMC-7721 respectivamente, examinando efectos. Mimético elevó miR-326 en HepG2; inhibidor redujo en SMMC-7721 (Fig. 2e, f).

Exosomas de M1 transfectados con mimético e inhibidor miR-326 se co-cultivaron con HepG2 y SMMC-7721. Co-cultivo con exosomas aumentó miR-326 en células CHC; exosomas M1 con mimético elevaron más miR-326 en HepG2; exosomas M1 con inhibidor degradaron miR-326 en SMMC-7721 (Fig. 2g, h). Sugiere que exosomas M1 entregan miR-326 a células CHC afectando su expresión.

miR-326 exosomal de M1 reduce proliferación y formación de colonias en células CHC

Explorando efecto del miR-326 exosomal en proliferación, se realizaron ensayos MTT y formación de colonias. En HepG2, restauración miR-326 deterioró proliferación y capacidad de formación de colonias (Fig. 3a, e, f). Exosomas M1 obstaculizaron proliferación y formación de colonias en HepG2. Exosomas M1 con mimético miR-326 deterioraron más proliferación y formación de colonias (Fig. 3c, i, j).

En SMMC-7721, knockdown miR-326 aumentó proliferación y formación de colonias (Fig. 3b, g, h). Tratadas con exosomas M1, proliferación y formación de colonias disminuyeron. Exosomas M1 con inhibidor miR-326 fomentaron más proliferación y formación de colonias (Fig. 3d, k, l). Indica que miR-326 de exosomas M1 impede proliferación de células CHC.

miR-326 exosomal de M1 suprime migración e invasión de células CHC

Se examinó efecto del miR-326 exosomal en invasión y migración. En HepG2, restauración miR-326 restringió invasión y migración (Fig. 4a–c). Exosomas M1 perturbaron invasión y migración en HepG2. Invasión y migración disminuyeron más al co-cultivar con exosomas M1 transfectados con mimético miR-326 (Fig. 4g–i).

Knockdown miR-326 resultó en aumentos en invasión y migración de SMMC-7721 (Fig. 4d–f). Tratadas con exosomas M1, SMMC-7721 mostraron disminución de invasión y migración. Sin embargo, co-cultivo con exosomas M1 transfectados con inhibidor miR-326 aumentó invasión y migración (Fig. 4j–l). Implica que miR-326 de exosomas M1 impede invasión y migración de células CHC.

miR-326 exosomal de M1 promueve apoptosis de células CHC

Examinando efecto en ciclo celular y apoptosis, se aplicaron tinción simple PI y doble Annexin V-FITC/PI. En HepG2, sobreexpresión miR-326 aumentó células en fase G0/G1, redujo en S y G2/M, y aumentó apoptosis (Fig. 5a–d). Co-cultivo con exosomas M1 aumentó G0/G1, redujo S y G2/M, aumentó apoptosis. Co-cultivo con exosomas M1 transfectados con mimético miR-326 potenció estos efectos (Fig. 5i–l).

En SMMC-7721, down-regulación miR-326 redujo G0/G1, elevó S y G2/M, disminuyó apoptosis (Fig. 5e–h). Exosomas M1 sin transfectar aumentaron G0/G1, redujeron S y G2/M, aumentaron apoptosis. Exosomas M1 con inhibidor miR-326 degradaron G0/G1, elevaron S y G2/M, disminuyeron apoptosis (Fig. 5m–p). En resumen, miR-326 de exosomas M1 arresta ciclo en G0/G1 e induce apoptosis en CHC.

miR-326 exosomal de M1 disminuye expresión CD206 y NF-κB en células CHC

Se exploró mecanismo potencial del miR-326 de exosomas M1 en progresión biológica de CHC. NF-κB es eslabón clave entre inflamación y cáncer. Muchas proteínas reguladoras y miARNs inhiben NF-κB excesivamente activado para suprimir cáncer. Este efecto puede incluir polarización de macrófagos M2 a M1. Expresión CD206 y NF-κB en HepG2 y SMMC-7721 se probó por RT-qPCR. Restauración miR-326 disminuyó CD206 y NF-κB en HepG2; knockdown aumentó ambos en SMMC-7721 (Fig. 6a, b). Co-cultivo con exosomas M1 redujo significativamente CD206 y NF-κB en HepG2; exosomas M1 sobreexpresando miR-326 disminuyeron más. Tratadas con exosomas M1 sin transfectar, CD206 y NF-κB disminuyeron en SMMC-7721. Co-cultivo con exosomas M1 transfectados con inhibidor miR-326 aumentaron CD206 y NF-κB en SMMC-7721 (Fig. 6c, d). Concluye que miR-326 de exosomas M1 actúa como supresor tumoral inhibiendo NF-κB en células CHC.

miR-326 de exosomas de macrófagos M1 inhibe crecimiento tumoral CHC in vivo

Resultados in vivo validados mediante xenotrasplantes. Sobreexpresión miR-326 disminuyó volumen y peso tumoral en HepG2 (Fig. 7a–c). En ratones trasplantados con HepG2 co-cultivados con exosomas, tratamiento con exosomas M1 redujo significativamente volumen y peso tumoral; exosomas M1 sobreexpresando miR-326 redujeron más (Fig. 7g–i).

En SMMC-7721, supresión miR-326 aumentó volumen y peso tumoral (Fig. 7d–f). Exosomas M1 sin transfectar obstaculizaron crecimiento tumoral en volumen y peso. Co-cultivo con exosomas M1 transfectados con inhibidor miR-326 causó elevaciones en volumen y peso tumoral (Fig. 7j–l). En resumen, miR-326 de exosomas M1 deprime crecimiento tumoral CHC in vivo.

Discusión

CHC es cáncer común con alta morbilidad y mortalidad, diagnóstico y tratamiento temprano difíciles, mal pronóstico y supervivencia a 5 años. Recientemente, estudio destacó que lncRNA cox-2 de baja expresión disminuye capacidad de macrófagos M1 para suprimir crecimiento, invasividad, angiogénesis, migración de células CHC y promover apoptosis. Hu et al. discutieron que miR-326 está obviamente degradado en tejidos y líneas CHC, y down-regulación conecta con estadio TNM, metástasis ganglionar y diferenciación de pacientes CHC. Se considera que exosomas derivados de células CHC forman ambiente fértil facilitando crecimiento, invasividad, metástasis y resistencia a fármacos. Estudio actual diseñado para explorar mecanismo del miR-326 exosomal regulando invasión y migración de células CHC.

Resultados indicaron expresión miR-326 disminuida en células CHC pero aumentada en exosomas. Estudios recientes señalan expresión miR-326 declinada en tejidos CHC. Otro presenta expresión miR-326 notablemente reducida en líneas y tejidos CHC, prediciendo mal pronóstico. Se reporta que miR-326 actúa como supresor tumoral y está grandemente deprimido en células CHC. Todas estas evidencias concuerdan con nuestros hallazgos. Un estudio afirmó que frente a controles, expresión miR-326 aumentada en exosomas derivados de Tconv en pacientes con esclerosis múltiple recurrente-remitente.

Otros resultados: miR-326 exosomal altamente expresado redujo proliferación, formación de colonias, migración, invasión y facilitó apoptosis in vitro, y redujo volumen y peso tumoral CHC in vivo. Previamente se sugirió que crecimiento CHC suprimido por sobreexpresión miR-326, y migración/invasión atenuadas elevando miR-326. Reportado que miR-326 up-regulado suprime crecimiento e invasividad CHC y estimula apoptosis in vitro. Estudio previo verificó que sobreexpresión miR-326 declinó crecimiento tumoral in vivo. Otro reveló que miR-326 ectópico atenúa crecimiento celular y suprime migración/invasión en líneas cáncer pulmonar no microcítico. También, miR-326 disminuye genes profibróticos como MMP-9, implicando función represiva en proliferación cáncer. Se presenta que miR-326 reprime Bcl-2 y eleva Bax afectando apoptosis. Similar a hallazgos, algunos miARNs interactúan con exosomas en desarrollo CHC. Exosomal miR-638 altamente expresado reprime proliferación CHC. Exosomal miR-451a suprime angiogénesis tumoral alterando funciones endoteliales. Sobreexpresión miR-744 en exosomas suprime dramáticamente proliferación CHC.

Conclusión

En conclusión, nuestro estudio aporta evidencia que miR-326 exosomal derivado de macrófagos M1 suprime proliferación, migración e invasión y promueve apoptosis de células CHC, ofreciendo nueva diana terapéutica para CHC. Debido a tamaño muestral limitado e investigaciones conocidas limitadas, mecanismo exacto de miR-326 no se dilucida completamente, requiriendo estudios a gran escala para ilustrar mecanismo subyacente.

Abreviaturas

CHC:

Carcinoma hepatocelular

miARNs:

MicroARNs

SFB:

Suero fetal bovino

M/CSF:

Factor estimulante de colonias de macrófagos

PBS:

Salino fosfatado tamponado

DMEM:

Medio modificado de Dulbecco

PPAR:

Receptor activado por proliferador de peroxisomas

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

NTA:

Análisis de seguimiento de nanopartículas

NC:

Control negativo

RT-qPCR:

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa

BCA:

Ácido bicinconínico

BSA:

Albúmina sérica bovina

Exo:

Exosomas

ANOVA:

Análisis de varianza unidireccional