Secreción de células parietales gástricas y células caliciformes intestinales:una nueva vía metabólica de nanopartículas metálicas in vivo mediada por células mejorada con diarrea a través de hierbas chinas

Introducción

Con el rápido desarrollo de la nanotecnología y sus aplicaciones, ahora se utiliza una amplia variedad de materiales de nanoestructura de ingeniería en productos farmacéuticos, biomédicos y otras industrias. Los productos de nanotecnología emergentes tienen un enorme potencial para el crecimiento y el desarrollo económicos futuros, pero los riesgos de la nanotecnología sobre el medio ambiente y la salud humana aún no se comprenden completamente. Para investigar el impacto de las nanopartículas en el cuerpo humano, sus interacciones con los sistemas biológicos y sus posibles evaluaciones de riesgo, la nanotoxicología se ha considerado un tema multidisciplinario novedoso, que atrae cada vez más la atención de gobiernos y científicos y establece la bioseguridad de los nanomateriales como un tema clave. problema científico. Hasta la fecha, muchos informes están estrechamente asociados con la interacción entre nanopartículas y células humanas. Por ejemplo, algunas nanopartículas como los óxidos de grafeno, los nanoclusters de oro y los puntos de carbono pueden ingresar al citoplasma o al núcleo celular, induciendo la detención del ciclo celular o la apoptosis celular, la formación de granulomas pulmonares y estimulando la secreción celular inmunológica de algunas citocinas [1,2, 3].

Con el desarrollo de nuevas técnicas de imágenes moleculares, las nanopartículas metálicas, como las nanopartículas de oro, las nanopartículas de plata, las nanopartículas magnéticas y los puntos cuánticos, se han investigado activamente como reactivos teranósticos multifuncionales, y se utilizan para imágenes específicas in vivo, calentamiento inducido por magnéticos, fototermia o terapia fotodinámica, o como sistemas de administración de fármacos de alta eficiencia, entre otras aplicaciones. Se ha observado que estas nano-sondas multifuncionales basadas en nanopartículas metálicas están ubicadas en sitios tumorales, y parte de ellas también están ubicadas en los tejidos del hígado y el bazo y pueden distribuirse por los tejidos del riñón, pulmón y cerebro [4,5,6, 7,8,9,10]. Debido a que el riñón solo limpia las nanopartículas con menos de 5 nm de diámetro, la mayoría de las nanopartículas son muy difíciles de eliminar de esta manera [11, 12]. Por lo tanto, cómo limpiar las nanopartículas metálicas in vivo se ha convertido en un desafío científico clave. Sin embargo, hasta el día de hoy, no existen vías alternativas convincentes ni mecanismos detallados para eliminar las nanopartículas metálicas del cuerpo humano. Por lo tanto, cómo limpiar las nanopartículas metálicas in vivo se ha convertido en nuestra preocupación.

Hasta la fecha, las nanopartículas metálicas se introducen en el organismo principalmente por tres vías, como la intravenosa, oral e intraperitoneal, entre las cuales la inyección intravenosa es el método más común debido a su rápida distribución por todo el cuerpo [4, 13, 14]. . Sin embargo, la degradación de los núcleos metálicos de este tipo de nanopartículas por parte del organismo es, si es posible, extremadamente difícil, dando lugar al problema principal, que son los efectos de la acumulación de nanopartículas residuales. Cabe señalar que la calidad de las nanopartículas metálicas in vivo está determinada por el equilibrio entre la bioactividad inducida por nanopartículas y la toxicidad no deseada. Desde una perspectiva toxicológica, se provoca un efecto tóxico solo si se ubican cantidades suficientes de nanopartículas en un sitio objetivo, y la excreción del organismo es la mejor manera de detener los efectos de una cantidad excesiva de nanopartículas ubicadas en las células y tejidos. Por lo tanto, una comprensión adecuada de sus vías de eliminación es crucial para cualquier aplicación médica y para una evaluación integral de riesgos.

Hay algunos estudios asociados con la eliminación de nanopartículas de tejidos u órganos in vivo como el riñón, el hígado y el pulmón [15,16,17]. Sin embargo, estos experimentos simplemente proporcionan información sobre el mecanismo de depuración para eliminar partículas de un solo órgano en lugar de todo el cuerpo [18]. En cuanto al aclaramiento sistémico in vivo, se han informado dos vías principales de excreción de nanopartículas inyectadas por vía intravenosa, es decir, la vía de heces del sistema hepatobiliar (HBS) para nanoestructuras más grandes que no pueden ser biodegradables por el organismo como algunos tipos de nanopartículas magnéticas. [19, 20], y la vía riñón-orina para nanopartículas de pequeño tamaño, como puntos cuánticos, fullerenos, nanoclusters de oro y otros tipos de nanopartículas de oro con menos de 5 nm de diámetro [16, 21, 22]. Sin embargo, estas dos vías muestran una tasa de aclaramiento limitada para nanopartículas metálicas in vivo.

Souris y col. demostraron que las nanopartículas de sílice se acumulan en la pared intestinal en alta concentración y que la concentración de nanopartículas de sílice de 50-100 nm inyectadas por vía intravenosa localizadas en el hígado era mucho menor que en la pared intestinal y las heces [20]. Otro estudio mostró que las nanopartículas de hasta 500 nm, independientemente de las modificaciones, pueden eliminarse del cuerpo del pez y que la tasa de eliminación de las partículas de 500 nm era más rápida y eficiente que la de las partículas de 50 nm a pesar de que las nanopartículas más grandes están mucho más allá de su capacidad. de HBS [23]. Estos datos muestran que la vía de HBS puede no ser la vía de excreción principal de las nanopartículas in vivo y que pueden existir otras vías de excreción para las nanopartículas in vivo.

Las células caliciformes intestinales (GC) son células excretoras altamente polarizadas que están presentes en todo el tracto intestinal. Se cree que estas células epiteliales especializadas desempeñan un papel protector importante en el intestino al sintetizar y secretar varios mediadores [24, 25, 26]. Wang y col. informaron que las células caliciformes (GC) pueden absorber nanopartículas [27], y Sun et al. encontraron que las nanopartículas inyectadas por vía intravenosa se distribuían en los GC intestinales [28]. Sin embargo, hasta la fecha, la interacción entre las nanopartículas y los GC intestinales aún no se investiga en detalle. Específicamente, ningún informe aclara completamente cómo esas nanopartículas son capaces de ingresar a las células GC y si esas nanopartículas se distribuyen en los GC de todo el tejido intestinal. Para aclarar la vía de excreción de nanopartículas metálicas en los tejidos intestinales, es crucial dilucidar qué papel juegan los GC intestinales en esta nueva vía de excreción de nanopartículas. Debido a que las nanopartículas metálicas pueden excretarse a través de HBS y llegar al intestino, nos hemos centrado en distinguir entre la excreción mediada por HBS y la mediada por los GC intestinales (esquema 1).

La vía de excreción intestinal de las nanopartículas de GC

En este estudio, seleccionamos cuatro tipos de nanopartículas metálicas comunes, como nanopartículas magnéticas, nanopartículas de triángulo de plata, nanoclusters de oro y nanobarras de oro como objetivos de investigación. Gracias a las propiedades ópticas características de las nanovarillas de oro, sirvieron como una herramienta para observar la distribución intestinal de las nanopartículas por excitación de dos fotones, mientras que los otros tres tipos de partículas sirvieron como ejemplos representativos de varios otros nanomateriales metálicos. Se prepararon modelos de ratones con ligadura del conducto biliar común para evitar la conexión entre HBS y el tracto intestinal. Las nanopartículas metálicas se inyectaron en ratones a través de la vena de la cola, luego, se criaron ratones desnudos y se recolectaron heces durante 7 días, y finalmente se sacrificaron los animales, y se recolectaron los tejidos del tracto intestinal y los tejidos gástricos, se prepararon en rodajas y finalmente se analizaron. utilizando un electroscopio de transmisión de alta resolución e ICP-MS para investigar la distribución de nanopartículas metálicas en los tejidos intestinales. Además, se midió la presencia de nanopartículas metálicas en las heces de los ratones con ligadura de CBD. Además, en este estudio, con el fin de descubrir aún más el mecanismo de secreción de nanopartículas de los GC y PC, utilizamos un modelo de diarrea en ratones desarrollado recientemente inducido a través de hierbas chinas.

Materiales y métodos

Síntesis y caracterización de nanoplacas triangulares de plata

Las nanoplacas de plata triangulares se sintetizaron mediante procedimientos previamente descritos por Mirkin [29] y sus colegas con algunas modificaciones [30]. En un experimento típico a temperatura ambiente con aire, AgNO ₃ (0,1 mM, 100 ml), citrato trisódico (30 mM, 6 ml), PVP (peso molecular de 30 kDa, 0,7 mM, 6 ml) y 240 μL de H ₂ O ₂ (30% en peso) se añadieron ordenadamente a un matraz de 250 ml. Después de agitar vigorosamente las soluciones combinadas en el matraz, 0,8 ml de una solución recién preparada de 0,1 M NaBH ₄ fue inyectado rápidamente. En unos pocos segundos, el color de la solución se volvió amarillo, lo que indica la generación de nanoesferas de plata. En las siguientes horas, el matraz se colocó bajo luz solar o lámpara fluorescente hasta que la solución se volvió de color azul, sin más cambios de color (como máximo 5 h). Y la solución final se almacenó en un refrigerador a 4 ° C para su uso posterior.

El espectro de absorbancia de la solución preparada se midió mediante un espectrómetro UV-vis-NIR (UV-3600, Shimadzu, Japón) usando una cubeta de trayectoria óptica de 1 cm. Los espectros se recogieron dentro de un rango de 200 a 950 nm con una rendija de 2 nm. El análisis por microscopía electrónica de transmisión se realizó en JEM-200CX (JEOL, Japón) sumergiendo la rejilla TEM de cobre recubierta de carbono en las nanopartículas recolectoras en 1 ml de agua desionizada después de centrifugar un total de 10 ml de la solución en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. a 6000 rpm durante 30 min a 25 ° C. Se seleccionaron un total de 200 nanoplacas de plata triangulares a partir de las imágenes TEM para calcular estadísticamente la distribución de los tamaños de sus bordes.

Magnetita superparamagnética (Fe ₃ O ₄ ) nanopartículas, nanoclusters de oro y nanobarras de oro se sintetizaron y caracterizaron de acuerdo con nuestros informes anteriores [31, 32, 33] y se almacenaron a temperatura ambiente.

Preparación de modelos animales con ligadura del conducto biliar común

Se obtuvieron ratas Wistar hembras sanas (180-220 g) y ratones rudos hembras (20-22 g) de Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, China). Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las leyes y directrices institucionales pertinentes. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Jiao Tong de Shanghai (NO.SYXK2007-0025). El colédoco se ligó siguiendo un método descrito originalmente por Lee con algunas modificaciones [34]. Brevemente, estos ratones se anestesiaron con pentobarbital (25 mg / kg) y se fijaron sobre una sábana quirúrgica de madera. Se hizo una incisión en la parte media del abdomen y los tejidos abdominales se separaron con cuidado para exponer claramente el CBD. Se colocaron dos suturas quirúrgicas médicas de nailon estéril (Shanghai Jinhuan Industry CO., Ltd., Shanghai, China), de 0,2 mm de diámetro, debajo del CBD, y se hicieron tres nudos en ambos extremos de un segmento del CBD (Fig. 1b, c). Finalmente, se cortó el CBD entre los dos extremos, seguido del cierre final del abdomen. El día 14 después de la ligadura del conducto colédoco, se recolectaron muestras de sangre de cada ratón para evaluar la función hepática principal.

Caracterización de las nanoplacas de plata triangulares. un Espectro UV-vis de la solución preparada. b Imagen TEM de las nanopartículas de plata reunidas después de la centrifugación. c Distribución de tamaño de las nanoplacas de plata triangulares seleccionadas (200 nanopartículas de la imagen TEM)

Inyección de nanopartículas en los ratones

Después de terminar la ligadura de CBD, 12 ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos:grupo de control 1, grupo de prueba de nanoplacas de plata, grupo de prueba de nanopartículas magnéticas y grupo de prueba de nanoclusores de oro. Un grupo de control adicional estaba compuesto por cinco ratones sin ligadura de CBD. Los ratones de los grupos de control se trataron con una inyección intravenosa de solución acuosa de NaCl al 0,9%, mientras que los grupos de prueba se inyectaron con una suspensión de nanopartículas como nanoplacas triangulares de plata, nanopartículas magnéticas, nanobarras de oro y nanoclusters de oro a una dosis de 150 μL ( 550 μg / mL). Las cuatro suspensiones de nanopartículas se dispersaron recientemente mediante sonicación durante 1 minuto antes de su uso. Los ratones fueron anestesiados mediante la inhalación de isoflurano al 5% hasta que el tono muscular se relajó, luego se inyectaron por vía intravenosa cuatro tipos de suspensiones de nanopartículas con una jeringa de 1 ml, respectivamente.

Distribución de nanopartículas en los tejidos

Al séptimo día después de la inyección de la suspensión de nanopartículas metálicas, los ratones fueron anestesiados y se extrajeron sus tejidos intestinales, se fijaron en formaldehído al 10% durante 24 horas y luego se incrustaron en parafina. Se utilizó un microtomo rotatorio Leica RM2135 para preparar secciones de 5 μm de espesor de las muestras fijadas. Finalmente, las secciones se deshidrataron con alcohol y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones de las muestras se observaron bajo un microscopio de contraste de fase (Olympus, RX-71, Japón).

Al séptimo día después de la inyección de la suspensión de nanopartículas metálicas, se recogieron los tejidos intestinales y tejidos gástricos inmediatamente después de la escarificación de los ratones y se fijaron en una solución de glutaraldehído al 2,5%. Las muestras fijadas se deshidrogenaron en serie en etanol y se embebieron con resina epoxi. Después de eso, se hizo una muestra intestinal ultrafina y se observó con TEM de alta resolución (FEI, Tecnai G2 Spirit Biotwin, EE. UU.).

Ese mismo día, se recolectaron sus tejidos intestinales inmediatamente después del sacrificio y se obtuvieron imágenes mediante el uso de un sistema de imágenes in vivo (sistema de imágenes IVIS-100, Caliper) junto con una cámara de dispositivo de carga acoplada fría (CCD) y una proteína roja fluorescente. (DsRed) filtro (Caliper Life Sciences). Las imágenes y mediciones de señales fluorescentes se adquirieron y analizaron con el software Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences).

Contenido metálico de las heces

Además, todas las heces de los ratones se recogieron dentro de los 7 días posteriores a la inyección, y las heces se pesaron y digirieron con agua regia bajo calentamiento. Finalmente, el contenido mental metálico en la solución se determinó mediante un ICP-MS (Agilent 7500a, EE. UU.).

Preparación de extractos de hierbas chinas

Se añadieron 10 g de hoja de sen, 2 g de ruibarbo y 1 g de extractos de cannabis fructus a 100 ml de agua, se calentaron a 100 ° C durante 10 min y luego se filtraron con dos capas de gasa [35]. Finalmente, los filtrados se recogieron y se concentraron a 0,3 g / ml a presión reducida. Los extractos de hoja de sen se prepararon como se indica a continuación y se almacenaron a 4 ° C antes de realizar las pruebas.

Análisis de células caliciformes

En primer lugar, se separaron aleatoriamente seis ratones Kunming machos en dos grupos:el grupo de control y el grupo de diarrea; ambos fueron tratados con suero fisiológico y extractos de hierbas chinas diariamente durante 7 días mediante sonda oral (0,1 ml), respectivamente. El séptimo día después de la administración por sonda, se sacrificaron los ratones, se recogieron los tejidos intestinales y se congelaron los tejidos intestinales y gástricos en Tissue Tek OCT y se seccionaron en un criostato Leica CM 1510 S (Sakura Funetek, EE. UU.). Las secciones de 8 μm se tiñeron en Azul Alcian (1% Alcain Blue 8GX en 3% de ácido acético glacial) durante 5 min y finalmente se enjuagaron en agua destilada. Esta muestra se oxidó en ácido peryódico al 1% antes del lavado y luego se trató durante 15 min en reactivo de Schiff. Las imágenes de las secciones de tejido se registraron utilizando un microscopio invertido. Los tejidos gástricos se recogieron en portaobjetos cargados positivamente para obtener imágenes de luminiscencia de dos fotones.

Contenido de oro de los tejidos intestinales y las heces

Brevemente, se dividieron 9 ratones Kunming machos en cada uno de los tres grupos según el tratamiento diferente:grupo de control, grupos de ligadura y grupos de ligadura + diarrea. Luego, a estos ratones se les inyectó por vía intravenosa 100 μL de GNR (1 mg / ml). El segundo día después de la inyección en la vena de la cola, los grupos de control y ligadura se trataron con solución salina, al mismo tiempo que los grupos ligadura + diarrea se trataron con extractos de hierbas chinas. La dosis del tratamiento se mantuvo constante y se administró diariamente durante los siguientes 7 días mediante sonda oral (0,1 ml). El séptimo día, los ratones se sacrificaron y los tejidos intestinales se congelaron en Tissue Tek OCT y se seccionaron en un criostato Leica CM 1510 S (Sakura Funetek, EE. UU.). Se recogieron secciones (8 μm) en portaobjetos cargados positivamente para obtener imágenes de luminiscencia de dos fotones. Todas las heces de los ratones se recogieron después de la inyección. Las heces se pesaron y se digirieron con agua regia bajo calentamiento. Finalmente, el contenido mental de oro en la solución se determinó mediante un ICP-MS (Agilent 7500a, EE. UU.).

Análisis estadístico

Cada experimento se repitió tres veces por duplicado. Los resultados se presentaron como media ± DE. Las diferencias estadísticas se evaluaron utilizando la t prueba y considerado en P <0.05.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de las nanopartículas

Las nanoplacas de plata triangulares se sintetizaron mediante el método de síntesis térmica rápida, mostrando una buena solubilidad en agua. Más importante aún, la forma triangular particular de estas nanopartículas facilita su identificación mediante microscopía electrónica. Como se muestra en la Fig.1, en el espectro UV-vis, las nanopartículas de plata preparadas mostraron un pico fuerte a 648.5 nm correspondiente a la banda de plasmón de la superficie del dipolo en el plano y dos picos modestos a longitudes de onda más bajas, correspondientes al plano (482 nm) y resonancias cuadrupolo fuera del plano (333 nm), lo que indica la formación de una arquitectura triangular [36], que se verifica además mediante la imagen TEM de las nanopartículas de plata reunidas después de la centrifugación. La imagen TEM (Fig. 1b) reveló que los lotes preparados contenían una subpoblación de nanoesferas de plata, posiblemente contribuyendo al pico de SPR a 389 nm [36]. La longitud del borde de las nanoplacas de plata triangulares reunidas fue de 44,3 nm con una buena distribución monodispersa.

Se prepararon nanopartículas magnéticas con 20 nm de diámetro y nanoclusters de Au con 5 nm de diámetro, y su caracterización se muestra en el archivo adicional 1:Figura S1 y S2 respectivamente. Las imágenes TEM y los espectros UV / vis de nanobarras de Au se muestran en el archivo adicional 1:Figura S3.

Preparación de los modelos de ratones de ligadura de CBD

La ligadura del conducto biliar común (CBD) es un modelo experimental bien conocido que se utiliza para inducir fibrosis colestásica hepática [37, 38]. Aquí, llevamos a cabo experimentos en ratones con ligadura de CBD para bloquear totalmente la conexión entre HBS y el tracto intestinal (Fig.2a, b), asegurándonos de que las nanoplacas metálicas fueran transportadas solo por el torrente sanguíneo a los tejidos intestinales después de la inyección intravenosa. En comparación con los controles normales, los grupos tratados mostraron un fuerte aumento en el diámetro y el grosor de la pared del conducto biliar común 14 días después de la ligadura del CBD debido a la estasis biliar (Fig. 2d). Además, como se muestra en la Fig. 2e, los niveles de TBIL y AST en el grupo de ligadura fueron significativamente más altos que en el grupo de contraste. Estos resultados sugirieron que después de construir con éxito el modelo de ratones con ligadura de CBD, el conducto biliar común se bloqueó por completo y que la conexión entre el HBS y el tracto intestinal se cortó por completo, induciendo así colestasis y fibrosis colestásica hepática [39].

un Una ilustración esquemática de las relaciones de HBS con el tracto intestinal. b, c Ligadura de CBD (flechas blancas). d Inflamación de CBD el día 14 después de la ligadura de CBD (flecha blanca). e Examen de la función hepática principal. * P <0.05

El efecto de cuatro tipos de nanopartículas en los tejidos intestinales

Normalmente, el epitelio intestinal proporciona una barrera semipermeable que permite que pequeñas cantidades de moléculas de diferentes tamaños y características atraviesen el epitelio intacto por mecanismos tanto activos como pasivos. Generalmente, cuanto más grande es la molécula, menos probable es que cruce esta barrera. Sin embargo, una vez que el revestimiento del intestino se inflama o se daña, se vuelve más difícil para el epitelio intestinal mantener afuera las partículas extrañas y grandes a medida que se abren los espacios entre las células [40, 41]. Considerando que las nanopartículas pueden ser la causa de los cambios patológicos de los tejidos intestinales y el consecuente aumento de la permeabilidad de la pared intestinal, que lleva a que las nanopartículas atraviesen la pared intestinal, realizamos un examen histopatológico de los tejidos intestinales tras ser expuestos a cuatro tipos diferentes de nanopartículas:nanopartículas magnéticas, nanopartículas de triángulo de plata, nanobarras de oro y nanoclusters de oro. Como se muestra en la Fig. 3, no se observaron diferencias significativas entre los grupos de control y los grupos de prueba, ni hubo otros cambios histológicos como el infiltrado inflamatorio [42]. Los resultados demuestran que estas nanopartículas metálicas no provocan cambios patológicos en los tejidos intestinales, eliminando así la posibilidad de que las nanopartículas se escapen de los espacios entre las células.

Microsección histopatológica de diferentes muestras de tejido intestinal de ratones con ligadura de CBD. un Grupos de control:ratones tratados con inyección de solución salina a través de las venas de la cola (paneles superiores). b Grupos de prueba:ratones tratados con suspensión triangular de nanoplacas de plata inyectada a través de las venas de la cola (paneles inferiores)

Distribución de nanopartículas metálicas en GC intestinales

Los GC son un tipo de los cuatro tipos de células principales presentes en todo el tracto intestinal y son responsables de la producción y conservación de una capa protectora de moco al sintetizar y secretar glicoproteínas de alto peso molecular conocidas como mucinas, que promueven la eliminación del contenido intestinal y proporcionan la primera línea de defensa contra las lesiones físicas y químicas causadas por la ingestión de alimentos, microbios y el producto microbiano [43, 44]. Los GC se identificaron fácilmente gracias a su alto volumen de contenido de moco. Como se muestra en la Fig. 6, las nanoplacas de plata triangulares se ubicaron dentro de los GC intestinales a lo largo del tracto intestinal, y se pudieron obtener las diferentes fases de su secreción a partir de los GC. La Figura 4d muestra cómo algunas nanoplacas de plata triangulares habían sido secretadas hacia el intestino por un GC. La Figura 4e muestra que algunas nanoplacas de plata triangulares encapsuladas en el contenido de moco de los GC intestinales estaban listas para ser secretadas. En la Fig. 4f, se muestra cómo algunas nanoplacas de plata triangulares habían sido expulsadas de un GC, mientras que otras todavía estaban en él. A partir de las imágenes TEM, encontramos que algunas nanoplacas de plata triangulares se mostraban en modo de agregación (Fig.4 (a2, dye), flechas verdes), mientras que otras estaban en modo de dispersión (Fig.4 (a1, b1, b2, c1, c2 yf), flechas blancas). La agregación es un fenómeno común de las nanopartículas, y generalmente se observa cuando su concentración aumenta mucho en las células [45]. Por el contrario, una disminución en la concentración de nanopartículas impide su agregación.

Distribución de nanoplacas de plata triangulares en GC intestinales de ratones con ligadura de CBD. El grupo de ratones con ligadura de CBD se trató con nanoplacas de plata triangulares inyectadas a través de la vena de la cola 7 días después de la ligadura. GC intestinales de diferentes tejidos intestinales. A Duodeno, nanoplacas de plata triangulares se mostraron en un modo de agregación (flecha verde), mientras que algunas nanoplacas triangulares de plata estaban en un modo de dispersión (flechas blancas). B Yeyuno, nanoplacas triangulares de plata ubicadas en el GC intestinal (flechas blancas). C El íleon y algunas nanoplacas de plata triangulares fueron excretadas, mientras que algunas todavía estaban adentro. D Colon, se secretaron algunas nanoplacas de plata triangulares hacia el intestino. E , F En el recto, algunas nanoplacas de plata triangulares estaban listas para excretar (modo de dispersión, flechas blancas), mientras que otras todavía estaban dentro (modo de agregación, flecha blanca)

Se observaron resultados similares para nanoclusters de oro, nanopartículas magnéticas y nanobarras de oro, como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S4, S5 y S6. Estos resultados mostraron claramente que estos tres tipos de nanopartículas metálicas se encuentran dentro de los GC del tracto intestinal, lo que respalda indirectamente que estas nanopartículas metálicas pueden eliminarse mediante la vía de los GC.

Aunque los GC se distribuyen a lo largo de toda la línea del tracto intestinal, su contribución al volumen epitelial total no es idéntica. En el intestino delgado de los ratones, la densidad de volumen de los GC aumenta progresivamente desde el duodeno hasta el íleon. Esta tendencia continúa en el tracto intestinal grueso y la densidad de GC en el epitelio colónico también aumenta de proximal a distal, desde el colon hasta el recto [43]. Con base en el hecho de que existían nanoplacas de plata triangulares, nanopartículas magnéticas y nanoclusters de oro en los GC intestinales a lo largo del tracto intestinal, y que la contribución de los GC al volumen epitelial total es totalmente diferente, creemos que el intestino grueso puede ser el principal lugar de excreción para la vía de excreción de los GC intestinales.

Debido a su forma característica, las nanoplacas de plata triangulares se distinguieron fácilmente mediante imágenes TEM en las ubicaciones descritas en la ruta sugerida para llegar a los GC. Sin embargo, aunque las nanopartículas magnéticas y los nanoclusters de oro no pudieron distinguirse de otras estructuras utilizando esta técnica, el archivo adicional 1:la figura S4 revela que el tracto intestinal del grupo de ligadura de CBD todavía tiene una cierta cantidad de nanoclusters de oro que nos lleva a la conclusión de que el mecanismo de excreción de GC mencionado anteriormente también se aplica a otros tipos de nanopartículas metálicas.

Además, como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S7, los resultados de ICP-MS muestran claramente que estas nanopartículas aún pueden ser secretadas por el cuerpo de los ratones de ligadura. Estos resultados demostraron que las células caliciformes de los tejidos intestinales están involucradas en una vía importante para la excreción de nanopartículas.

Mecanismo potencial de transporte de nanopartículas metálicas en el vaso sanguíneo intestinal

Los resultados mencionados anteriormente demuestran que estos cuatro tipos de nanopartículas metálicas (nanopartículas magnéticas, nanopartículas de triángulo de plata, nanovarillas de oro y nanoaglomerados de oro) se distribuyeron en los GC a lo largo del tracto intestinal, pero la forma en que las nanopartículas ingresan a los GC aún no se ha establecido. aclarado. Debido a que los modelos de ratón con ligadura de CBD se trataron con una suspensión de nanopartículas metálicas mediante inyección en la vena de la cola, estas nanopartículas solo pudieron ser transportadas por el flujo sanguíneo a los vasos intestinales. Como lo revelaron las imágenes de TEM, algunas nanoplacas de plata triangulares estaban ubicadas en el corpúsculo sanguíneo (Fig. 5a, flechas blancas). Es más, estudios anteriores han revelado que el corpúsculo sanguíneo puede distribuir nanopartículas de pequeño tamaño en todo el sistema circulatorio [46]. Se puede observar en la Fig. 5b que algunas nanoplacas de plata triangulares atraviesan la membrana de los vasos sanguíneos (flechas verdes), mientras que algunas nanoplacas de plata triangulares se ubicaron en el corpúsculo de la sangre (flechas rojas). Por lo tanto, como revela la Fig.8, inferimos que las nanoplacas de plata triangulares fueron transportadas por los glóbulos y luego liberadas al plasma, seguido de su paso por la membrana de la pared vascular de los vasos intestinales y finalmente llegando a los GC.

Distribución de nanoplacas de plata triangulares en los vasos intestinales de ratones con ligadura de CBD. un Nanoplacas triangulares de plata ubicadas en el corpúsculo sanguíneo (flechas blancas). b Las nanoplacas triangulares de plata penetraron en la pared vascular (flechas verdes), mientras que algunas se ubicaron en el corpúsculo sanguíneo (flechas rojas)

Ensayo de análisis de células caliciformes

Las células caliciformes juegan un papel clave en la vía de excreción de nanopartículas. En este estudio, descubrimos que estas células caliciformes pueden secretar nanopartículas metálicas. Siguiendo esta afirmación, si se acelera el proceso de secreción de las células caliciformes, teóricamente sería posible que también aumentara la excreción de nanopartículas. Para abordar esto, establecimos un modelo de diarrea inducida por una hierba china utilizada en la medicina tradicional. Con el fin de explorar cómo los procesos diarreicos influyen en la secreción de GC, se realizó un análisis histológico de los GC intestinales. Debe reconocerse que un mayor número de células caliciformes del tejido intestinal aumenta la producción de mucina [47]. Como se muestra en la Fig. 6, en los grupos de diarrea, el número total de células caliciformes en el intestino delgado y el intestino grueso fue significativamente mayor en comparación con los controles. Además, el porcentaje y el número de células caliciformes cavitadas en los tejidos intestinales fueron significativamente mayores en los grupos de diarrea en comparación con los controles. Estas observaciones nos permiten afirmar que la cantidad de células de tejido intestinal aumenta en respuesta a la diarrea, lo que sugiere un aumento de la excreción por parte de los GC. Estos resultados concuerdan con los datos informados anteriormente [47].

Microfotografías de tejido intestinal teñido con azul de Alcian / reactivo de Schiff para visualizar células caliciformes. Las imágenes son representativas de ratones tratados con solución salina (grupos de ligadura) y hoja de sen (ligadura + grupos de diarrea) con flechas que indican células caliciformes no cavitadas (flecha verde) y células caliciformes cavitadas (flecha roja) que secretan mucina. Todas las barras son de 100 μm

Contenido de oro de los tejidos intestinales y las heces

Se ha informado que la sección transversal de acción de dos fotones (TPACS) de una nanovarilla puede alcanzar 2320 GM, que es mucho más alta que la de los fluoróforos orgánicos y dentro del rango de la de los puntos cuánticos, proporcionando un enfoque prometedor para detectar la distribución de las nanovarillas de oro en tejidos biológicos mediante excitación de dos fotones [48, 49]. En esta parte del estudio, con el fin de observar la distribución intestinal de las nanopartículas en los grupos de ligación y los grupos de ligación + diarrea, se midió la luminiscencia de dos fotones del núcleo de AuNRs. Como se muestra en la Fig. 7, los contenidos de oro del intestino delgado y grueso fueron significativamente más altos para los grupos de ligadura en comparación con los observados en los grupos de ligadura + diarrea. El contenido de oro elemental en los tejidos intestinales se cuantificó mediante ICP-MS 7 días después de la inyección en la vena de la cola. El contenido de oro de los tejidos intestinales fue significativamente mayor en los grupos de ligadura en comparación con el de los grupos de ligadura + diarrea ( P <0,001) durante todo el estudio (fig.7). Estos resultados indican que el nivel de nanopartículas excretadas por las células caliciformes de los grupos de diarrea es más alto que el de cualquiera de los otros grupos.

Imágenes de microscopía confocal de barrido con láser de dos fotones de secciones de tejido intestinal a los 7 días después de la inyección de GNR en la vena de la cola (excitación 780 nm, emisión 601-657 nm)

En el siguiente experimento, analizamos el contenido de oro en las heces de ratones. Como se muestra en la Fig. 8a, el contenido de oro de las heces fue significativamente mayor en el grupo de control en comparación con el de los grupos de ligadura o los grupos de ligadura + diarrea ( P <0,001). Además, en los grupos de ligadura + diarrea, el contenido de oro fue significativamente mayor que en los grupos de ligadura (Fig. 8a). Estos resultados sugieren que la diarrea acelera el proceso de secreción de nanopartículas por las células caliciformes intestinales. Combinado con el análisis cuantitativo de elementos de oro en las heces, demostramos además que las células caliciformes de los tejidos intestinales están involucradas en una vía importante para la excreción de nanopartículas.

Contenido de GNR en los tejidos intestinales 7 días después de la inyección ( a ) y el contenido de elementos de oro de las heces ( b ) basado en análisis ICP-MS. *** P <0.01, que muestra una diferencia significativa entre los grupos de ligadura y los grupos de ligadura + diarrea

Efectos de las células parietales en la secreción gástrica de nanopartículas metálicas

Las células parietales se distribuyen principalmente en la parte inferior del estómago y el cuerpo gástrico, que secretan ácido clorhídrico y factor interno. Además, encontramos que nanoclusters de oro distribuidos en los tejidos gástricos de ratones con ligadura de CBD (archivo adicional 1:Figura S4B). Por tanto, planteamos la hipótesis de que las células parietales pueden estar implicadas en la excreción de nanopartículas. Como era de esperar, a partir de imágenes de luminiscencia de dos fotones, se encontró que las nanovarillas de oro se distribuyen en los tejidos gástricos (Fig. 9a, b). Además, como muestra la Fig. 9c, d, observamos que las nanoplacas de plata triangulares se distribuyen en las células parietales del tejido gástrico. Combinado con los resultados de investigaciones anteriores, especulamos que las células parietales están involucradas en la secreción de nanopartículas.

Distribución de nanopartículas en el tejido gástrico. ( a ) y ( b ):Imágenes de microscopía confocal de barrido con dos foto-láser de secciones de tejido intestinal 7 días después de la inyección de GNR en la vena de la cola (excitación:780 nm, emisión:601-657 nm). ( c ) Imagen TEM de las células parietales gástricas; ( d ) Nanoplacas triangulares de plata ubicadas en las células parietales gástricas (flechas blancas)

Conclusiones

En resumen, preparamos y aplicamos con éxito nanoplacas de plata triangulares, nanopartículas magnéticas, nanobarras de oro y nanoclusters de oro como agentes de seguimiento. Los ratones con ligación de CBD se trataron con las nanopartículas preparadas previamente mediante inyección en la vena de la cola para estudiar la distribución y excreción del tejido gástrico-intestinal de estas nanopartículas. También analizamos las vías de excreción de nanoclusters de oro y nanopartículas magnéticas. Cabe señalar que los nanoclusters de oro se eliminan principalmente a través de la vía urinaria renal, mientras que las nanopartículas magnéticas se eliminan principalmente del organismo a través de la vía HBS. Como las capacidades excretoras del riñón y el HBS para aplicaciones in vivo de nanopartículas metálicas son muy limitadas, la vía de excreción de GC y PC puede proporcionar otra vía alternativa importante para la excreción de estas nanopartículas. Con respecto a este tema, también encontramos que el proceso de nanopartículas secretadas por GC y PC se acelera por la diarrea, lo que demuestra que los GC y PC representan una vía importante para la excreción de nanopartículas metálicas. Es cierto que nuestro conocimiento todavía es limitado con respecto al aclaramiento in vivo de nanopartículas como, por ejemplo, el mecanismo concreto que subyace a las vías de secreción de GC y PC, y la eficiencia de eliminación de nanopartículas en los GC intestinales, por lo que se necesitan con urgencia más investigaciones. En resumen, esta nueva vía de eliminación in vivo de nanopartículas metálicas tiene un gran potencial en aplicaciones a corto plazo, como el diseño y desarrollo de nuevos fármacos, el etiquetado basado en nanopartículas y el seguimiento in vivo, y la evaluación de la bioseguridad de las nanopartículas in vivo.

Abreviaturas

CBD:

Conducto biliar común

CCD:

Dispositivo de carga acoplada

GC:

Células caliciformes

GNR:

Nanovarillas de oro

HBS:

Hepatobiliar

PC:

Células parietales

Sistema Fe ₃ O ₄ :

Magnetita superparamagnética

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

TPACS:

Sección transversal de acción de dos fotones

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