Eliminación de nanopartículas metálicas mediada por células caliciformes: Una vía in vivo acelerada por diarrea inducida por hierbas chinas

Resumen

A pesar del uso extensivo de nanopartículas metálicas en medicina, su eliminación in vivo sigue siendo poco conocida. En este estudio demostramos que las células caliciformes (GCs) intestinales y las células parietales (PCs) gástricas transportan activamente una variedad de nanopartículas metálicas —nanoplacas triangulares de plata, nanopartículas magnéticas, nanobarras de oro y nanoclústeres de oro— hacia la luz intestinal, donde son excretadas en las heces. Mediante un modelo murino con ligadura del conducto biliar común (CBD) para bloquear la ruta hepatobiliar, mostramos que estas nanopartículas se acumulan dentro de las GCs a lo largo de todo el tracto intestinal y, en el caso de las nanoplacas de plata y nanobarras de oro, también dentro de las PCs. No se observaron cambios patológicos en los tejidos intestinales. Además, la tasa de secreción de nanopartículas desde GCs y PCs aumentó notablemente en un modelo de diarrea inducido por un extracto de hierbas chinas, lo que sugiere un efecto modulador de la motilidad gastrointestinal sobre la excreción de nanopartículas. Estos hallazgos revelan una ruta de eliminación previamente no reconocida que podría orientar el diseño más seguro de terapéuticos y diagnósticos basados en nanopartículas.

Introducción

La nanotecnología se ha expandido rápidamente hacia fármacos, diagnósticos y aplicaciones industriales, pero los riesgos para la salud y el medio ambiente de las nanoestructuras diseñadas siguen sin definirse completamente. La nanotoxicología, un campo multidisciplinar, busca mapear las interacciones entre nanopartículas y sistemas biológicos, evaluar peligros potenciales y establecer directrices de seguridad [1–3]. Las nanopartículas metálicas —como oro, plata, magnéticas y puntos cuánticos— han atraído especial interés por sus propiedades ópticas, magnéticas y catalíticas, que permiten imágenes dirigidas, terapia fototérmica y administración de fármacos [4–10]. Sin embargo, los mismos rasgos fisicoquímicos que les confieren funcionalidad también dificultan su biodegradación y eliminación; la mayoría de partículas mayores de ~5 nm evaden la filtración renal, mientras que agregados mayores son secuestrados en hígado, bazo o pulmón [11–12]. Por tanto, comprender cómo el cuerpo elimina estas partículas es crítico para la seguridad terapéutica y la evaluación de riesgos.

El conocimiento actual de las vías de eliminación in vivo es fragmentado. El sistema hepatobiliar (HBS) entrega partículas que el riñón no puede degradar hacia las heces, mientras que la ruta renal-urinaria maneja especies menores de 5 nm [16,21,22]. Ambas rutas muestran eficiencia limitada para muchas nanopartículas metálicas, lo que ha impulsado la investigación de mecanismos alternativos. Estudios recientes sugieren que la pared intestinal puede servir como ruta de excreción: nanopartículas de sílice se acumularon en la mucosa intestinal y heces en ratones, mientras que partículas mayores (hasta 500 nm) se eliminaron más rápido que las pequeñas en peces, indicando que el HBS no es la única vía [20,23].

Las células caliciformes (GCs) intestinales son células epiteliales polarizadas secretoras de moco que recubren todo el intestino y protegen contra daño mecánico y químico [24–26]. Trabajos previos mostraron que las GCs pueden internalizar nanopartículas y que partículas inyectadas intravenosamente aparecen dentro de GCs, pero la dinámica y extensión de este proceso permanecen inexploradas [27–28]. Este estudio tiene como objetivo elucidar el papel de las GCs —y, en menor medida, de las células parietales (PCs) gástricas— en la excreción de un conjunto representativo de nanopartículas metálicas, y evaluar cómo la motilidad gastrointestinal, modulada por un modelo de diarrea inducida por hierbas chinas, influye en esta vía.

Materiales y Métodos

Síntesis y Caracterización de Nanoplacas Triangulares de Plata

Las nanoplacas triangulares de plata se sintetizaron siguiendo el protocolo de Mirkin et al. con ajustes menores [29,30]. En resumen, se mezclaron AgNO₃ (0,1 mM, 100 mL), citrato trisódico (30 mM, 6 mL), PVP (30 kDa, 0,7 mM, 6 mL) y 240 µL de H₂O₂ (30 % p/p) a temperatura ambiente. Tras agitación vigorosa, se añadió rápidamente 0,8 mL de NaBH₄ 0,1 M recién preparado, obteniendo una solución amarilla que tornó azul en 5 h bajo exposición a luz. La suspensión final se almacenó a 4 °C.

Los espectros UV-vis se registraron (200–950 nm, rendija 2 nm) con un Shimadzu UV-3600. La imagen TEM (JEOL JEM-200CX) confirmó partículas triangulares monodispersas con longitud de borde promedio de 44,3 nm (Fig. 1b). El pico de plasmón característico a 648,5 nm indicó síntesis exitosa de morfología triangular [36].

Preparación de Modelos Animales con Ligadura del Conducto Biliar Común

Se utilizaron ratas Wistar hembras (180–220 g) y ratones Kunming (20–22 g) de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Shanghai Jiao Tong (No.SYXK2007-0025). El conducto biliar común (CBD) se ligó siguiendo el método de Lee con modificaciones menores [34]. Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital (25 mg kg⁻¹), se realizó una incisión abdominal media, se expuso el CBD y se colocaron dos suturas de nailon de 0,2 mm bajo el conducto, creando un segmento sellado que luego se seccionó. El día 14 post-ligadura se midieron bilirrubina sérica y AST para confirmar colestasis (Fig. 2e).

Inyección de Nanopartículas

Tras confirmar la ligadura exitosa, 12 ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de prueba (nanoplacas triangulares de plata, nanopartículas magnéticas, nanobarras de oro, nanoclústeres de oro) y un control salino. Las nanopartículas se suspendieron a 550 µg mL⁻¹ y sonicaron 1 min antes de inyección intravenosa (150 µL, vena caudal). Cinco ratones adicionales sin ligadura sirvieron como segundo control.

Procesamiento de Tejidos e Imagen

Siete días post-inyección, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron tejidos intestinales y gástricos. Secciones (5 µm) se fijaron en formaldehído 10 %, se incluyeron en parafina y tiñeron con hematoxilina-eosina para histología. Para análisis ultraestructural, los tejidos se fijaron en glutaraldehído 2,5 %, deshidrataron, incluyeron en resina epóxica y examinaron por TEM de alta resolución (FEI Tecnai G2 Spirit Biotwin). La excitación bifotónica (780 nm) se usó para visualizar nanobarras de oro en secciones tisulares mediante un sistema Caliper IVIS-100.

Cuantificación de Metales

Las heces se recolectaron diariamente durante 7 días, se pesaron y digirieron en agua regia. El contenido metálico se cuantificó por ICP-MS (Agilent 7500a). De igual modo, los tejidos intestinales se digirieron y analizaron para oro a fin de evaluar retención.

Modelo de Diarrea Inducida por Hierbas Chinas

Una mezcla de hoja de sen (10 g), ruibarbo (2 g) y fruto de cannabis (1 g) se hirvió en 100 mL agua, filtró y concentró a 0,3 g mL⁻¹. Los ratones recibieron 0,1 mL de este extracto o salino diariamente durante 7 días vía gavage oral para inducir diarrea.

Análisis de Células Caliciformes

Segmentos intestinales se incluyeron en OCT, seccionaron (8 µm) y tiñeron con Azul Alcian/Reactivo de Schiff para cuantificar densidad de células caliciformes y cavitación. Las imágenes se capturaron con microscopio invertido.

Resultados y Discusión

Síntesis y Caracterización de las Nanopartículas

Las nanoplacas triangulares de plata mostraron un pico SPR fuerte a 648,5 nm y distribución de tamaño estrecha (borde promedio 44,3 nm), confirmando síntesis exitosa (Fig. 1a–c). Nanopartículas magnéticas (20 nm) y nanoclústeres de oro (5 nm) se prepararon siguiendo protocolos establecidos [31–33]. Las nanobarras de oro exhibieron la resonancia de plasmón longitudinal esperada en la región del infrarrojo cercano.

Validación del Modelo de Ligadura CBD

La ligadura CBD produjo dilatación ductal marcada y aumento de TBIL y AST séricos respecto a controles sham (Fig. 2d–e), confirmando aislamiento efectivo de la ruta hepatobiliar e inducción de colestasis.

Impacto Histológico de las Nanopartículas

La tinción hematoxilina-eosina no reveló inflamación significativa ni daño epitelial en ningún grupo de prueba comparado con controles (Fig. 3). Esto indica que las nanopartículas administradas no comprometieron la integridad de la barrera intestinal.

Localización de Nanopartículas en Células Caliciformes

La imagen TEM demostró que las nanoplacas triangulares de plata estaban presentes dentro de GCs a lo largo del intestino delgado, íleon y colon, a menudo en estados agregados y dispersos (Fig. 4). Distribuciones similares se observaron para nanopartículas magnéticas, nanoclústeres de oro y nanobarras de oro (Archivo Adicional S4–S6). La agregación probablemente refleja concentraciones locales altas, mientras que la dispersión corresponde a menor carga.

La cuantificación ICP-MS de tejidos intestinales confirmó que los niveles metálicos fueron mayores en ratones con ligadura CBD que en controles, mientras que el contenido metálico fecal fue significativamente reducido en el grupo ligado, subrayando la contribución de GCs a la excreción (Fig. 8).

Mecanismo de Transporte a GCs

Las nanopartículas se detectaron dentro de eritrocitos circulantes y se observó que cruzaban la pared vascular hacia la lámina propia, donde entraban en GCs (Fig. 5). Esto sugiere que el tamaño y la química de superficie permiten difusión pasiva a través de membranas endoteliales hacia la capa mucosa.

Efecto de la Diarrea en la Excreción de Nanopartículas

El modelo de diarrea aumentó la densidad de células caliciformes y la proporción de células cavitadas (Fig. 6), correlacionándose con secreción acelerada de nanopartículas desde GCs. La imagen bifotónica de nanobarras de oro reveló menor retención tisular y mayor contenido fecal de oro en ratones diarreicos comparados con controles ligados (Fig. 7). Estos hallazgos demuestran que la motilidad gastrointestinal puede modular la vía de eliminación mediada por GCs.

Secreción Mediada por Células Parietales

Nanoclústeres de oro y nanoplacas de plata también se detectaron dentro de células parietales gástricas (PCs) (Fig. 9). Aunque la participación de PCs parece menor que la de GCs, estos datos sugieren que PCs pueden proporcionar una ruta de excreción adicional para ciertos tipos de nanopartículas.

Conclusiones

Nuestro estudio establece una vía previamente no reconocida, mediada por GCs y PCs, para la eliminación de un conjunto diverso de nanopartículas metálicas in vivo. Al ligar el CBD, aislamos esta ruta del HBS y demostramos que las nanopartículas son transportadas activamente desde la circulación hacia la luz intestinal vía GCs, con PCs contribuyendo a la excreción gástrica. Importante, la diarrea inducida por extracto de hierbas chinas acelera sustancialmente este proceso, resaltando el potencial de manipular la motilidad gastrointestinal para mejorar la eliminación de nanopartículas. Estos insights allanan el camino para el diseño más seguro de terapéuticos basados en nanopartículas, seguimiento in vivo mejorado y evaluaciones de bioseguridad más precisas.

Abreviaturas

CBD

Conducto biliar común

GCs

Células caliciformes

GNRs

Nanobarras de oro

HBS

Sistema hepatobiliar

PCs

Células parietales

TEM

Microscopía electrónica de transmisión

ICP-MS

Espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente