Nanopartículas de sílice decoradas con membranas de células cancerosas cargadas con miR495 y doxorrubicina para superar la resistencia a los fármacos para una terapia eficaz contra el cáncer de pulmón

Resumen

La terapia actual contra el cáncer suele sucumbir a muchas barreras extracelulares e intracelulares, entre las cuales la distribución no dirigida y la resistencia a múltiples fármacos (MDR) son dos dificultades importantes responsables del mal resultado de muchos sistemas de administración de fármacos (DDS). Aquí, en nuestro estudio, el dilema se abordó mediante el desarrollo de nanopartículas de sílice (SLI) recubiertas de membrana de células cancerosas (CCM) para coadministrar miR495 con doxorrubicina (DOX) para una terapia eficaz del cáncer de pulmón (CCM / SLI / R-D). Se suponía que el CCM homólogo de las células de cáncer de pulmón MDR (A549 / DOX) aumentaba la propiedad de localización del tumor del DDS para evitar las barreras extracelulares. Además, la MDR de las células cancerosas se superó mediante la regulación a la baja de la expresión de la glicoproteína P (P-gp) utilizando miR495. Se demostró que miR495 podría disminuir significativamente la expresión de P-gp que elevó la acumulación de fármaco intracelular en A549 / DOX. Los resultados in vitro e in vivo mostraron que CCM / SLI / R-D mostró un efecto terapéutico muy mejorado sobre A549 / DOX, que fue superior a la aplicación de miR495 o DOX solos. El efecto preferible de CCM / SLI / R-D sobre la conquista de la MDR en el cáncer de pulmón proporciona una alternativa novedosa para la quimioterapia eficaz de los cánceres con MDR.

Introducción

Estudios recientes están ofreciendo evidencias acumuladas de las correlaciones positivas entre la resistencia a múltiples fármacos (MDR) y el fracaso de la quimioterapia [1, 2]. Uno de los mecanismos más ampliamente reconocidos para MDR es el transportador de casete de unión a ATP (ABC), entre los cuales la glicoproteína P (P-gp) es la más estudiada [1, 3]. Se descubrió que la P-gp podía bombear eficazmente quimioterapéuticos intracelulares fuera de las células, lo que conducía a una reducción de la acumulación de fármaco intracelular, seguida de una reducción de la eficacia [4, 5]. La inhibición de la P-gp ha mostrado efectos beneficiosos sobre la superación de la MDR, que podría ser un objetivo potencial para combatir la MDR.

Los microARN (miARN) son un tipo natural de ARN no codificante. Sin embargo, el miARN muestra un papel importante en la regulación de la transfección celular y la expresión de proteínas [6]. Como resultado, se informó que la expresión de P-gp se ve afectada por varios miARN que dependen de los tipos de tumores [7]. Un estudio anterior ha revelado que miR495 podría regular negativamente de manera efectiva la expresión de P-gp en las células de cáncer de ovario y gástrico MDR [8]. Aquí, en este estudio, se empleó miR495 para explorar más a fondo su papel en la regulación de la P-gp en las células de cáncer de pulmón MDR.

Debido a las ventajas incomparables, como los efectos secundarios muy reducidos junto con una mayor biodisponibilidad, los sistemas de administración de fármacos (DDS) han crecido durante las últimas décadas y han sido reconocidos como la alternativa a los fármacos gratuitos en la administración de fármacos, especialmente en la terapia del cáncer [9,10 , 11,12]. Como resultado, el desarrollo de DDS multifuncional capaz de vencer las complicadas barreras extracelulares e intracelulares de la terapia del cáncer y al mismo tiempo adecuado para la carga de varios tipos de fármacos se está convirtiendo en el foco de investigación [13,14,15,16]. Las nanopartículas de sílice (SLI), como uno de los candidatos más ampliamente adoptados, tienen virtudes versátiles como su fácil preparación, alta capacidad de carga de fármacos y buena biocompatibilidad, y son nanoportadores preferibles. Naturalmente, SLI ha sido utilizado por muchos DDS como el nanoportador para lograr una eficacia satisfactoria [17, 18].

Sin embargo, los estudios preclínicos han revelado que la administración dirigida de DDS también es vital para el éxito de la terapia contra el cáncer. Para lograr un mejor efecto de direccionamiento, el enfoque adoptado más comúnmente es modificar los ligandos de direccionamiento en la superficie del DDS, que pueden unirse a los receptores correspondientes en la superficie de las células cancerosas [16, 19, 20]. Desde moléculas pequeñas (peso molecular por debajo de 1000 Da) hasta anticuerpos monoclonales (peso molecular por encima de 10 kDa), se ha informado que estos ligandos dirigidos se aplican con éxito al DDS [21, 22, 23]. Sin embargo, debido a la naturaleza ectogénica de algunos ligandos u otras razones, se produjeron efectos adversos como inmunorreacción y citotoxicidad. En los últimos años, las membranas plasmáticas celulares se están convirtiendo en otro material prometedor no solo para modificar la superficie de las nanopartículas, sino también para servir como un componente de dirección biocompatible. Sobre la base de la interacción entre la membrana de células cancerosas homólogas (CCM) con las células cancerosas, se ha demostrado que el CCM aumenta en gran medida la capacidad de localización de tumores del DDS [24, 25].

Con el fin de combinar la propiedad de localización tumoral de CCM y P-gp que se dirigen a miR495 en un DDS para la terapia de cóctel del cáncer de pulmón (seleccionado como cáncer modelo en nuestro estudio), en primer lugar se fabricó la amina SLI cargada positivamente y se precargó con doxorrubicina (DOX ). La amina SLI cargada con DOX se cargó posteriormente con miR495 para formar el núcleo de co-entrega (SLI / R-D). Finalmente, el SLI / R-D se decoró con CCM cargado negativamente (adquirido a partir de células A549 / DOX) para preparar un DDS de co-entrega y diana tumoral (CCM / SLI / R-D). Se esperaba que CCM pudiera guiar específicamente a CCM / SLI / R-D a la célula A549 / DOX homogénea para mejorar su efecto de direccionamiento tumoral y aumentar la captación intracelular. Mientras tanto, el miR495 lanzado puede superar el MDR de A549 / DOX y lograr un efecto anticancerígeno sinérgico con DOX.

Materiales y métodos

Materiales

Metil tiazolil tetrazolio (MTT), N - (2-aminoetil) -3-aminopropiltrimetoxisilano (AEAPS), ortosilicato de tetraetilo (TEOS), doxorrubicina (DOX) y Triton X-100 se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El miR495 fue proporcionado por Cell Biolabs Inc. (San Diego, CA, EE. UU.). Otros productos químicos y reactivos se obtuvieron de Aladdin Co., Ltd (Shanghai, China) y de analítica pura.

Cultivo celular y modelo animal

Las líneas celulares A549 (carcinoma de pulmón humano), A549 / DOX (línea celular resistente a DOX) y NIH3T3 (fibroblasto embrionario de ratón) se cultivaron en DMEM complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (v / v), penicilina (100%). U / mL) y estreptomicina (100 U / mL) en una incubadora de temperatura constante a 37 ° C que contiene 5% de CO ₂ . La A549 / DOX (línea celular resistente a DOX) se estableció incubando células A549 con una concentración gradualmente aumentada de DOX, como se informó [26]. Todas las líneas celulares se cultivaron en un protocolo estándar como se informó anteriormente [27]. Se obtuvieron ratones desnudos macho Balb / c (20 g) del Instituto de Modelo Animal de la Universidad de Wuhan (Wuhan, China) y se criaron con protocolos estándar. El modelo de xenoinjerto de tumor A549 / DOX se estableció basándose en el artículo anterior [28]. Todos los experimentos relacionados con animales fueron aprobados por el Comité de Ética institucional del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yet-sen.

Modelo de esferoide de tumor multicelular

El esferoide tumoral multicelular (MCTS) se estableció sobre la base de un informe anterior [29]. En resumen, se cubrió una placa de 96 pocillos (Corning, EE. UU.) Con solución de agarosa esterilizada en autoclave para crear una almohadilla de gel. Posteriormente, se sembraron células A549 / DOX y NIH3T3 (1:1) mezcladas en la placa y se incubaron para formar MCTS. La formación de MCTS se controló mediante microscopio óptico (CX 23, Olympus, Japón).

Preparación de CCM / SLI / R-D

La fabricación de la amina SLI se llevó a cabo en una microemulsión de agua en aceite basada en un informe anterior [30]. Brevemente, se fabricó una microemulsión de agua en aceite contenida en DOX a temperatura ambiente. Posteriormente, AEAPS, TEOS y NH ₄ Se añadieron sucesivamente OH para desencadenar la reacción. Después de reaccionar durante 24 h, la amina SLI cargada con DOX se precipitó usando una cantidad en exceso de etanol y se recogió mediante centrifugación (3000 rpm, 10 min).

El miR495 se disolvió en tampón HEPES y se añadió gota a gota a la solución acuosa de SLI de amina cargada con DOX en diversas relaciones peso / peso (p / p) con vórtice para obtener complejos binarios SLI / R-D [31].

El aislamiento de CCM de células A549 / DOX se llevó a cabo sobre la base de un informe anterior [32]. En resumen, las células A549 / DOX se recogieron y concentraron mediante centrifugación. Posteriormente, las células se dispersaron en tampón de extracción y se centrifugaron más (10,000 g , 10 min), seguida de una segunda ultracentrifugación (100.000 g , 60 min) para obtener finalmente el CCM. Todos los procedimientos se realizaron a 4 ° C. La concentración de proteína de CCM se cuantificó utilizando un kit BCA (Beyotime, Shanghai, China).

El recubrimiento de CCM sobre SLI / R-D utilizó un protocolo similar al de la unión de miR495. En resumen, se agregaron diferentes volúmenes de solución CCM a SLI / R-D (1 mg / mL) bajo vórtex. Finalmente, la mezcla se trató con sonicación tipo sonda (100 W, 5 min) y luego se centrifugó (10,000 g , 10 min) para obtener el CCM / SLI / R-D.

Caracterización

La distribución de tamaño y el potencial zeta de CCM / SLI / R-D fueron evaluados por un Zetasizer (ZS90, Malvern, Reino Unido). Además, se aplicó el microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEM1230, JEOL, Japón) para observar la morfología de los nanoportadores.

La capacidad de unión de SLI a miR495 se estudió mediante un ensayo de retardo en gel con miR495 desnudo como control. El SLI / RD formulado en varias proporciones p / p (0,2-25, SLI a miR495) se cargó en gel de agarosa al 2% que contenía Goldview (Solarbio Science &Technology Co., Ltd., Beijing) y se sometió a electroforesis en 0,5 × Tris-Borato. -Tampón EDTA (90 V, 60 min). La visualización de miR495 se realizó con el analizador Gel-Pro (Genegenius, Syngene, Reino Unido).

El tampón de lisis (Beyotime, Shanghai) se usó para extraer la proteína total de CCM, después de lo cual se usó el kit BCA para la cuantificación de la concentración. Luego, las muestras se transfirieron a una membrana de poli (fluoruro de vinilideno) (PVDF). Finalmente, la membrana se tiñó con los primeros anticuerpos correspondientes (Abcam, EE. UU.) Y los segundos anticuerpos (Abcam, EE. UU.). Para la visualización se utilizó el densitómetro (E-Gel Imager, Thermo-Fisher, EE. UU.).

El contenido de carga de fármaco (DLC) de CCM / SLI / R-D se determinó haciendo emerger los nanoportadores preparados en metanol durante 48 h. Las muestras se centrifugaron (10.000 rpm, 30 min) y los sobrenadantes se recogieron para la determinación de DOX mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) [33]. La carga de miR495 se determinó mediante absorbancia UV a 260 nm (UV5Nano, METTLER TOLEDO, Suiza).

Los cambios de tamaño de partícula de CCM / SLI / R-D en PBS y plasma de ratón se registraron en cada punto de tiempo dentro de las 48 h. El perfil de liberación de DOX de CCM / SLI / R-D se investigó según el informe anterior [34].

Transfección intracelular

Se sembraron células A549 / DOX en placas de 6 pocillos durante 24 hy luego se cultivaron con CCM / SLI / miR495 (concentraciones de miR495, 1–25 ng / ml) durante 48 h. Posteriormente, las células se separaron, se recolectaron y se sometieron a análisis de transferencia Western de la expresión de P-gp.

La concentración intracelular de fármaco se determinó de acuerdo con un informe anterior [23]. En resumen, después de tratar con CCM / SLI / miR495 durante diferentes intervalos de tiempo, las células A549 / DOX se incubaron con DOX. A intervalos de tiempo predeterminados (4 y 8 h), las células se separaron, recolectaron y dispersaron en 5 mL de solución extractora de DOX (etanol 0.6 M HCl, 1:1, v / v), seguido de ultrasonidos a 400 W en baño de hielo. por 40 veces. La mezcla se dejó a 4 ° C durante 24 hy se centrifugó a 12.000 rpm (4 ° C) durante 10 min. El sobrenadante se recogió y se sometió a la medición del contenido de DOX como se describe anteriormente.

Viabilidad celular

El efecto de citotoxicidad de los nanoportadores sin fármaco (10-200 μg / ml) y CCM / SLI / RD (concentración de DOX, 2-50 μM; la concentración de miR495, 10-250 nM; la relación molar entre DOX y miR495 se fijó en 200) en células A549 / DOX durante 48 h se determinó mediante ensayo de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT). Las variaciones de nivel de las proteínas relacionadas con la apoptosis también se determinaron mediante el ensayo de transferencia Western.

Se incubó MCTS con diámetros de 300 a 400 μm con el medio que contenía diferentes formulaciones (concentración de DOX, 25 μM) a 37 ° C durante 5 días. Se utilizó un microscopio óptico para registrar los cambios de diámetro de MCTS.

Orientación in vitro e in vivo de CCM / SLI / R-D

Se adoptó el ARNip marcado con FAM para construir el DDS. Se sembraron células A549 / DOX en placas de 6 pocillos durante 24 h. Luego, las células se incubaron con un exceso de CCM durante 2 h, y se añadieron SLC / siRNA y CCM / SLC / siRNA. En los intervalos de tiempo establecidos, las células se recolectaron y se determinaron mediante un citómetro de flujo (FCM, FC500MCL, Beckman Coulter) para su cuantificación.

Se adoptó el miR495 marcado con Cy5 para construir el DDS. Los ratones que portaban el tumor A549 / DOX fueron i.v. inyectado con SLI / miR495 y CCM / SLI / miR495, y la distribución de miR495 se controló a intervalos de tiempo predeterminados utilizando un sistema de imágenes en tiempo real (ZEWTON 7.0, Vilber, Francia). Después de la administración durante 12 h, se obtuvieron los tumores y los órganos principales de los ratones sacrificados y se tomaron imágenes utilizando el mismo sistema para el análisis analítico.

Ensayo anticáncer in vivo

Se evaluó el ensayo anticanceroso in vivo de CCM / SLI / R-D utilizando ratones portadores de tumores A549 / DOX. En detalle, los ratones se dividieron aleatoriamente en 5 grupos ( n =6):(1) solución salina (como control), (2) DOX libre, (3) CCM / SLI / DOX, (4) CCM / SLI / miR495 y (5) CCM / SLI / R-D. Posteriormente, a los ratones se les administraron por vía intratumoral las formulaciones a la dosis de 5 mg / kg de DOX y 0,25 mg / kg de miR495 durante 7 veces en 14 días. Los volúmenes de los tumores y los pesos corporales de los ratones de cada grupo se determinaron cada 2 días.

Resultados y discusión

Preparación de CCM / SLI / R-D

Para lograr una buena capacidad de carga de fármaco y biocompatibilidad en un DDS, se utilizó la hidrólisis sincrónica de TEOS y AEAPS en la microemulsión de agua en aceite para la fabricación de SLI. DOX fue pre-atrapado en la matriz de SLI durante la fabricación. Como se muestra en la Fig. 1a, el resultado de la dispersión dinámica de la luz (DLS) demostró que la amina SLI cargada con DOX tenía un diámetro de ~ 100 nm. La imagen de TEM reveló además que las nanopartículas tenían forma esférica con una distribución estrecha, lo que estaba en línea con los resultados obtenidos por DLS.

un Cambios de tamaño y potencial zeta de SLI / R-D en diferentes proporciones p / p. b El ensayo de unión a miARN de complejos binarios SLI / R-D en varias proporciones p / p. Los datos se muestran como media ± DE ( n =3)

La amina SLI cargada con DOX tenía un potencial de superficie de 26,83 mV, lo que resultó beneficioso para servir como portador de miR495. Según un informe anterior [31], el ensamblaje de miR495 y SLI para formar complejos binarios fue impulsado por la interacción electrostática. El p / p SLI a miR495 en los complejos binarios ejerce un impacto significativo en la eficiencia de transfección final. Como se muestra en la Fig.1a, debido al hecho de que miR495 es una macromolécula cargada negativamente, a una relación p / p baja de SLI a miR495, los complejos binarios han mostrado una carga superficial negativa con un tamaño de partícula significativamente mayor, lo que podría deberse a la adhesión de nanopartículas vecinas. Sin embargo, con el incremento de la relación p / p, la carga superficial de los complejos binarios gradualmente se volvió positiva con un tamaño de partícula estable observado alrededor de 100 nm. Se demostró que cuando la relación p / p alcanzó 20, tanto el tamaño de partícula como el potencial de superficie de los complejos binarios permanecieron estables sin cambios significativos con el aumento de la relación p / p.

Las capacidades de unión y protección de los nanoportadores a miR495 son vitales para la entrega de genes. La capacidad de unión a miR495 de SLI se evaluó mediante un ensayo de retardo en gel. Como se muestra en la Fig. 1b, miR495 desnudo no mostró retardo mientras que la adición de SLI cambió significativamente el comportamiento de miR495. Se observó que SLI mostró una creciente capacidad de unión de miR495 con el incremento de la relación p / p, lo que logró un retardo completo de miR495 en la relación p / p de 5.

En resumen, se infirió que los complejos binarios en la relación p / p de 20 con el tamaño de partícula adecuado y la carga superficial deseable, así como la propiedad eficaz de unión y protección de miR495, fueron la formulación óptima que se seleccionó como modelo a realizar. los siguientes experimentos.

Luego, exploramos la proporción óptima de proteína CCM a los complejos binarios mezclando CCM con complejos binarios en diferentes proporciones de masa (SLI a proteína CCM, p / p). La relación óptima se determinó por el tamaño de partícula resultante y la carga superficial en diferentes condiciones. Como se muestra en la Fig. 2a, la adición de CCM (carga negativa) dio como resultado una fluctuación significativa en el tamaño del producto pero una disminución continua en la carga superficial. Los resultados indicaron que CCM se ancló con éxito en la superficie de complejos binarios. Más importante aún, se observó que tanto el tamaño de partícula como la carga superficial de CCM / SLI / R-D alcanzaron una meseta en la relación de masa de 7.5 y que el CCM adicional mostró un impacto insignificante en las cargas superficiales y solo un leve aumento en el tamaño. Para ser específicos, el diámetro de la nanopartícula alcanzó 121.28 ± 3.36 nm y el potencial zeta cambió a - 28.04 ± 2.64 mV, que era similar a la carga superficial de CCM libre (- 27.95 ± 3.06 mV), lo que sugiere que la decoración de CCM alcanzó la saturación en esta condición. Como resultado, se seleccionó CCM / SLI / R-D en la proporción de masa de 7.5 como la formulación del modelo para realizar los siguientes experimentos.

un Cambios de tamaño y potencial zeta de CCM SLC / R-D en diferentes proporciones p / p. La imagen insertada fue un análisis de perno occidental de las tres proteínas representativas en CCM y CCM / SLI / R-D. b La distribución de tamaño y TEM de CCM / SLI / R-D. Los datos se muestran como media ± DE ( n =3). Barras de escala 100 nm

Caracterización de CCM / SLI / R-D

Informes anteriores han demostrado que las proteínas en CCM son capaces de albergar las células tumorales homólogas cuando se adoptan para modificar nanopartículas [35, 36]. Por lo tanto, se seleccionaron tres proteínas de membrana (Na-K ATPasa, AT1R y CXCR4) y se compararon sus niveles de expresión en CCM con CCM / SLI / R-D. Como se muestra en la imagen insertada de la Fig.2a, la cantidad de las tres proteínas en CCM mostró una intensidad similar a la de CCM / SLI / RD, lo que demostró que las proteínas integradas en CCM se heredaron a CCM / SLI / RD después del recubrimiento y la La pérdida o degradación fue insignificante durante este proceso. Este resultado también proporcionó evidencia sólida para confirmar la construcción exitosa de CCM / SLI / R-D, que fue beneficiosa para aumentar la localización tumoral de CCM / SLI / R-D.

La distribución de tamaño y la morfología de CCM / SLI / R-D también se estudiaron utilizando DLS y TEM. Como se muestra en la Fig.2b, DLS reveló que CCM / SLI / RD se distribuyó estrechamente a alrededor de 120 nm, mientras que TEM mostró que CCM / SLI / RD se caracterizó por tener una estructura de cáscara de núcleo esférico y una bicapa lipídica se podía observar claramente en la superficie capa.

La DLC de DOX en CM / SLI / R-D (determinada por HPLC) podría ser tan alta como 17,96%, y la carga de miR495 (determinada por espectrofotómetro UV) podría ser tan alta como 1,64%.

Estudios anteriores han concluido varios requisitos preliminares para la administración segura de moléculas de fármacos. En primer lugar, el DDS adoptado debe mantenerse estable sin variaciones de tamaño dramáticas en entornos fisiológicos, ya que el tamaño de partícula contribuyó a una importancia crítica para el destino in vivo del sistema [10, 37]. Como resultado, se investigó la estabilidad dependiente del tiempo de CCM / SLI / R-D. Para determinar la estabilidad coloidal de CCM / SLI / R-D en entornos fisiológicos, se registraron los cambios de tamaño de DDS en PBS (pH 7,4) y plasma de ratón hasta 48 h. Como se muestra en la Fig. 3a, CM / SLN / Ce6 podría mantener efectivamente su tamaño durante todo el rango de prueba sin variaciones significativas. Por lo tanto, se concluyó que CCM / SLI / R-D era capaz de mantenerse estable en condición fisiológica. Como se muestra en la Fig.3b, el CCM / SLI / RD podría preservar la estabilidad en condiciones extracelulares (el 32,76% de los fármacos se liberan después de 120 h de incubación), lo que indica que durante el proceso de administración, el CCM / SLI / RD podría encapsular de forma segura el molécula de fármaco cargada sin inducir efectos adversos potenciales. Lo más importante es que, al entrar en las células y someterse al ambiente ácido de las células cancerosas, los fármacos se liberaron fácilmente (75,93%), lo que podría atribuirse a la alta concentración de hidrógeno que debilita la combinación del fármaco y los portadores [6, 38].

un Estabilidad coloidal de LCC / R-A en PBS (pH 7,4) y plasma de ratón a 37 ° C durante hasta 48 h. b Perfiles de liberación de fármacos de DOX del LCC / R-A en medios de liberación en condiciones extracelulares e intracelulares de pH (7,4 y 5,5). Los datos se muestran como media ± DE ( n =3)

Transfección intracelular

Para revelar la relación entre la transfección de miR495 y la expresión de P-gp, las células A549 / DOX se transfectaron con diferentes concentraciones de miR495. Posteriormente, se determinó el nivel de expresión de P-gp en estas células usando un ensayo de transferencia Western. Como se muestra en la Fig.4a, la expresión de P-gp mostró una relación negativa con la concentración de miR495, lo que sugiere que CCM / SLI podría aplicarse como una herramienta útil para la entrega de miR495, lo cual es beneficioso para que CCM / SLI / RD revierte la MDR en celdas A549 / DOX. Como prueba de concepto, se estudió más a fondo el efecto de la transfección de miR495 sobre la variación de la acumulación intracelular de DOX. Después de tratarse con CCM / SLC / ARNip durante 48 o 72 h (Fig. 4b), las células A549 / DOX se trataron con DOX durante intervalos de tiempo variados. Como se muestra en la Fig.5d, con el pretratamiento CCM / SLC / siRNA durante 48 h, la fluorescencia celular de DOX en células A549 / DOX aumentó 1,49 veces (4 h después de la incubación) y 1,47 veces (8 h después de la incubación) , respectivamente. Con el pretratamiento CCM / SLC / siRNA durante 72 h, la fluorescencia intracelular de DOX en células A549 / DOX aumentó 1,63 veces (4 h después de la incubación) y 1,85 veces (8 h después de la incubación). Como resultado, se concluyó que CCM / SLC / siRNA podría superar el MDR en A549 / DOX aumentando la acumulación intracelular de DOX en comparación con las células no tratadas.

un Relación entre la concentración de miR495 y la expresión de proteínas P-gp en células A549 / DOX después de ser tratadas con CCM / SLI / miR495 durante 48 h. b La acumulación intracelular de DOX en células A549 / DOX después de ser tratadas con LCC / miR495 durante diferentes intervalos de tiempo. Los datos se muestran como media ± DE ( n =3)

Viabilidad de las células A549 / DOX tratadas con un vehículo sin fármaco ( a ) o medicamento que contenga ( b ) diferentes formulaciones a diferentes concentraciones de nanopartículas / fármaco durante 48 h. c Ensayos de Western blot de la expresión de las proteínas caspasa-3, citocromo C y bcl-2 tras diferentes tratamientos. Los datos se muestran como media ± DE ( n =3). ^** P <0.01

Ensayo anticáncer in vitro

Se estudió la citotoxicidad del vehículo sin fármaco (CCM / SLI) para revelar aún más la biocompatibilidad del DDS. Como se muestra en la Fig.5a, después de incubar con CCM / SLI durante 48 h a la concentración más alta de 200 μg / mL, el A549 / DOX todavía mostró más del 90% de viabilidad, lo que sugirió que CCM / SLI era biocompatible con una toxicidad insignificante a las celdas.

Posteriormente, se evaluó el ensayo anticáncer in vitro. Como se muestra en la Fig. 5b, los efectos anticancerígenos de todas las formulaciones se relacionaron positivamente con las concentraciones de fármaco. En detalle, la viabilidad de las células A549 / DOX era todavía del 72,6% a la concentración más alta de DOX (50 μM). El CCM / SLI / DOX y CCM / SLI / miR495 bajo la misma condición lograron una viabilidad celular similar de la cual fue 59,4% y 63,3%, respectivamente, que fue superior a la de DOX. Sin embargo, se observó que la viabilidad celular para el tratamiento con CCM / SLI / R-D se redujo significativamente al 38,5%. Además, el índice de CI en CCM / SLI / R-D se determinó como 0,84, lo que sugiere un fuerte efecto sinérgico de miR495 y DOX en la destrucción de células A549 / DOX.

Para verificar nuevamente la conclusión, las proteínas reguladoras de la apoptosis comúnmente adoptadas (caspasa-3, bcl-2 y citocromo-3) se evaluaron en diferentes formulaciones. Como se demuestra en la Fig.5c, la cantidad de caspasa-3 escindida fue la más alta en las células tratadas con CCM / SLI / RD y el nivel de bcl-2 (supresor de apoptosis) fue el más bajo entre todos los grupos de prueba, lo que confirma aún más el anticancerígeno preferido eficacia de CCM / SLI / RD. Además, el CCM / SLI / R-D mostró una expresión muy elevada del citocromo-3, lo que sugirió que la apoptosis en este grupo estaba relacionada con el daño de las mitocondrias.

El MCTS se adoptó para imitar un tumor sólido y para evaluar el efecto anticanceroso de diferentes formulaciones. Como se muestra en la Fig. 6a, el volumen de MCTS en el grupo DOX libre crece de manera persistente durante todo el período del experimento, lo que sugiere que la MDR en A549 / DOX podría disminuir significativamente la citotoxicidad de DOX. Los sistemas de administración única (SLI / DOX y SLI / miR495) mostraron cierto efecto de supresión con un crecimiento levemente disminuido. Más importante aún, la combinación de miR495 y DOX en CCM / SLI / R-D mostró una eficacia muy elevada con un crecimiento de volumen negativo observado al final de la prueba. La imagen óptica de la Fig. 6b también llegó a conclusiones similares.

El volumen cambia ( a ) y las imágenes ópticas correspondientes ( b ) de MCTS después de diferentes tratamientos. Los datos se muestran como media ± DE ( n =3). ^** P <0.01

Orientación in vitro e in vivo

Para revelar las posibles razones del efecto antitumoral discriminativo de varias formulaciones, se evaluó la captación celular para investigar si la modificación de CCM podría aumentar positivamente la capacidad de internalización de la nanopartícula en las células A549 / DOX, ya que muchos estudios han demostrado que la modificación de la superficie de CCM puede mejorar el tumor. -capacidad de focalización de los nanoportadores [39, 40]. Como se muestra en la Fig. 7a, la intensidad de la fluorescencia intracelular aumentó en el grupo CCM / SLI / miR49 y SLI / miR495 en función del tiempo, lo que sugiere la relación positiva entre el tiempo y la captación celular en ambas nanopartículas. Además, se observó que se observaron señales de fluorescencia más altas en el grupo CCM / SLI / miR495, que fue 1,58 veces mayor que en el grupo SLI / miR495 en el punto de tiempo de 6 h. Para verificar si la captación de CCM / SLI / miR495 fue a través de la endocitosis mediada por CCM, las células se incubaron con un exceso de CCM antes de la adición de nanoportadores. Se observó que la intensidad de fluorescencia en el grupo CCM / SLI / miR495 continuó disminuyendo, mientras que la intensidad de fluorescencia en el grupo SLI / miR495 permaneció casi al mismo nivel. Estos resultados demostraron que las células absorbieron CCM / SLI / miR495 a través de la endocitosis relacionada con CCM.

un Análisis cuantitativo de la absorción intracelular dependiente del tiempo de diferentes formulaciones en células A549 / DOX (pretratadas con / sin CCM). b Intensidad de fluorescencia media de tumores disecados y órganos principales de ratones tratados con SLI / R-A y CCM / SLI / R-A 48 h después de la inyección. Los datos se expresaron como media ± DE ( n =3). ^** P <0.01

Se esperaba que el CCM de A549 / DOX mejorara la capacidad de direccionamiento tumoral de CCM / SLI / R-D a células A549 / DOX isógenas para aumentar la acumulación de nanoportadores en el tumor. Para verificar nuestro concepto, la distribución de SLI / R-D y CCM / SLI / R-D fue monitoreada por un sistema de imágenes en tiempo real. Como se muestra en la Fig. 7b, como se esperaba, CCM / SLI / R-D mostró más acumulación dentro del tumor en comparación con SLI / R-D. Además, se concluyó que SLI / R-D se distribuyó en casi todos los órganos (excepto el corazón) con foco en el hígado y el bazo, lo que podría deberse a su pobre capacidad de localización tumoral. Por el contrario, la modificación de CCM podría aliviar significativamente la captura del hígado para ayudar a mejorar la localización de la carga cargada en el tejido tumoral.

Eficacia antitumoral in vivo

Se realizó la eficacia antitumoral in vivo de CCM / SLI / R-D. Después del tratamiento con DOX o SLI / DOX, el crecimiento tumoral de los ratones se ralentizó. Sin embargo, CCM / SLI / R-D tuvo la mejor eficacia antitumoral y resultó en un volumen tumoral obviamente reducido de 303 ± 25 mm ³ . Además, el resultado de la variación del peso corporal de los ratones en diferentes grupos también mostró resultados interesantes (Fig. 8). Mostró que no hubo una disminución obvia del peso corporal en los ratones tratados con CCM / SLI / R-D, lo que sugiere que la capacidad de direccionamiento tumoral de CCM / SLI / R-D podría mejorar la eficacia antitumoral con efectos adversos reducidos. Por el contrario, la distribución no dirigida de DOX libre provocó una toxicidad sistemática en los ratones, que se reflejó en la disminución gradual del peso corporal en función del tiempo. En resumen, el CCM / SLI / R-D fue un DDS de localización de tumores superior para la terapia de tumores de pulmón.

The tumor volume (a ) and body weight (b ) of tumor tissue analysis of A549/DOX tumor-bearing Balb/c nude mice after intratumoral administration of different formulations. Data were expressed as mean ± SD (n =6). ^** P <0.01

Conclusión

In summary, we successfully constructed a CCM-coated SLI nanoparticle as a DDS to co-delivery miR495 and DOX (CCM/SLI/R-D). The characterization demonstrated that CCM/SLI/R-D showed well distribution with a diameter of 120 nm, which showed high stability as well as pH-responsive drug release. Cellular experiments revealed that CCM/SLI/R-D could realize preferable miR495 delivery which achieved the significant downregulation of P-gp, which finally overcome the MDR in A549/DOX by increasing the intracellular DOX accumulation compared to untreated cells. The CCM/SLI/R-D showed promising tumor-homing capability. Most importantly, the synergetic effect of miR495 and DOX achieved much more potent anticancer effect to mono-delivery DDS or free DOX both in vitro and in vivo.

Disponibilidad de datos y materiales

Los datos y el análisis del trabajo actual están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

Abreviaturas

AEAPS:: N -(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane
CCM:: Cancer cell membrane
DDS:: Drug delivery systems
DLC:: Drug loading content
DOX:: Doxorrubicina
HPLC:: Cromatografía líquida de alto rendimiento
MCTS:: Multicellular tumor spheroid
MDR:: Resistencia a múltiples fármacos
miRNA:: MicroRNAs
MTT:: Metil tiazolil tetrazolio
P-gp:: Glicoproteína P
SLI:: Silica
TEOS:: Tetraethyl orthosilicate

Síntesis hidrotermal de cuasi-cubos de Co3O4 asistida por albúmina de huevo como material de electrodo superior para supercondensadores con excelentes rendimientos Caracterización y preparación de carbono nanoporoso derivado de tallos de cáñamo como ánodo para baterías de iones de litio

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