Nanopartículas de Oro Modulan Actividad CYP3A4 y Toxicidad Celular en Carcinoma Hepatocelular Humano: Influencia de Tamaño, Química Superficial y Corona Proteica

Resumen

Investigamos cómo nanopartículas oro (AuNP) 40- y 80-nm funcionalizadas con polietilenoimina ramificada catiónica (BPEI), ácido lipoico aniónico (LA), o polietilenglicol neutro (PEG) interactúan con línea celular carcinoma hepatocelular humano (HCC) C3A, tanto en presencia como ausencia corona proteica plasma humano (PC). AuNP desnudas, excepto 80-nm LA-AuNP, fueron citotóxicas a células C3A, pero PC mitigó significativamente estos efectos. Captación celular dependiente tiempo aumentó para 40-nm BPEI-AuNP, mientras PC redujo captación 80-nm PEG-AuNP. BPEI-AuNP elicité respuestas biphasicas estrés oxidativo/nitrosativo, mientras PEG-AuNP actuó como potente antioxidante. Todas AuNP desnudas inhibieron actividad CYP3A4 independientemente tamaño o carga superficial, pero PC restauró actividad excepto PEG-AuNP. 40-nm PEG-AuNP indujo cambios expresión génica afectando principalmente β-oxidación ácidos grasos mitocondrial y, menor medida, transportadores hepaticos entrada/salida. Estos hallazgos profundizan comprensión interacciones AuNP-célula y sus fundamentos moleculares en HCC, ofreciendo insights para estrategias terapéuticas mejoradas.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (HCC) sigue siendo uno de los cánceres más prevalentes mundialmente y causa de mortalidad por cáncer de más rápido crecimiento en EE. UU. Opciones curativas actuales —trasplante hepático o resección quirúrgica— limitadas a enfermedad etapa temprana, mientras tumores avanzados dependen quimioterapia o radioterapia, ambas con baja selectividad y toxicidad sistémica significativa. Terapias silenciamiento génico, particularmente interferencia RNA (RNAi), prometen mayor especificidad, pero entrega eficiente requiere vectores penetren células objetivo seguramente. Mientras vectores virales ofrecen alta eficiencia transducción, plataformas no virales como nanopartículas (NP) preferidas por su perfil seguridad y propiedades fisicoquímicas ajustables. Nanopartículas oro (AuNP) especialmente atractivas por su fácil modificación superficial y características ópticas, permitiendo entrega dirigida cargas terapéuticas. Sin embargo, al entrar torrente sanguíneo, AuNP adquieren corona proteica (PC) que altera su química superficial y consecuentemente su destino biológico, incluyendo captación celular y toxicidad. Entender cómo tamaño NP, carga superficial, y PC modulan respuestas celulares en células HCC es esencial para diseñar nanomedicinas seguras y efectivas.

Metodología

Síntesis Nanopartículas Oro

AuNP 40- y 80-nm fabricadas a medida por nanoComposix (San Diego, CA). Funcionalización con BPEI, LA, o PEG lograda vía química EDC, conjugación ácido dihidrolipoico, o PEGilación tiol-metoxilo, respectivamente. Tamaño, índice polidispersidad (PDI), potencial zeta confirmados dispersión luz dinámica (DLS), microscopía electrónica transmisión (TEM), espectroscopía UV-Vis. AuNP purificadas por filtración flujo tangencial (TFF) y filtradas estéril.

Preparación Corona Proteica

Plasma humano (n=5) Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) mezclado con AuNP 55 % (v/v) incubado 37 °C, 250 rpm 1 h. Proteínas débilmente unidas removidas lavados PBS repetidos (20 000 × g, 20 min). Resultantes AuNP recubiertos PC resuspendidos PBS y luego diluidos medio cultivo celular.

Caracterización Fisicoquímica AuNP

Diámetros hidrodinámicos (D_H), PDI, potencial zeta AuNP desnudas y recubiertas PC medidos agua DI, PBS, EMEM completo (10 % FBS) 25 °C y 37 °C (0 y 24 h). Espectros absorción óptica registrados temperatura ambiente.

Microscopía Electrónica Transmisión

Morfología AuNP evaluada TEM (Tecnai G2 Spirit BioTWIN, 120 kV). Muestras depositadas mallas cobre 200-mesh y secadas aire.

Cultivo Celular y Medición Viabilidad

Células C3A (ATCC CRL-10741) cultivadas EMEM + 10 % FBS, sembradas 8 × 10⁴ células/pocillo (placas 96-pocillos), permitidas adherir 48 h antes dosificación. Viabilidad medida usando ensayo alamarBlue® tras 24 h exposición concentraciones AuNP 0-250 µg/cm².

Medición Captación Celular ICP-MS

Células tratadas 1,56 µg/cm² AuNP 0,5-24 h. Tras paso grabado remover partículas unidas superficie, células digeridas agua regia, Au intracelular cuantificado ICP-MS. Captación expresada AuNP por célula.

Mediciones Estrés Oxidativo/Nitrosativo

Producción ROS/RNS cuantificada usando kit ensayo total ROS/SO (Enzo Life Sciences) 1, 3, 24 h tras exposición 40-nm BPEI- y PEG-AuNP hasta 125 µg/cm².

Actividad Citocromo P450 3A4

Actividad CYP3A4 evaluada ensayo P450-Glo™ (Promega) tras 24 h exposición concentraciones LC₅₀ cada tipo AuNP. Luminiscencia normalizada controles vehículo.

Perfil Expresión Génica

Dado efectos pronunciados 40-nm PEG-AuNP, células C3A expuestas su LC₅₀ (129,5 µg/cm²) 24 h. RNA total (RIN ≥ 7,8) aislado, retro-transcrito, analizado arrays PCR Human Molecular Toxicology Pathway Finder y Human Drug Transporters RT² Profiler™ (Qiagen). Genes diferencialmente expresados (|cambio fold| > 2, p < 0,05) validados qRT-PCR nueve genes representativos.

Análisis Estadístico

Valores LC₅₀ ajustados ecuación Hill pendiente variable GraphPad Prism. ANOVA unidireccional (SAS 9.4) seguido prueba HSD Tukey evaluó significancia (p < 0,05).

Resultados y Discusión

Caracterización Fisicoquímica AuNP Desnudas y Recubiertas PC

Como muestra Figura 1, TEM confirmó AuNP monodispersas tamaños coincidiendo nominales 40 y 80 nm. Formación PC indujo aumento modesto D_H y desplazamiento rojo pico plasmón UV-Vis, indicando adsorción proteína. En EMEM completo, D_H y PDI permanecieron estables 24 h, excepto PC-BPEI-AuNP, que mostró disminución transitoria PDI, sugiriendo estabilidad coloidal mejorada. Potenciales zeta desplazaron valores neutros tras recubrimiento PC, reflejando enmascaramiento cargas superficiales por proteínas.

Citotoxicidad AuNP

Valores LC₅₀ AuNP desnudas variaron 127,3-205,5 µg/cm² (Figura 2a). Todas 40-nm BPEI-, LA-, PEG-AuNP, así como 80-nm BPEI-AuNP, fueron citotóxicas, mientras 80-nm LA-AuNP no mostró toxicidad significativa. PC redujo marcadamente citotoxicidad mayoría tipos AuNP, excepción 80-nm BPEI-AuNP, que retuvo 51 % viabilidad 250 µg/cm² (Figura 2b). Estos hallazgos alinean trabajos previos mostrando atenuación mediada PC toxicidad AuNP hepatocitos primarios y otras líneas celulares.

Captación Intracelular AuNP

Análisis captación dependiente tiempo (Figura 3) revelaron 40-nm BPEI-AuNP acumularon rápidamente, pico 6 h antes declinar. En contraste, PC atenuó captación 40- y 80-nm BPEI- y LA-AuNP pero mejoró internalización 80-nm PEG-AuNP. Estas tendencias consistentes literatura indicando PC puede obstaculizar o promover entrada NP dependiendo tamaño NP, química superficial, y tipo celular.

Mediciones Estrés Oxidativo y Nitrosativo

Ambos tipos AuNP indujeron ROS/RNS manera dependiente tiempo y concentración (p < 0,0001). Altas concentraciones 40-nm BPEI-AuNP produjeron respuesta bifásica: efecto antioxidante inicial 1 h, seguido aumento pronunciado pro-oxidante 3 h en adelante. En contraste, 40-nm PEG-AuNP consistentemente suprimió producción ROS/RNS (cambio fold < 0,5) todos puntos tiempo, sugiriendo papel antioxidante protector (Figura 4).

Medición Actividad CYP3A4

Todas AuNP desnudas (40- y 80-nm BPEI, LA, PEG) inhibieron actividad CYP3A4 a 20-31 % niveles control a concentraciones LC₅₀ (Figura 5). Concentraciones no tóxicas 80-nm LA- y PEG-AuNP también suprimieron actividad (~30 %). PC restauró largely actividad CYP3A4 todos AuNP excepto PEG-AuNP, que retuvo 63 % y 46 % actividad para partículas 40- y 80-nm, respectivamente. Estos resultados corroboran reportes previos inhibición CYP3A4 mediada AuNP vía interacción directa enzima o bloqueo bolsillo sustrato.

Perfil Expresión Génica Enfocado Vías Toxicidad 40-nm PEG-AuNP

Análisis array génico identificó 212 genes diferencialmente expresados (186 down-regulados, 26 up-regulados) a LC₅₀ 40-nm PEG-AuNP (Figura 6). Notablemente, 12,3 % estos genes involucraron β-oxidación ácidos grasos mitocondrial, con enzimas clave (ACAD11, ACAD9, ACADM, ACADS, ACAA1, ACAA2, DECR1, ECHS1, EHHADH, HADHA) marcadamente suprimidas (cambio fold 2-18). La down-regulación enzimas β-oxidación indica producción NADH/FADH₂ deteriorada, comprometiendo ciclo TCA y síntesis ATP, sello disfunción mitocondrial observada hepatocitos tratados AuNP.

Genes apoptosis (CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A/B, TNFSF10) up-regulados, mientras genes anti-apoptóticos (AKT1, BCL2, MCL1, XIAP) down-regulados, consistente con citotoxicidad dependiente daño DNA y reparación checkpoints (CHEK1/2, ERCC1/2/3, LIG4) mostraron regulación mixta, sugiriendo integridad genómica deteriorada. Proteínas shock térmico (HSPA1A/B) up-reguladas, mientras subfamilias HSP40/90/60 down-reguladas, reflejando respuesta estrés compleja. Genes antioxidantes (GPX1/2/4, PRDX1/2/6, SOD1, CAT) inducidos, mientras genes pro-oxidantes (TXNIP, PPP1R15B) suprimidos, alineando fenotipo antioxidante PEG-AuNP.

Perfil Expresión Génica Transportadores Entrada/Salida Fármacos

Modulación PC transportadores fármacos subraya implicaciones farmacocinéticas potenciales. De 35 genes transportadores examinados, 12 transportadores ABC down-regulados (ej. ABCB1, ABCC2/3/4, ABCG2/8, ABCA1) y 21 transportadores SLC suprimidos (ej. SLC31A1, SLC22A9). Inversamente, MDR4 (ABCB4) y transportador ABC mitocondrial (ABCB6) up-regulados, indicando respuesta compensatoria exposición nanopartículas. Estos cambios pueden influir concentración intracelular quimioterapéuticos y requieren consideración cuidadosa terapias combinación.

Validación PCR tiempo real nueve genes seleccionados confirmó resultados array, reforzando fiabilidad datos transcripcionales.

Conclusiones

Este estudio demuestra que química superficial AuNP y presencia corona proteica plasma humano dictan críticamente su citotoxicidad, captación celular, perfil estrés oxidativo, inhibición CYP3A4, y cambios expresión génica en células C3A HCC. BPEI- y LA-AuNP desnudas altamente citotóxicas, mientras PEG-AuNP exhibió propiedades antioxidantes pero aún suprimió actividad CYP3A4. PC mitigó largely toxicidad e inhibición CYP3A4, excepto PEG-AuNP, que retuvo efectos significativos. Análisis expresión génica 40-nm PEG-AuNP reveló down-regulación predominante enzimas β-oxidación ácidos grasos mitocondrial, up-regulación genes pro-apoptóticos, y modulación extensa transportadores fármacos, proveyendo insight mecanismos potenciales hepatotoxicidad e interacciones fármaco-nanopartícula. Estos hallazgos subrayan importancia considerar formación corona proteica y funcionalización superficial al diseñar terapéuticas basadas AuNP para HCC.

Abreviaturas

ANOVA:

Análisis varianza unidireccional

AuNP:

Nanopartículas oro desnudas: sin PC

BPEI:

Polietilenoimina ramificada

CYP:

Citocromo P450

D_H:

Diámetros hidrodinámicos

DLS:

Dispersión luz dinámica

EDTA:

Ácido etilendiaminotetraacético

EMEM:

Medio esencial mínimo Eagle

HCC:

Carcinoma hepatocelular humano

HPTC:

Células tubulares proximales renales humanas

HSD:

Prueba diferencia significativa honesta Tukey

HUVEC:

Células vena umbilical humana

ICP-MS:

Espectrometría masa plasma acoplado inductivamente

LA:

Ácido lipoico aniónico

LC₅₀:

Concentración letal media

MDR:

Resistencia multidrogas

NP:

Nanopartículas

PBS:

Salino fosfato amortiguado

PC:

Corona proteica plasma humano

PDI:

Índice polidispersidad

PEG:

Polietilenglicol neutro

RNAi:

Interferencia RNA

RNS:

Especies reactivas nitrógeno

ROS:

Especies reactivas oxígeno

SO:

Superóxido

TEM:

Microscopía electrónica transmisión

TFF:

Filtración flujo tangencial