Nanoclusters de oro fluorescentes funcionalizados con neoglucoproteína para detección de lectinas vegetales e imagen de células dendríticas

Resumen

Las interacciones carbohidrato-proteína sustentan procesos biológicos esenciales como fertilización, transducción de señales y comunicación huésped-patógeno. La intrincada naturaleza del reconocimiento de glucanos demanda herramientas analíticas avanzadas. Aquí reportamos la primera síntesis de nanoclusters de oro fluorescentes funcionalizados con neoglucoproteína (G0-OVA-AuNCs) que combinan un glucano N-biantennario (G0) como ligando diana, ovalbúmina como proteína portadora y un núcleo de oro auto-emisivo. Demostramos que G0-OVA-AuNCs sirven como sensores selectivos para lectinas vegetales y como sondas de imagen potentes para células dendríticas murinas.

Introducción

Los nanoclusters de oro (AuNCs), compuestos por 10-100 átomos de oro, exhiben fluorescencia dependiente del tamaño que los hace atractivos para bio-detección e imagen. A diferencia de colorantes orgánicos convencionales o puntos cuánticos, los AuNCs poseen gran desplazamiento de Stokes, emisión rojo-cercano al IR y estabilidad fotoquímica superior, permitiendo aplicaciones en la ventana de transparencia tisular. Los AuNCs templados por proteínas se reportaron por primera vez con albúmina sérica bovina en 2009 y desde entonces se han convertido en una plataforma versátil para diseñar fluoróforos biocompatibles y solubles en agua. Las proteínas glicosiladas, sin embargo, permanecen poco exploradas como andamios de nanoclusters, a pesar del papel crítico de los glucanos en modular plegamiento proteico, estabilidad y unión a receptores. Las neoglucoproteínas sintéticas —proteínas conjugadas químicamente con carbohidratos definidos— ofrecen una estrategia para conferir a las proteínas nuevas propiedades funcionales preservando su integridad estructural.

En este estudio aprovechamos un glucano biantennario sintético G0, conjugado a ovalbúmina (OVA) vía un enlazador amino C5 y disuccinimidil suberato, para generar G0-OVA-AuNCs. Investigamos sus características físico-químicas, evaluamos la accesibilidad del glucano mediante ensayos de aglutinación de lectinas y evaluamos su capacidad para marcar células dendríticas (DCs) in vitro. Los resultados establecen G0-OVA-AuNCs como sensores robustos, multivalentes de lectinas y agentes de imagen potentes para células inmunes.

Resultados y Discusión

Optimizamos la síntesis de G0-OVA-AuNCs adaptando un protocolo para OVA-AuNCs no conjugados. Una solución de OVA 15 mg mL⁻¹ se mezcló con HAuCl₄·3H₂O (4.2 mM) y NaOH (150 mM) bajo irradiación de microondas (100 °C, 6 min), produciendo clusters marrón pálido que emiten fluorescencia roja brillante a 670 nm tras excitación a 350 nm. Los espectros UV-Vis carecen de banda de resonancia plasmónica, confirmando tamaños de partícula por debajo de 5 nm; TEM reveló diámetro de núcleo promedio de 1.9 ± 0.7 nm, y dispersión dinámica de luz mostró diámetro hidrodinámico de 8.7 ± 2.5 nm, consistente con una sola proteína encapsulando el núcleo. Los clusters exhibieron rendimiento cuántico de ~4 % y permanecieron fotoestables entre pH 3-11 y en suero bovino fetal, indicando idoneidad para ensayos biológicos.

a Esquema de síntesis OVA-AuNC. b Espectros UV-visibles de OVA (azul) y OVA-AuNCs (naranja). Inserto: imágenes visible (izquierda) y UV (365 nm, derecha). c Gel de agarosa de OVA (Azul Coomassie) y OVA-AuNCs (UV). d Espectros de excitación (verde) y emisión (rosa) de OVA-AuNCs.

Para clusters funcionalizados con G0, los glucanos G0 se conjugaron a OVA usando DSS, produciendo neoglucoproteínas con 2-3, 3-4 o 5-6 glucanos por proteína (verificado por SDS-PAGE y MALDI-TOF). La posterior formación de AuNCs bajo condiciones idénticas produjo G0-OVA-AuNCs cuyas propiedades ópticas igualaron a las de OVA-AuNCs: absorbancia a 278 nm y pico de emisión a 670 nm. TEM confirmó diámetro de núcleo de 1.6 ± 0.5 nm. Los espectros CD indicaron estructura secundaria de bobina aleatoria, probablemente debido a la síntesis alcalina, sin embargo los grupos glucano permanecieron accesibles para unión a lectinas.

a Síntesis de neoglucoproteína G0-OVA (n = valencia). b SDS-PAGE de OVA y variantes G0-OVA. c Espectros MALDI-TOF de las mismas muestras.

Los ensayos de aglutinación de lectinas con Bandeiraea simplicifolia lectina-II (BSL-II) y Solanum tuberosum lectina (STL) revelaron amortiguamiento de fluorescencia dependiente de concentración para G0-OVA-AuNCs (5/6), mientras una lectina control (Aleuria aurantia, AAL) no produjo efecto. El amortiguamiento siguió curvas de calibración lineales, dando límites de detección de 2.83 µM (BSL-II) y 2.35 µM (STL). G0-OVA-AuNCs con menos glucanos (2/3) no aglutinaron, subrayando la necesidad de presentación multivalente de glucanos. La electroforesis en gel de agarosa en medios de cultivo celular confirmó que la unión a lectinas permaneció eficiente en entornos biológicos complejos.

Aglutinación de lectinas de G0-OVA-AuNCs (5/6). a Espectros de fluorescencia tras incubación con BSL-II. b F₀/F vs concentración BSL-II. c Espectros tras incubación con STL. d F₀/F vs concentración STL. e Espectros tras incubación con AAL. f Imágenes UV de muestras; precipitación observada con STL.

La microscopía confocal de DCs esplénicas murinas (CD11c⁺) incubadas con G0-OVA-AuNCs (3/4) demostró internalización rápida en 40 min, con fluorescencia localizada intracelularmente y ausente en controles sin tratar. Reconstrucciones 3-D confirmaron distribución interna de clusters.

Captación DC de G0-OVA-AuNCs (3/4). a Imágenes representativas de células marcadas. b Z-stack ilustrando fluorescencia intracelular.

En resumen, presentamos los primeros AuNCs protegidos por neoglucoproteína, demostramos su reconocimiento selectivo de lectinas vía glucanos multivalentes y establecimos su capacidad para imaginar células dendríticas. Su fluorescencia robusta, solubilidad acuosa y estabilidad de pH los hacen alternativas prometedoras a colorantes convencionales para estudios de interacciones carbohidrato-proteína e imagen inmunológica.

Conclusiones

Síntesis y caracterización exitosa de G0-OVA-AuNCs, confirmando accesibilidad del glucano y aglutinación específica de lectinas. La presentación multivalente de glucanos fue esencial para entrecruzamiento eficiente, mientras los clusters mantuvieron alta fotoestabilidad y solubilidad acuosa. La imagen in vitro de células dendríticas murinas validó los clusters como sondas auto-fluorescentes potentes. Estos hallazgos apoyan mayor exploración de AuNCs funcionalizados con neoglucoproteína como herramientas versátiles para ensayos de interacción carbohidrato-proteína, imagen de células inmunes y potenciales aplicaciones terapéuticas.

Métodos/Experimental

Materiales

Todas las soluciones se prepararon en agua ultrapura (18 MΩ cm). Cloruro de oro (III) trihidrato, NaOH y trietilamina fueron de Sigma-Aldrich. Ovalbúmina se compró de Hyglos. DSS y DMSO de Thermo Fisher. Glucano G0 se sintetizó como se describió previamente.

Síntesis de AuNCs. Procedimiento General

Proteína 15 mg mL⁻¹ en agua ultrapura se mezcló con 4.2 mM HAuCl₄·3H₂O, agitó 5 min, luego se añadió 150 mM NaOH. La mezcla se calentó a 100 °C durante 6 min en reactor de microondas. Los clusters se dializaron (MWCO 10 kDa) contra agua ultrapura. La fluorescencia se registró en lector de placas Varioskan Flash (λ_ex=350 nm). Gel de agarosa (0.75 %) y TEM (200 kV) se usaron para caracterización de tamaño. CD evaluó estructura secundaria. XPS determinó estados de oxidación de oro.

Ensayo de Aglutinación de Lectinas

G0-OVA-AuNCs (0.2 mg mL⁻¹) se mezclaron con lectinas (AAL, STL, BSL-II) a 0-10 µM en buffer TSM. Tras incubación overnight, las muestras se centrifugaron y se midió fluorescencia del sobrenadante. La precipitación se observó bajo UV para STL.

Aislamiento de DCs Esplénicas de Ratón

Bazos de ratones C57BL/6J se procesaron a suspensiones monocelulares. Células CD11c⁺ se aislaron por separación celular activada magnéticamente (Miltenyi) y cultivaron en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina.

Captación de G0-OVA-AuNCs por DCs

DCs (2 × 10⁶ células) se incubaron con 150 µg mL⁻¹ G0-OVA-AuNCs (3/4) durante 40 min a 37 °C, lavaron, fijaron con 3 % PFA, e imagaron en microscopio confocal Zeiss LSM 510 (láser 365 nm, objetivo 63× aceite).

Abreviaturas

AAL:

Lectina Aleuria aurantia

AuNCs:

Nanoclusters de oro

BSA:

Albúmina sérica bovina

BSL-II:

Lectina-II Bandeiraea simplicifolia

CD:

Dicromatismo circular

CLRs:

Receptores lectina tipo C

DCs:

Células dendríticas

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DSS:

Éster disuccinimidil suberato

FBS:

Suero bovino fetal

G0:

Glucano N-biantennario

G0-OVA-AuNCs:

Nanoclusters de oro funcionalizados con neoglucoproteína

HAuCl₄^.₃H₂O:

Ácido tetracloroáurico (III)

IMDM:

Medio modificado de Dulbecco de Iscove

IR:

Infrarrojo

LOD:

Límite de detección

MACS:

Separación celular activada magnéticamente

OVA:

Ovalbúmina

QY:

Rendimiento cuántico

STL:

Lectina Solanum tuberosum

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

XPS:

Espectroscopía fotoelectrónica de rayos X