Deposición precisa in situ modificada por campo eléctrico de fibras de pegamento médico electrohilado en el hígado para una rápida hemostasia

Resumen

La deposición precisa de nanofibras sigue siendo un tema importante en las aplicaciones del electrohilado (e-spinning), especialmente en la hemostasia rápida de órganos como el hígado, los pulmones y los riñones. En este estudio, proponemos una técnica de e-spinning modificada por campo eléctrico con un cono de metal unido a la boquilla giratoria para realizar una deposición precisa y controlable de fibras. El rango de deposición de las fibras e-spun se puede ajustar cambiando el tamaño del cono de metal, y al mecanismo se le atribuye el campo eléctrico enfocado verificado por simulaciones teóricas. Este método de hilado electrónico modificado por campo eléctrico se utilizó además para depositar in situ con precisión pegamento médico N fibras de -octil-2-cianoacrilato (NOCA) en el sitio de resección del hígado de rata para realizar una hemostasia rápida en 10 s. Los resultados patológicos posoperatorios indican que se observa menos respuesta inflamatoria y adhesión tisular en este grupo de e-spinning modificado con campo eléctrico en comparación con el grupo tradicional asistido por flujo de aire. Esta técnica, combinada con nuestro dispositivo de giro electrónico portátil diseñado, podría usarse en tratamientos médicos de emergencia, clínicas, supervivencia en el campo y atención domiciliaria por su portabilidad y características precisas de deposición.

Antecedentes

La resección del hígado es una forma eficaz de tratar los cánceres de hígado [1]. Sin embargo, en la resección hepática suele producirse un sangrado abundante debido a la abundancia de vasos sanguíneos en este sitio especial [2]. Si no se detiene el sangrado a tiempo, puede producirse una insuficiencia orgánica grave que incluso podría poner en peligro la vida humana [3]. Los métodos actuales para detener el sangrado se centran principalmente en métodos mecánicos como sutura y ligadura, métodos térmicos como electrocauterio [4] y el uso de agentes de método hemostático como selladores de fibrina [5, 6], matriz de gelatina [7] y adhesivo de hidrogel de quitosano [8 ]. Por supuesto, todos tienen ventajas y limitaciones obvias. Por ejemplo, la sutura es la forma más eficaz de detener el sangrado, pero necesita un proceso oportuno y meticuloso; de lo contrario, causa isquemia a largo plazo [9]. De manera similar, los métodos térmicos pueden dañar los tejidos locales y hacerlos anormales del tejido normal que no se puede distinguir fácilmente [10]. Además, los selladores de fibrina ampliamente utilizados para la hemostasia pueden conducir fácilmente a una respuesta inmune humana adversa, y también tienen desventajas como una vida útil corta, vulnerables a la intrusión microbiana y un precio elevado [11]. Por el contrario, la tecnología e-spinning muestra un excelente potencial en la hemostasia por sus características especiales, como el uso de menos dosis y recubrimiento en los sitios de las heridas, incluso con superficies irregulares [12, 13]. Sin embargo, las técnicas de hilado electrónico y los dispositivos para la hemostasia existentes todavía tienen varios problemas que superar:(1) el volumen y el peso son tan voluminosos que no se pueden transportar fácilmente, (2) la deposición inexacta de fibras [14] lleva más tiempo para realizar el mismo efecto de hemostasia y también pueden causar adhesión de tejido después de la operación, y (3) dependen del suministro eléctrico urbano, por lo que no son adecuados para usos en áreas al aire libre y remotas sin suministro de energía [15]. Aunque nuestro grupo informó recientemente sobre una técnica de e-spinning asistida por flujo de aire que utiliza un soplador de bomba de aire para permitir la deposición orientada de fibras [12], necesita un suministro de energía adicional para la bomba de aire. Por lo tanto, es muy deseable una técnica y un dispositivo de e-spinning portátil que no dependan principalmente de la electricidad, pero que también puedan lograr la deposición orientada de fibras para una hemostasia rápida.

Una placa de metal colocada en el campo electrostático generará cargas inductivas en su superficie debido a la interacción electrostática, que puede inducir un nuevo campo eléctrico y así cambiar las distribuciones originales del campo electrostático [16,17,18]. Por otro lado, el proceso de e-spinning utiliza el batido inestable y la división de chorros cargados durante el campo electrostático para lograr micro- / nanofibras y finalmente depositarse en un colector conectado a tierra [19, 20]. El chorro cargado es sensible a la distribución del campo electrostático, por lo que normalmente se consiguen fibras más delgadas cambiando el voltaje [21, 22]. Por lo tanto, en base a este principio descrito anteriormente, podemos introducir una placa de metal en el proceso de e-spinning para producir una deposición más orientada al disminuir el ángulo de divergencia del chorro volador cambiando la distribución del campo electrostático. Además, tomamos pegamento médico de cianoacrilato (CA) de uso clínico [23] como fármaco de hemostasia [24], porque en las clínicas se suele requerir una gran dosis para formar una película gruesa para la hemostasia. Sin embargo, esta película es rígida para el gran espesor del pegamento médico CA. Por el contrario, las membranas de fibra polimérica generadas por métodos de hilado electrónico suelen ser lo suficientemente flexibles y compactas [25]. Por lo tanto, es de gran importancia utilizar métodos modificados por campos electrostáticos para e-spinning de pegamento médico CA con deposición precisa en el hígado para una rápida hemostasia.

En este estudio, proponemos una técnica de e-spinning modificada por campo eléctrico para realizar la deposición precisa y controlable de fibras de pegamento médico en el sitio de resección del hígado. El rango de deposición de las fibras e-spun se puede ajustar cambiando el tamaño del cono de metal. Este método de hilado electrónico modificado por campo eléctrico se utilizó además para depositar in situ con precisión pegamento médico N fibras de -octil-2-cianoacrilato (NOCA) en el sitio de resección del hígado de rata para realizar una hemostasia rápida en 10 s. Los resultados patológicos posoperatorios indican que se observa menos respuesta inflamatoria y adhesión tisular en este grupo de e-spinning modificado con campo eléctrico en comparación con los del grupo tradicional asistido por flujo de aire. Esta técnica, combinada con nuestro dispositivo de giro electrónico portátil diseñado, podría usarse en tratamientos médicos de emergencia, clínicas, supervivencia en el campo y atención domiciliaria por su portabilidad y características precisas de deposición.

Métodos

Materiales

Α-cianoacrilato (CA) adhesivo médico rápido que se compone de N -octil-2-cianoacrilato y polimetilmetacrilato de grado médico (PMMA, un aditivo para aumentar la viscosidad) fue proporcionado por Guangzhou Baiyun Medical Adhesive Co., Ltd. y utilizado sin purificación adicional. El hidrato de cloral se compró a Aladdin, que se diluyó al 10% para obtener más anestesia.

Experimentos hemostáticos in vivo

Los experimentos de hemostasia después de la resección del hígado de rata se realizaron en 40 ratas SD macho adultas que pesaban 300 ~ 350 g. Estas ratas se dividieron al azar en dos grupos para in situ asistida por flujo de aire ( n =20) y e-spinning modificado por campo eléctrico ( n =20) tratamiento. Cada rata aceptó 0,7 ml de hidrato de cloral al 10% antes de la operación, luego una laparotomía sin lóbulo y una resección del hígado al 50%, seguida de un campo eléctrico modificado in situ (longitud del lado del electrodo de 2,5 cm, ángulo del electrodo de 60 °, e -distancia de giro de 10 cm, voltaje de 10 kV) o asistido por flujo de aire (diámetro de salida de 1,2 mm, voltaje de 10 kV, caudal de 120 μl min ⁻¹ , y distancia de e-spinning de 10 cm) e-spinning fibras NOCA. Todo el proceso ocupó aproximadamente 20 minutos para cada rata. Todos los procedimientos operativos cumplieron con las regulaciones del Colegio Nacional de Experimentos con Animales y las regulaciones de gestión del Comité de Investigación Animal de la Universidad.

Análisis de sangre y seccionamiento patológico

Se recolectaron muestras de sangre mediante punción cardíaca al tercer y quinto días después de la operación para la detección del recuento de glóbulos blancos (WBC) y las pruebas de función hepática. Las ratas se sacrificaron y se extirpó el lóbulo al séptimo día después de la operación, en el que el lóbulo se fijó adicionalmente en la solución de formalina neutra al 4%, se incluyó en parafina y se tiñó con hematoxilina y eosina (HE).

Simulación de campo eléctrico

Se utilizó el método de análisis de elementos finitos para simular la distribución del campo eléctrico. El modelo geométrico consta de una fuente de alimentación de 12 kV, una aguja de cobre unida con un cono de cobre y una placa colectora de aluminio en el aire. Los parámetros de longitud de la aguja, diámetro del cono y distancia de recepción se establecieron en 3, 5 y 10 cm, respectivamente.

Caracterización

La formación de imágenes SEM se llevó a cabo en un microscopio electrónico de barrido Hitachi TM-1000. El espectro de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) se midió en un espectrómetro Nicolet In10 para analizar la estructura intermolecular de las fibras. Se utilizó un microscopio óptico (Olympus BX51) para encontrar el límite de deposición y evaluar el área de deposición. Se utilizó la cámara Casio Exilim para registrar el proceso de resección hepática in vivo.

Resultados y discusión

E-spinning modificado por campo eléctrico para una deposición precisa

Figura 1 y archivo adicional 1:La Figura S1 muestra nuestro dispositivo de giro electrónico portátil hecho en casa equipado con la técnica de giro electrónico modificada por campo eléctrico. Utiliza dos pilas AAA alcalinas sin mercurio (diámetro 10 mm, altura 44 mm; LR03, Fujian Nanping, Nanfu Battery, China) como fuente de alimentación con un convertidor de alto voltaje y elimina la limitación del suministro eléctrico urbano que se desarrolla enormemente el uso portátil en exteriores. Es importante destacar que, significativamente diferente de nuestro dispositivo e-spinning reportado recientemente [11], un cono metálico con tamaño ajustable está equipado en la aguja giratoria. La introducción del cono metálico cambiaría las distribuciones originales del campo electromagnético y afectaría el proceso de e-spinning. Cabe señalar que los problemas de seguridad, como las descargas eléctricas, suelen ser causados por una corriente alta en lugar de un voltaje alto. En este estudio, el dispositivo de mano tiene un convertidor que se utiliza para mantener un alto voltaje y una baja corriente para garantizar la seguridad.

Diagrama esquemático de las fibras NOCA de hilado electrónico modificadas con campo eléctrico para la hemostasia de resección hepática

La Figura 2a muestra la imagen SEM de fibras NOCA de pegamento médico. El diámetro de las fibras NOCA es de aproximadamente 1 ~ 3 μm, y estas fibras exhiben una morfología de fibra continua. La Figura 2b muestra el espectro FTIR de estas fibras NOCA. Picos a 714 cm ⁻¹ , 2761 cm ⁻¹ y 1732 cm ⁻¹ corresponden a la vibración de –CH ₂ -, –C≡N y –C =O, respectivamente. El pico a 3127 cm ⁻¹ correspondiente a =CH– casi desaparece, lo cual es causado por el proceso de polimerización durante el proceso de e-hilado en el que la mayoría de los enlaces alquenilo C =C en las moléculas de monómero se transforman en cadenas de polímero. Además, investigamos la relación entre el tamaño del cono metálico y la deposición orientada. Como se muestra en la Fig. 2c, el diámetro del área de deposición disminuye con la disminución del tamaño del cono metálico cuando la distancia entre la punta de la aguja y el colector se fija en 10 cm. Este fenómeno se debe probablemente a que el campo electrostático se limitaría a un rango más estrecho [26, 27] con la disminución del tamaño del cono metálico y, por lo tanto, el proceso de batido en el e-spinning sería más restringido, lo que conduciría a un área de deposición más pequeña. . Además, también se estudió la relación entre la distancia de e-spinning y el área de deposición (Fig. 2d). Archivo adicional 1:La Tabla S1 presenta el ancho de deposición de tres métodos diferentes de e-spinning con una distancia creciente de e-spinning. La deposición de hormigón encontró que el área de deposición aumenta con el aumento de la distancia de e-spinning, lo que es consistente con los resultados tradicionales de e-spinning. Sin embargo, en comparación con el e-spinning tradicional, nuestro e-spinning de campo eléctrico modificado con un cono metálico produce un área de deposición más pequeña, es decir, una deposición mejor orientada. Incluso en comparación con nuestro e-spinning asistido por flujo de aire recientemente informado, este e-spinning modificado por campo eléctrico exhibe una deposición mejor orientada. Como se muestra en la Fig. 2c, d, sintonizar la distancia de giro e y la longitud lateral del cono de metal puede enfocar el campo eléctrico y producir una fuerza de convergencia más fuerte. Aunque alguna parte más cercana, como la piel o el músculo del abdomen, puede producir una fuerza para atraer el chorro volador, podemos sintonizar estos dos parámetros para generar una fuerza de convergencia más fuerte que pueda reducir este efecto negativo de la fuerza de atracción. Además, el e-spinning asistido por flujo de aire requiere una fuente de alimentación adicional para la bomba de aire, y este e-spinning modificado en el campo puede eliminarlo, brindando más conveniencia.

un La imagen SEM y b Espectro FTIR de fibras NOCA obtenido por el dispositivo de hilado electrónico asistido por campo eléctrico. El tamaño del área de deposición en función de c diámetro del cono metálico y d distancia de e-spinning

Análisis del mecanismo de deposición precisa

Para comprender la razón por la que este dispositivo de giro electrónico equipado con un cono de metal podría provocar un área de deposición más pequeña, se llevaron a cabo sus simulaciones de campo eléctrico. La Figura 3 muestra la distribución del campo eléctrico de los modelos e-spinning equipados con y sin un cono metálico. La flecha roja representa la línea del campo eléctrico, cuya dirección y longitud representan la orientación y la fuerza del campo eléctrico en este punto, respectivamente. El e-spinning tradicional es el que no tiene un cono de metal (Fig. 3a), y nuestro e-spinning modificado con campo eléctrico es el que tiene un cono de metal (Fig. 3b). Como se muestra en la Fig. 3, el potencial eléctrico (barra de color) disminuye significativamente a lo largo de la dirección desde la aguja hasta la placa colectora y, por lo tanto, las fibras con carga positiva se pueden ensamblar en la placa colectora. Más interesante aún, comparando la Fig. 3a con b, se observaron en la Fig. 3b una fuerza de campo eléctrico más fuerte y un ángulo de divergencia más pequeño de la dirección del campo eléctrico, y estos fenómenos son más obvios cuando están cerca del cono metálico. Su efecto sobre el cambio del campo eléctrico actúa como el efecto de convergencia en la luz por una lente convexa. Las líneas del campo eléctrico son convergentes, por lo que produce un ángulo de divergencia más pequeño en la dirección del campo eléctrico. Además, la intensidad del campo eléctrico en la misma posición también aumenta debido a esta convergencia y al principio de superposición del campo eléctrico. El recuadro es la línea representativa del campo eléctrico seleccionada de la misma área con aumento. La intensidad del campo es 4 × 10 ⁵ V / m en el recuadro de la Fig. 3b, que es mayor que 3 × 10 ⁵ V / m en el recuadro de la Fig. 3a, que indica que la mayor intensidad del campo eléctrico se produce en el espacio después de añadir un cono metálico. Y el ángulo de divergencia de la dirección del campo eléctrico es de 6 ° en el recuadro de la Fig. 3b, que es menor que 20 ° en el recuadro de la Fig. 3a. Estos resultados implican que este e-spinning modificado con campo eléctrico equipado con un cono de metal que produce un área de deposición más pequeña puede atribuirse a una fuerza de campo eléctrico más fuerte y un ángulo de divergencia más pequeño, que constriñen las fibras con carga positiva que vuelan en un espacio más estrecho, confinando así su deposición a un área más pequeña.

Distribución del campo eléctrico de modelos e-spinning equipados a sin y b con un cono de metal. Los recuadros son imágenes ampliadas de la misma área y muestran el ángulo entre la línea de campo y la dirección vertical

Hemostasia y análisis rápidos in vivo

La Figura 4a-c muestra el proceso principal de hemostasia en la resección hepática de rata. Se logró una hemostasia rápida y efectiva en 10 s mediante fibras NOCA utilizando esta técnica de e-spinning modificada por campo eléctrico, que es más rápida que la del e-spinning asistido por flujo de aire. Este fenómeno se puede atribuir a la deposición mejor orientada de e-spinning modificado por campo eléctrico que el e-spinning asistido por flujo de aire verificado en la Fig.2d, lo que significa que la misma cantidad de pegamento médico puede depositarse con mayor precisión en el sitio de la herida durante la mismo tiempo de e-spinning. De hecho, el pegamento médico NOCA que se utiliza en las clínicas suele ser de pulverización [28,29,30], mientras que el área de deposición es relativamente grande, lo que da lugar a algunas adherencias tisulares graves, lo que dificulta la realización de operaciones posoperatorias como la extracción de suturas y incluso causar daños secundarios. La deposición mejor orientada no solo permite una hemostasia más rápida, sino que también puede evitar la adhesión del tejido. La Figura 4d muestra la imagen SEM en sección transversal de las fibras NOCA que se depositaron en la superficie del hígado para la hemostasia. Muestra que las fibras de NOCA se adhieren firmemente a la superficie de la sección del hígado y forman una membrana de fibra compacta cuyo grosor es de aproximadamente 50 μm con un tiempo de hilado electrónico de 10 s. Durante este corto tiempo de e-spinning de 10 s, el cambio de distancia causado por el temblor de la mano que generalmente proviene de la fatiga es pequeño, generalmente no más de 1 cm, y por lo tanto, la variación del rango de deposición es pequeña. Más interesante aún, la superficie de la sección del hígado no es lisa sino de forma irregular (Fig. 4c), mientras que las fibras de NOCA podrían depositarse sobre esta superficie irregular con un buen espesor uniforme (Fig. 4d), lo que implica que este campo eléctrico modificado e La técnica de giro posee ventajas únicas en la hemostasia rápida incluso en algunas superficies irregulares de órganos.

Hemostasia en un modelo de resección de hígado de rata mediante e-spinning asistido por campo eléctrico in situ. un Se disoció el hígado y se expuso el lóbulo del hígado. b El lóbulo estaba libre y fijado con una sutura quirúrgica para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo hepático. c Se realizó una hepatectomía y se depositaron fibras de pegamento médico NOCA en el sitio de la herida con nuestro dispositivo de hilado electrónico asistido por campo eléctrico. d Imagen SEM de corte transversal de fibras de pegamento médico NOCA depositadas en la superficie del hígado para la hemostasia

La prueba de recuento de leucocitos (Fig. 5a) se utilizó para evaluar las infecciones posoperatorias causadas por la hepatectomía y la hemostasia en ratas. Cinco días después de la cirugía, la cantidad de GB ( P <0.05) en el grupo de e-spinning modificado con campo eléctrico fue significativamente menor que en el grupo de aspersión convencional y el grupo asistido por flujo de aire ( P <0,01). Además, estuvo cerca del grupo de operación simulada (grupo de control), lo que indica que la inflamación aguda después de 5 días en el grupo de e-spinning modificado con campo eléctrico disminuyó a un estado normal. Por el contrario, las ratas del grupo de fumigación y del grupo asistido por flujo de aire muestran una respuesta inflamatoria grave y una regresión más lenta.

Prueba de sangre. un Recuento de leucocitos. b - d Prueba de enzimas de función hepática. b Alanina aminotransferasa (ALT). c Aspartato aminotransferasa (AST). d Glutamiltransaminasa (GGT)

La función hepática se evaluó mediante la concentración de ALT en suero (figura 5b), AST (figura 5c) y GGT (figura 5d). Aquí, la concentración de ALT y AST puede reflejar sensiblemente la extensión del daño de las células hepáticas. Las concentraciones altas de GGT pueden reflejar hepatitis, ictericia obstructiva, estasis biliar y otros síntomas. Como se muestra en la Fig. 5b-d, los niveles de enzimas de la función hepática en el grupo de e-spinning modificado por campo eléctrico después de 5 días de operación fueron básicamente cercanos a los del grupo simulado (grupo de control) y fueron significativamente más bajos que los del grupo convencional grupo de pulverización y el grupo asistido por flujo de aire, lo que indica que el estado fisiológico de las ratas en el grupo de e-spinning modificado por campo eléctrico y el grupo de simulación fue similar. Sin embargo, la GGT en el grupo de fumigación y en el grupo asistido por flujo de aire se mantuvo en un nivel alto el quinto día después de la operación ( P <0,001), lo que indica que existen algunos problemas graves, como estasis biliar y daño hepático.

La biopsia patológica de los tejidos del hígado después de la hemostasia se llevó a cabo. Las figuras 6a yc son secciones patológicas del hígado después de la hemostasia con e-spinning asistido por flujo de aire y modificado por campo eléctrico, respectivamente, y las figuras 6b yd son sus imágenes ampliadas. En comparación con el grupo de e-spinning asistido por flujo de aire, los límites del tejido hepático en el grupo de e-spinning modificado con campo eléctrico son relativamente más claros y tienen una cápsula más delgada. Estos resultados indican que la capacidad de regeneración en el hígado es mejor en el grupo de campo eléctrico modificado. Además, se observaron menos células inflamatorias en la cápsula, lo que indica que las membranas fibrosas NOCA fabricadas mediante el método de campo eléctrico modificado pueden producir una respuesta inflamatoria menor. Estos resultados se pueden atribuir al hecho de que los métodos modificados por campo eléctrico tienen una deposición mejor orientada que los métodos asistidos por flujo de aire, reduciendo así la cantidad de pegamento médico NOCA utilizado para lograr el mismo efecto hemostático, lo que reducirá la adhesión tisular y, por lo tanto, la inflamación. respuesta. Además, también se puede ver en la Fig. 6a, b que el pegamento médico se separó del tejido hepático, lo que puede ser causado por el soplo de aire, lo que indica que la adhesión entre ellos usando el e-spinning asistido por flujo de aire no es tan fuerte como el e-spinning modificado por campo eléctrico.

Examen histopatológico con tinción HE observado en a , c aumento × 100 y b , d aumento × 200. El examen histopatológico muestra una respuesta inflamatoria y daño hepático entre los hepatocitos en dos grupos al séptimo día. Los dos grupos son a , b grupo asistido por flujo de aire y c , d grupo modificado por campo eléctrico (flecha azul:células inflamatorias; círculo rojo:pegamento médico; flecha negra:grosor de la zona de hiperemia)

Conclusiones

En resumen, proponemos una técnica de e-spinning modificada por campo eléctrico con un cono de metal unido a la boquilla giratoria para realizar una deposición precisa y controlable de fibras. El rango de deposición de las fibras e-spun se puede ajustar cambiando el tamaño del cono de metal, y el mecanismo se atribuye al campo eléctrico enfocado verificado por simulaciones teóricas. Este método de hilado electrónico modificado con campo eléctrico se usó además para depositar in situ con precisión fibras de NOCA de pegamento médico en el sitio de resección del hígado de rata para realizar una hemostasia rápida en 10 s. Los resultados patológicos posoperatorios indican que se observa menos respuesta inflamatoria y adhesión tisular en este grupo de e-spinning modificado con campo eléctrico en comparación con el grupo tradicional asistido por flujo de aire. Esta técnica, combinada con nuestro dispositivo de giro electrónico portátil diseñado, podría usarse en tratamientos médicos de emergencia, clínicas, supervivencia en el campo y atención domiciliaria por su portabilidad y características precisas de deposición.

Abreviaturas

ALT:: Alanina aminotransferasa
AST:: Aspartato aminotransferasa
CA:: Cianoacrilato
E-spinning:: Electrospinning
FTIR:: Infrarrojos por transformada de Fourier
GGT:: Glutamiltransaminasa
HE:: Hematoxilina y eosina
NOCA:: N -Octil-2-cianoacrilato
PMMA:: Polimetacrilato de metilo
SEM:: Microscopio electrónico de barrido
WBC:: Glóbulo blanco

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