Evaluación de la modulación por fullereno C60 de la unión diphenil-N-(tricloroacetil)amidofosfato-ADN y citotoxicidad en células de leucemia humana

Resumen

Se sintetizó un nuevo representante de carbacilamidofosfatos —difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL), que contiene dos sustituyentes fenoxi cerca del grupo fosforilo—, identificado por análisis elemental y espectroscopía IR y RMN, y probado como agente citotóxico por sí mismo y en combinación con fullereno C₆₀.

Según resultados de simulación molecular, el fullereno C₆₀ y HL podrían interactuar con el ADN y formar un complejo rígido estabilizado por interacciones de apilamiento de los grupos fenilo de HL con el fullereno C₆₀ y el nucleótido G del ADN, así como por interacciones del grupo CCl₃ de HL mediante enlaces ión-π con la molécula de C₆₀ y enlaces electrostáticos con el nucleótido G del ADN.

Mediante el test MTT, se mostró la actividad citotóxica de HL contra células leucémicas humanas CCRF-CM con valor IC₅₀ detectado a 10 µM de concentración a las 72 h de tratamiento. Bajo la acción combinada de 16 µM de fullereno C₆₀ y HL, el valor de IC₅₀ se detectó a una concentración menor de 5 µM HL y a un período más temprano de 48 h de incubación; además, el efecto citotóxico de HL se observó a una baja concentración de 2,5 µM a la que HL por sí solo no tenía influencia en la viabilidad celular. Se asume que la unión del fullereno C₆₀ y HL con el surco menor del ADN con formación de un complejo estable es una de las posibles razones de su inhibición sinérgica de la proliferación de células CCRF-CEM.

La aplicación de fullereno C₆₀ en combinación con 2,5 µM HL mostró no tener efecto dañino en la estabilidad estructural de la membrana de eritrocitos sanguíneos. Así, la acción combinada de fullereno C₆₀ y HL en baja concentración potenció el efecto citotóxico de HL contra células leucémicas humanas y no fue seguida por efecto hemolítico.

Introducción

El representante de nanoestructura de carbono fullereno C₆₀ ha mostrado poseer propiedades fisicoquímicas únicas y actividad biológica no solo como antioxidante o fotosensibilizador, sino también como modificador del efecto tóxico de fármacos anticancerosos debido a su capacidad para penetrar dentro de la célula y funcionar como transportador de fármacos. La molécula de C₆₀ puede interactuar con fármacos quimioterapéuticos como doxorrubicina, cisplatino y paclitaxel y formar complejos con ellos mejorando el efecto terapéutico.

Los carbacilamidofosfatos (CAPh) son moléculas orgánicas que han atraído atención debido a su estructura particular, actividad biológica y perspectivas de aplicación biomédica. La presencia de grupos peptídicos y fosforamida combinados en el fragmento C(O)N(H)P(O) de la molécula determina su interacción con moléculas biológicas y membranas celulares. La variación de sustituyentes cerca de los grupos fosforilo y carbonilo da posibilidad de modular las propiedades estereoquímicas y farmacológicas de CAPh. En particular, diferentes representantes de CAPh mostraron actividad antineoplásica.

Recientemente, confirmamos que el representante de CAPh dimetil-N-(benzoil)-amidofosfato usado en rango de concentraciones milimolares disminuyó la viabilidad de células leucémicas L1210 y que su efecto tóxico fue facilitado por fullereno C₆₀. También mostramos que la introducción de sustituyentes aromáticos adicionales y el grupo electronegativo CCl₃ en la estructura de CAPh resultó en aumento de su toxicidad. Así, se mostró un efecto tóxico significativo de dimorfolido-N-tricloroacetilfosforamida contra células leucémicas humanas de diferente origen, pero su concentración efectiva seguía siendo alta y no se observó aumento de toxicidad tras acción combinada con fullereno C₆₀. En continuación de estas investigaciones, sintetizamos un nuevo representante de CAPh difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL) que tiene dos sustituyentes fenoxi en lugar de grupos morfolido cerca del grupo fosforilo (Fig. 1).

El objetivo de la investigación fue estimar la actividad biológica del difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL) solo o en combinación con fullereno C₆₀ mediante análisis in silico de su interacción con ADN e in vitro de efectos citotóxicos contra línea celular leucémica humana.

Métodos/Experimental

Reactivos

Medio líquido RPMI 1640, Suero Fetal Bovino (FBS), Penicilina/Estreptomicina y L-glutamina (Biochrom, Alemania), Dimetilsulfóxido (DMSO) (Carl Roth GmbH+Co, Alemania), MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio bromuro] (Sigma-Aldrich Co, Ltd., EE. UU.), HCl (Kharkivreachim, Ucrania).

Caracterización del compuesto químico

Para aumentar la solubilidad, obtuvimos la sal sódica de difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL) según las siguientes reacciones (Fig. 2).

La solución de triclorofosfazotricloroacetil (0,035 M) en 200 ml de cloroformo se añadió lentamente a una suspensión bien agitada de fenolato sódico (0,106 M, 12,3 g) en 150 ml de cloroformo (Fig. 2; etapa 1). La temperatura de la mezcla no se permitió elevar por encima de 40–50 °C. La agitación continuó por ~1 h, y luego la solución se calentó a 70 °C y agitó 20 min en estas condiciones. El producto resultante trifenoxifosfazotricloroacetil se evaporó. Luego, se añadieron 40 ml de NaOH 1 M y se reflujo 90 min (Fig. 2; etapa 2). La mezcla resultante se evaporó. El precipitado sólido de HL sódico se lavó tres veces con éter dietílico y recristalizó de i-propanol como polvo cristalino blanco (rendimiento 80%). Cristales incoloros de NaL·3H₂O adecuados para análisis de rayos X se obtuvieron por evaporación lenta de solución i-PrOH:H₂O (9:1 v/v). El compuesto es estable al aire, altamente soluble en agua y alcoholes. P.f. 215 °C.

HL se identificó por análisis elemental y espectroscopía IR y RMN: análisis elementales (C, H, N) se realizaron usando analizador elemental universal EL III CHNOS. Medidas espectrales IR se realizaron para muestras como pastillas de KBr en espectrómetro Perkin–Elmer Spectrum BX FT-IR con resolución de 2 cm⁻¹ y 8 barridos acumulados, promediados para eliminar artefactos de absorción aleatorios en el rango 4000–400 cm⁻¹. Espectros ¹H NMR en soluciones DMSO-d₆ se registraron en espectrómetro AVANCE 400 Bruker NMR a temperatura ambiente.

HL: IR (cm⁻¹): 1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Amida II); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sh (νPN).

¹H NMR (DMSO-d₆): 7,05 (t, 2H, γ-CH₂); 7,205, 7,255 (dt, 8H, α- y β-CH₂).

Para CCl₃C(O)N(Na)P(O)(OC₆H₅)₂ la composición elemental fue determinada, %: C 40,58, H 2,35, N 3,15; y calculada, %: C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Síntesis y caracterización del fullereno C₆₀

Una solución coloidal acuosa altamente estable de fullereno C₆₀ (200 µM, pureza > 99,5%, tamaño medio de nanopartícula hasta 50 nm) se sintetizó en la Universidad Técnica de Ilmenau (Alemania) como se describe en [17, 18].

Cultivo celular

Los experimentos se realizaron en línea celular leucémica aguda de células T humanas CCRF-CM. La línea celular se adquirió del Instituto Leibniz DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares: CCRF-CM (ACC 240). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 1% Penicilina/Estreptomicina y 2 mM Glutamina, usando frascos de 25 cm² a 37 °C con 5% CO₂ en incubadora humificada.

Las células en medio RPMI 1640 se incubaron con fullereno C₆₀ (16 µM) o HL (2,5, 5 y 10 µM) por separado y juntos durante 24, 48 y 72 h. La supervivencia celular sin adición de HL o fullereno C₆₀ se tomó como 100% (muestra control contenía 0,05 M DMSO).

Ensayo de viabilidad celular (MTT)

La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de reducción de MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio bromuro]. En los puntos de tiempo indicados de incubación, alícuotas de 100 µl (0,5 × 10⁴ células) se colocaron en placas de 96 pocillos Sarstedt (Nümbrecht, Alemania), se añadieron 10 µl de solución MTT (5 mg/ml en PBS) a cada pocillo, y las placas se incubaron otras 2 h a 37 °C. El medio de cultivo se reemplazó luego con 100 µl de DMSO; la formación de diformazano se determinó midiendo la absorbancia a 570 nm con lector de microplacas Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Suiza).

Animales

El estudio se realizó en ratas macho blancas de la línea "Wistar" pesando 170 ± 5 g. Los animales se mantuvieron en condiciones estándar en el vivario del ESC "Instituto de Biología y Medicina", Universidad Nacional Taras Shevchenko de Kiev. Los animales tuvieron acceso libre a comida y agua. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los principios internacionales de la Convención Europea para la protección de animales vertebrados bajo control del Comité de Bioética de la institución mencionada.

Estimación de hemólisis de eritrocitos

Los eritrocitos se obtuvieron de sangre heparinizada de ratas "Wistar" y se diluyeron en solución NaCl 0,85% a 0,700 o.u. a 630 nm en espectrofotómetro Scinco (Alemania). La hemólisis de eritrocitos fue causada por HCl 0,001 N. La cinética de hemólisis se midió espectrofotométricamente (λ = 630 nm) cada 10 s durante 2 min. El porcentaje de eritrocitos hemolisados se calculó como se presenta en [20]. Los eritrocitos se incubaron en solución NaCl 0,85% con fullereno C₆₀ (16 µM) o HL (2,5 y 10 µM) por separado y juntos durante 1 h. Los eritrocitos sin adición de HL o fullereno C₆₀ se tomaron como 100% (muestra control contenía 0,05 M DMSO).

Estudio in silico

La molécula de ADN de doble hélice se usó como plantilla de la base PDB (Banco de Datos de Proteínas). Se estudió la interacción de la molécula de ADN con HL por separado y en combinación con fullereno C₆₀. Se consideraron las siguientes estructuras de ADN: 2MIW (CCATCGCTACC - intercalación de compuesto en surco menor de hélice de ADN), 1XRW (CCTCGTCC - intercalación en surco menor), y 2M2C (GCGCATGCTACGCG - unión de compuesto con surcos mayor y menor). Se aplicó el algoritmo de acoplamiento sistemático (SDOCK+), integrado en el paquete QXP (este método demuestra todas las conformaciones posibles de las estructuras estudiadas con valor mínimo de desviación cuadrática media RMSD). Se generaron 300 complejos potencialmente posibles con ADN, seleccionándose los diez mejores para la siguiente etapa, usando una función de puntuación integrada en QXP.

Las interacciones de la molécula de ADN con HL por separado y en combinación con fullereno C₆₀ se caracterizaron por: (1) número de enlaces de hidrógeno, (2) área de superficies de contacto de ADN y estructura correspondiente, (3) distancia entre ADN y estructura acoplada, y (4) energía total de la estructura de unión.

Para evaluar la estabilidad de los complejos de compuesto químico con fullereno C₆₀, realizamos dinámica molecular corta (DM, 100 ps) usando Gromacs según algoritmo Nosé-Poincaré-Anderson (NPA) basado en campo de fuerzas OPLS-AA.

Los cálculos se realizaron en: temperatura (Kelvin) - 300; presión (kilopascal) - 100; unión involucrando átomo de hidrógeno o ligando limitada por el algoritmo.

Análisis estadístico

Los datos se representaron como media ± DE de más de cuatro experimentos independientes. Media (M) y desviación estándar (DE) se calcularon para cada grupo. Análisis estadístico se realizó usando ANOVA de dos vías seguido de pruebas post Bonferroni. Valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Procesamiento de datos y gráficos se realizaron en IBM PC usando aplicaciones especializadas GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., EE. UU.).

Resultados y discusión

Estudio in silico

Interacción de HL con ADN

Se mostró que HL podía intercalar en ADN y formar complejo estable cuando se une en surco menor del ADN a través de nucleótidos AGC-GCTA (Fig. 3a). En este caso, se formó interacción de apilamiento entre la base nitrogenada de nucleótido A y grupo fenilo de HL, así como interacción electrostática entre grupo CCl₃ y nucleótido C. Tras simulación DM, los valores RMSD para doble hélice de ADN y HL fueron 3,3 y 1,62 Å, respectivamente. El entorno nucleotídico de HL (GCA-CTA) cambió parcialmente y se perdió la interacción de apilamiento, mientras se formó un enlace de hidrógeno entre nucleótido G y grupo CO de HL.

La unión de HL con surco mayor del ADN ocurrió a través de nucleótidos TCG-AT (Fig. 3b). En este caso, se formó enlace de hidrógeno entre grupo CO de HL y base nitrogenada de nucleótido A, e interacción de apilamiento entre ambos fenilos de HL y bases nitrogenadas de nucleótidos C y G. Además, apareció probabilidad de enlace electrostático entre grupo CCl₃ de HL y bases nitrogenadas de nucleótidos AT.

Tras simulación DM, no se detectaron cambios en el entorno nucleotídico de HL. Los valores RMSD para ADN y HL fueron 2,77 y 1,58 Å, respectivamente. Debido a ello, la interacción de apilamiento entre nucleótido C y grupo fenilo desapareció.

En el caso de intercalación de HL en ADN, su entorno consistió en nucleótidos CG-CG (Fig. 3c). Apareció interacción de apilamiento con nucleótidos CG: un grupo fenilo quedó atrapado entre las bases nitrogenadas y el otro formó apilamiento con nucleótido C.

Tras simulación DM, los valores RMSD para doble hélice ADN y HL fueron 1,71 y 1,89 Å, respectivamente. El entorno nucleotídico de HL no cambió. Uno de los grupos fenilo formó una interacción ión-π con la base nitrogenada de nucleótido G, que apareció desplazada 1,12 Å.

Los parámetros energéticos obtenidos testificaron que la energía de choques estéricos entre ADN y HL así como dentro de HL misma fue insignificante (Tabla 1).

Realizamos análisis comparativo de parámetros energéticos de unión de HL con surcos menor y mayor del ADN o su intercalación en surco menor. Los valores Bump fueron 6,2 kJ/mol en intercalación de HL en ADN y 2,5 kJ/mol en unión con surcos menor y mayor (Tabla 1). Valores Int fueron 8,7 kJ/mol en intercalación, 6,3 kJ/mol en unión con surco mayor, y 3,6 kJ/mol en unión con surco menor. Estos datos mostraron que la unión de HL con surco menor del ADN fue la más estable.

Interacción combinada de HL y fullereno C₆₀ con ADN

Previamente con simulación computacional, demostramos que la molécula C₆₀ podía interactuar con ADN y formar complejo estable C₆₀+ADN al unirse con surco menor del ADN. Como se muestra en Fig. 4, el fullereno C₆₀ también podía formar enlaces ión-π con grupos CCl₃ de molécula HL.

Usamos dos versiones de modelado molecular de interacción HL, fullereno C₆₀ y ADN, propuestas en [16] y probadas útiles para interpretación de resultados DM. Usamos estructura PDB 1XRW de ADN en versión donde inicialmente HL y luego molécula C₆₀ intercalan en ADN (HL+C₆₀) y estructura PDB 2MIW - en versión donde inicialmente molécula C₆₀ y luego HL intercalan en ADN (C₆₀+HL).

La unión con surco menor en caso de versión HL+C₆₀ ocurrió a través de nucleótidos GCTA-GCAT (Fig. 4a). Los grupos fenilo llenaron un surco menor e ingresaron en interacciones de apilamiento: uno con fullereno C₆₀ y el otro con base nitrogenada de nucleótido G. Las interacciones electrostáticas surgieron entre grupo CCl₃ de HL y tanto la base nitrogenada de nucleótido G como fullereno C₆₀.

Según resultados de simulación DM, una doble hélice de ADN en este caso se caracterizó por movilidad considerable (valor RMSD 3,08 Å), valor RMSD para HL fue 2,04 Å, mientras fullereno C₆₀ permaneció virtualmente inmóvil. Como resultado, el entorno nucleotídico de estructura HL+C₆₀ cambió a TGC-GCATG. Además, apareció enlace de hidrógeno entre grupo amino de HL y ADN e interacciones de apilamiento entre nucleótidos de bases GC nitrogenadas y fullereno C₆₀.

La unión de HL+C₆₀ con surco mayor ocurrió a través de nucleótidos C-ATCC (Fig. 4b). Se formaron enlaces de hidrógeno entre grupo CO de HL y base nitrogenada de nucleótido A. Los grupos fenilo llenaron surco mayor e ingresaron en interacción de apilamiento con fullereno C₆₀.

Según resultados DM, el entorno nucleotídico de estructura HL+C₆₀ no cambió: valores RMSD para ADN y HL fueron 3,14 y 2,24 Å, respectivamente, fullereno C₆₀ permaneció virtualmente inmóvil. En este caso, todas las interacciones entre HL y fullereno C₆₀ desaparecieron e HL interactuó estéricamente solo con ADN. Se supone que como resultado fullereno C₆₀ así como HL serían expulsados del surco mayor del ADN.

Cuando HL+C₆₀ se intercalaron en surco menor (Fig. 4c), la unión con nucleótidos CGT-GAG ocurrió. Fullereno C₆₀ resultó incorporado en surco menor e interactuó estéricamente con él. Los grupos fenilo de HL formaron interacciones de apilamiento con bases nitrogenadas de nucleótidos CG-CG. Según simulación DM, valores RMSD para ADN y HL fueron 2,29 y 2,13 Å, respectivamente, fullereno C₆₀ permaneció virtualmente inmóvil, y grupo CC1₃ de HL ingresó en interacción electrostática con base nitrogenada de nucleótido G.

En caso de versión C₆₀+HL, la unión con surco menor (Fig. 4d) ocurrió a través de nucleótidos CGC-GCC. Uno de los grupos fenilo de HL formó apilamiento con fullereno C₆₀ y el otro con nucleótido G. El grupo CC1₃ de HL apareció formando enlace electrostático con base nitrogenada de nucleótido C. Según análisis DM, valores RMSD para ADN y HL fueron 2,35 y 2,75 Å, respectivamente, fullereno C₆₀ permaneció inmóvil, y el entorno nucleotídico de estructura C₆₀+HL cambió a CGCT-GC. Además, la molécula C₆₀ penetró más profundo en ADN y formó interacción de apilamiento con base nitrogenada de nucleótido C.

Según parámetros energéticos calculados, el complejo formado en caso de intercalación C₆₀+HL en surco menor fue el más rígido (valor Bump 20,0 kJ/mol) (Tabla 1). En contraste, en caso de interacción HL+C₆₀ con ADN, este parámetro fue solo 6,2 kJ/mol cuando HL+C₆₀ intercaló en surco menor, 7,8 kJ/mol cuando se unió con surco menor, y 8,8 kJ/mol cuando se unió con surco mayor. Además, los parámetros energéticos mostraron que formación de fuertes enlaces de hidrógeno dentro del complejo HL+C₆₀+ADN fue posible solo en caso de unión con surco mayor, cuando valor Hbnd fue −2,3 kJ/mol, en otros tipos de interacción fue cero o −1,0 kJ/mol (Tabla 1). Además, según resultados DM en este caso tanto fullereno C₆₀ como HL aparecieron desplazados del surco mayor.

Por tanto, la unión C₆₀+HL con surco menor del ADN se sugiere como la versión más probable de interacción combinada de fullereno C₆₀, HL y ADN.

Estudio in vitro de efectos biológicos de HL

Viabilidad de células CCRF-CEM

En experimentos in vitro, se estimó la influencia a largo plazo de difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL) en rango 2,5–10 µM sobre viabilidad de células leucémicas humanas CCRF-CEM mediante test MTT. Las células se incubaron 24, 48 y 72 h en medio RPMI 1640 con 16 µM fullereno C₆₀ o HL solos o su combinación. La viabilidad de células incubadas sin C₆₀ o HL se consideró 100%.

A las 24 h de incubación, no se observó efecto de HL sobre viabilidad de células CCRF-CEM (Fig. 5). A incubación más prolongada, la actividad citotóxica de HL en concentraciones 5 y 10 µM se hizo obvia, la viabilidad a 48 h se inhibió 25 y 33%, respectivamente, y continuó cayendo a 72 h.

Debe notarse que disminución 50% de viabilidad de células CCRF-CEM (IC₅₀) se detectó a 72 h bajo acción de HL en concentración 10 µM (Fig. 5). Recientemente, mostramos que otro representante CAPh dimorfolido-N-tricloroacetilfosforamida causó 50% disminución de viabilidad de células CCRF-CEM a 72 h en concentración 1 mM. El análisis comparativo demuestra que la introducción de grupos fenoxi en lugar de morfolido en la estructura de derivado CAPh permitió disminuir en dos órdenes su concentración tóxica efectiva contra células leucémicas. Asumimos que la flexibilidad conformacional del núcleo –P(O)(OC₆H₅) aseguró interacción más efectiva de este compuesto con ADN.

No se detectó influencia de fullereno C₆₀ usado solo sobre viabilidad celular durante período de incubación (datos no presentados). Al mismo tiempo, resultados en Fig. 6 demuestran que fullereno C₆₀ intensificó actividad citotóxica de HL contra células CCRF-CEM. Bajo acción combinada de fullereno C₆₀ y HL, 50% disminución de viabilidad se observó a menor concentración HL (5 µM) y período más temprano (48 h) que bajo acción de HL por sí solo. Además a 72 h de acción combinada, el efecto citotóxico de HL se detectó en baja concentración 2,5 µM a la que HL por sí solo no tuvo influencia en viabilidad (Fig. 6).

Así, fullereno C₆₀ mostró potenciar efectos citotóxicos de HL y aumentar significativamente sensibilidad de células leucémicas a su acción en baja concentración. Teniendo en cuenta que fullereno C₆₀ es capaz de acumularse dentro de células leucémicas en 24 h y localizarse en compartimentos intracelulares, particularmente en el núcleo, su interacción con ADN nuclear de células cancerosas activamente proliferadas no debe excluirse.

Los datos obtenidos in vitro concuerdan con resultados de estudio in silico y demuestran que la unión inicial de molécula C₆₀ y luego HL con surco menor del ADN con formación de complejo estable podría ser una de las posibles razones de su inhibición sinérgica de proliferación de células CCRF-CEM.

Resistencia de eritrocitos a hemólisis

En estimación del potencial anticanceroso de combinación HL y fullereno C₆₀, es importante considerar sus posibles efectos en células no malignas, particularmente en células sanguíneas.

El estudio de resistencia de eritrocitos a hemólisis ácida permite dilucidar influencia de agente farmacológico a nivel de membrana. La dinámica de hemólisis refleja la dinámica de disrupción de membrana plasmática de eritrocito y por tanto la estabilidad de su organización estructural. En Fig. 7, la dependencia del porcentaje de hemólisis de eritrocitos incubados 1 h en solución NaCl sin adiciones (control) y con HL o fullereno C₆₀ solos o en combinación. No se detectó influencia de 16 µM fullereno C₆₀ en hemólisis de eritrocitos (no mostrado). HL en concentración 2,5 µM solo o en combinación con C₆₀ no afectó resistencia de eritrocitos a hemólisis (Fig. 7). Mientras, bajo acción de HL en 10 µM se detectó aceleración de hemólisis con máximo a 20 s. Acción combinada de 10 µM HL y fullereno C₆₀ fue seguida por mayor intensificación de hemólisis con 60% eritrocitos hemolisados a 20 s.

Los datos mostraron que aplicación de fullereno C₆₀ en combinación con 2,5 µM HL no tuvo efecto dañino en estabilidad estructural de membrana de eritrocitos sanguíneos y al mismo tiempo permite aumentar significativamente actividad citotóxica de HL en esta baja concentración contra células leucémicas. A pesar del efecto citotóxico sinérgico de fullereno C₆₀ y HL en 10 µM contra células leucémicas, la aplicación de su combinación apareció limitada por intensificación de efecto hemolítico.

Finalmente, en contexto del estudio in vitro anterior, es importante enfatizar que una interfaz agua/sólido tiene agua confinada que también puede afectar tanto el transporte, propiedades termodinámicas de nanoestructuras, como su interacción con membranas celulares.

Existen datos literarios sobre localización intracelular de derivados de carbacilamidofosfatos, en particular, penetración de fosforamidatos en células. Así, derivados de fosforamidato pueden penetrar a través de membrana de líneas celulares de cáncer de mama MDA-231 y pulmón (H460, H383, H2009). Mostazas de nitrobenzil fosforamida mostraron permear membranas celulares y localizarse en mitocondrias de células mamíferas NTR⁺. No se excluye que fullereno C₆₀, capaz de penetrar membrana de célula cancerosa por difusión pasiva o endocitosis con acumulación en núcleo y mitocondrias, pueda ser transportador de pequeñas moléculas antitumorales.

Conclusiones

Se sintetizó y probó un nuevo representante de derivados de carbacilamidofosfatos con dos sustituyentes fenoxi cerca del grupo fosforilo —difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato (HL)— como agente citotóxico por sí mismo y en combinación con fullereno C₆₀. Según resultados de simulación molecular, cuando fullereno C₆₀ y luego HL se unían con surco menor del ADN, se formaba un complejo rígido estabilizado por interacciones de apilamiento de grupos fenilo de HL con fullereno C₆₀ y nucleótido G de ADN, así como por interacciones de grupo CCl₃ de HL mediante enlaces ión-π con molécula C₆₀ y enlaces electrostáticos con nucleótido G de ADN.

Mediante test MTT, mostramos actividad citotóxica de HL contra células leucémicas humanas CCRF-CM con valor IC₅₀ detectado a 10 µM concentración a 72 h de tratamiento. El efecto citotóxico de HL fue facilitado por fullereno C₆₀. Bajo acción combinada de 16 µM fullereno C₆₀ y HL, el valor IC₅₀ se detectó a menor concentración 5 µM HL y período más temprano 48 h, y además el efecto citotóxico de HL se observó a baja concentración 2,5 µM a la que HL por sí solo no tuvo influencia en viabilidad.

Previamente mostramos efecto tóxico significativo de dimorfolido-N-tricloroacetilfosforamida contra células leucémicas humanas de diferente origen, pero su concentración efectiva era alta y no se observó aumento de toxicidad tras acción combinada con fullereno C₆₀. Asumimos que la introducción de grupos flexibles –P(O)(OC₆H₅) en lugar de morfolido en derivado CAPh contribuyó a bajar su concentración tóxica contra células leucémicas humanas asegurando su interacción efectiva con molécula C₆₀ y ADN. La unión de fullereno C₆₀ y HL con surco menor del ADN con formación de complejo estable se asume como una de las posibles razones de su inhibición sinérgica de proliferación de células CCRF-CEM.

Revelamos que aplicación de fullereno C₆₀ en combinación con 2,5 µM HL no tuvo efecto dañino en estabilidad estructural de membrana de eritrocitos sanguíneos, mientras combinación de fullereno C₆₀ con 10 µM HL apareció limitada por intensificación de efecto hemolítico.

Así, fullereno C₆₀ mostró potenciar efecto citotóxico de HL y aumentar significativamente sensibilidad de células leucémicas humanas a su acción en baja concentración. Una combinación de fullereno C₆₀ con HL en baja concentración 2,5 µM puede ser prometedora para futuros estudios biomédicos.

Abreviaturas

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DNA:

Ácido desoxirribonucleico

FBS:

Suero fetal bovino

HL:

Difenil-N-(tricloroacetil)-amidofosfato

IR:

Espectroscopía infrarroja

MD:

Dinámica molecular

MTT:

3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2-H-tetrazolio bromuro

NMR:

Resonancia magnética nuclear

RPMI - 1640 medio:

Medio Roswell Park Memorial Institute