Efectos del fullereno C60 sobre la interacción del difenil-N- (tricloroacetil) amidofosfato con el ADN in silico y su actividad citotóxica contra la línea celular leucémica humana in vitro

Esquema de solubilidad de difenil-N- (tricloroacetil) amidofosfato (HL) en sal de sodio

La solución de triclorofosfazotricloroacetilo (0,035 M) en 200 ml de cloroformo se añadió lentamente a una suspensión de fenolato de sodio bien agitada (0,106 M, 12,3 g) en 150 ml de cloroformo (Fig. 2; etapa 1). No se permitió que la temperatura de la mezcla sobrepasara los 40–50 ° C. Se continuó agitando durante aproximadamente 1 h, y luego se calentó la solución hasta 70ºC y se agitó durante 20 min en estas condiciones. Se evaporó el producto resultante trifenoxifosfazotricloroacetilo. Luego, se añadieron 40 ml de NaOH 1 M y se sometieron a reflujo durante 90 min (Fig. 2; etapa 2). Se evaporó una mezcla resultante. El precipitado sólido de sodio HL se lavó tres veces con éter dietílico y se recristalizó en i -propanole como un polvo cristalino blanco (rendimiento del 80%). Cristales incoloros de NaL · 3H ₂ O adecuado para análisis de rayos X se obtuvieron por i -PrOH:H ₂ O (9:1 v / v ) solución de evaporación lenta. El compuesto es estable al aire, altamente soluble en agua y alcoholes. M.p. 215 ° С.

El HL se identificó mediante análisis elemental y espectroscopia de IR y RMN:los análisis elementales (C, H, N) se realizaron utilizando el analizador elemental EL III Universal CHNOS. Se realizaron mediciones espectrales de IR para muestras como gránulos de KBr en un espectrómetro Perkin-Elmer Spectrum BX FT-IR con una resolución de 2 cm ^{- 1} y acumulaciones de 8 exploraciones, que se combinan para promediar los artefactos de absorción aleatorios en el rango espectral 4000–400 cm ^{- 1} . ¹ Los espectros de RMN H en soluciones de DMSO-d6 se registraron en un espectrómetro de RMN AVANCE 400Bruker a temperatura ambiente.

HL:IR (cm ⁻¹ ):1639 vs, sh (νCO); 1353 s, sh (Amida II); 1194 s, sh (νPO); 941 s, sh (νPN).

¹ H RMN (DMSO-d ₆ ):7.05 (t, 2H, γ-CH ₂ ); 7.205, 7.255 (dt, 8H, α- y β-CH ₂ ).

Para CCl ₃ C (O) N (Na) P (O) (OC ₆ H ₅ ) ₂ se determinó la composición elemental,%:C 40,58, H 2,35, N 3,15; y calculado,%:C 40,37, H 2,42, N 3,36.

Síntesis y caracterización de C ₆₀ Fullereno

Una solución coloidal acuosa altamente estable de C ₆₀ El fullereno (200 μM, pureza> 99,5%, tamaño medio de nanopartículas de hasta 50 nm) se sintetizó en la Universidad Técnica de Ilmenau (Alemania) como se describe en [17, 18].

Cultura de Сell

Los experimentos se realizaron en la línea celular CCRF-CM leucémica de células T aguda humana. La línea celular se adquirió del Instituto Leibniz DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares:CCRF-CM (ACC 240). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%, penicilina / estreptomicina al 1% y gluthamina 2 mM, usando 25 cm ² matraces a 37 ° C con 5% CO ₂ en incubadora humidificada.

Las células en medio RPMI 1640 se incubaron con C ₆₀ fullereno (16 μM) o HL (2.5, 5 y 10 μM) por separado y juntos durante 24, 48 y 72 h. Supervivencia celular sin la adición de HL o C ₆₀ se recibió fullereno al 100% (la muestra de control contenía DMSO 0,05 M).

Ensayo de viabilidad celular (MTT)

La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de reducción de MTT [bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio] [19]. En los puntos de tiempo de incubación indicados, alícuotas de 100 μl (0,5 × 10 ⁴ células) en las microplacas de 96 pocillos Sarstedt (Nümbrecht, Alemania), se añadieron 10 μl de solución de MTT (5 mg / ml en PBS) a cada pocillo y las placas se incubaron durante otras 2 ha 37 ° C. A continuación, se reemplazó el medio de cultivo con 100 µl de DMSO; La formación de diformazan se determinó midiendo la absorción a 570 nm con un lector de microplacas Tecan Infinite M200 Pro (Männedorf, Suiza).

Animales

El estudio se realizó en ratas macho blancas de la línea “Wistar” que pesaban 170 ± 5 g. Los animales se mantuvieron en condiciones estándar en el vivero del “Instituto de Biología y Medicina” de la ESC, Universidad Nacional Taras Shevchenko de Kiev. Los animales tenían libre acceso a comida y agua. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los principios internacionales de la Convención Europea para la protección de animales vertebrados bajo el control del Comité de Bioética de la mencionada institución.

Estimación de la hemólisis de eritrocitos

Se obtuvieron eritrocitos de sangre heparinizada de la rata de la línea “Wistar” y se diluyeron en una solución de NaCl al 0,85% hasta 0,700 u.u. a 630 nm en el espectrofotómetro Scinco (Alemania). La hemólisis de los eritrocitos fue causada por 0,001 N HCl. La cinética de la hemólisis se midió espectrofotométricamente ( λ =630 nm) cada 10 s durante 2 min. El porcentaje de eritrocitos hemolizados se calculó como se presenta en [20]. Los eritrocitos se incubaron en una solución de NaCl al 0,85% con C ₆₀ fullereno (16 μM) o HL (2.5 y 10 μM) por separado y juntos durante 1 h. Eritrocitos sin la adición de HL o C ₆₀ se recibieron fullereno al 100% (la muestra de control contenía DMSO 0,05 M).

Estudio In Silico

La molécula de ADN de doble hélice se utilizó como plantilla a partir de la base de PDB (Protein Data Bank). La interacción de la molécula de ADN con HL por separado y en combinación con C ₆₀ Se ha estudiado el fullereno. Tomamos en consideración las siguientes estructuras de la molécula de ADN:2MIW (CCATCGCTACC - intercalación del compuesto en un pequeño surco de la hélice de ADN), 1XRW (CCTCGTCC - intercalación del compuesto en un pequeño surco de la hélice de ADN) y 2M2C (GCGCATGCTACGCG - unión de compuesto con surcos grandes y pequeños de hélice de ADN). Aplicamos el algoritmo de acoplamiento sistemático (SDOCK +), integrado en el paquete QXP (este método demuestra todas las conformaciones posibles de las estructuras estudiadas con el valor mínimo de la desviación cuadrática media de la raíz (RMSD)) [21]. Generamos 300 complejos potencialmente posibles con ADN, los diez mejores de los cuales se seleccionaron para la siguiente etapa, utilizando una función de puntuación, incorporada en el paquete QXP [22].

Las interacciones de la molécula de ADN con HL por separado y en combinación con el C ₆₀ fullereno se caracterizaron por los siguientes parámetros:(1) el número de enlaces de hidrógeno, (2) el área de contacto de las superficies del ADN y la estructura correspondiente, (3) la distancia entre el ADN y la estructura acoplada, y (4) la energía total de la estructura de enlace.

Evaluar la estabilidad de los complejos de compuestos químicos con C ₆₀ fullereno, llevamos a cabo la dinámica molecular corta (MD, 100 ps) utilizando la herramienta de software Gromacs [23] de acuerdo con un algoritmo de Nosé-Poincaré-Anderson (NPA) [24, 25] basado en el campo de fuerza OPLS-AA [26, 27] .

Los cálculos se realizaron en los siguientes parámetros:temperatura (en Kelvin) - 300; presión (en kilopascal) - 100; la unión que involucra el átomo de hidrógeno o el ligando fue limitada por el algoritmo [25].

Análisis estadístico

Los datos se representaron como media ± DE de más de cuatro experimentos independientes. Se calcularon la media (M) y la desviación estándar (DE) para cada grupo. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de dos vías seguido de pruebas posteriores a Bonferroni. Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo. IBM PC realizó el procesamiento y trazado de datos utilizando aplicaciones especializadas GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., EE. UU.).

Resultados y discusiones

Estudio In Silico

Interacción de HL con ADN

Se demostró que el HL podía intercalarse en el ADN y formar un complejo estable cuando se unía en un surco menor del ADN a través de nucleótidos AGC-GCTA (Fig. 3a). En este caso, la interacción de apilamiento entre la base nitrogenada del nucleótido A y el grupo fenilo HL, así como la interacción electrostática entre CCl ₃ grupo y se formó el nucleótido C. Después de la simulación de MD, se encontró que los valores de RMSD para la doble hélice de ADN y HL eran 3,3 y 1,62 Å, respectivamente. El entorno de nucleótidos de HL (GCA-CTA) se modificó parcialmente y se perdió la interacción de apilamiento, mientras que se formó un enlace de hidrógeno entre el nucleótido G y el grupo CO de HL.

Interacción del difenil-N- (tricloroacetil) -amidofosfato (HL) con la molécula de ADN: a , b encuadernación con surcos menores y mayores; c intercalación en un surco menor. La estructura de ADN utilizada de la base de datos PDB: a , b —2M2C y c —1XRW

La unión de HL con un surco principal de ADN se produjo a través de nucleótidos TCG-AT (Fig. 3b). En este caso, se formó un enlace de hidrógeno entre el grupo CO de HL y la base nitrogenada del nucleótido A y se produjo la interacción de apilamiento entre los fenilos de HL y las bases nitrogenadas de los nucleótidos C y G. Además, una probabilidad de enlace electrostático entre HL CCl ₃ aparecieron bases nitrogenadas y nitrogenadas de nucleótidos AT.

Después de la simulación de MD, no se detectaron cambios en el entorno de nucleótidos de HL. Los valores de RMSD para ADN y HL fueron 2,77 y 1,58 Å, respectivamente. Debido a esto, la interacción de apilamiento entre el nucleótido C y el grupo fenilo desapareció.

En el caso de la intercalación de HL en el ADN, su entorno constaba de nucleótidos CG-CG (Fig. 3c). Apareció la interacción de apilamiento con nucleótidos CG:un grupo fenilo se sujetó entre las bases nitrogenadas y el otro formó una interacción de apilamiento con el nucleótido C.

Después de la simulación de MD, los valores de RMSD para ADN de doble hélice y HL fueron 1,71 y 1,89 Å, respectivamente. El entorno de nucleótidos de HL no se modificó. Uno de los grupos fenilo formó una interacción ion-π con la base nitrogenada del nucleótido G, que parecía estar desplazada en 1,12 Å.

Los parámetros de energía obtenidos testificaron que la energía de los choques estéricos entre el ADN y el HL, así como dentro del propio HL, era insignificante (Tabla 1).

Hemos realizado el análisis comparativo de los parámetros de energía de la unión de HL con surcos de ADN menores y mayores o su intercalación en surcos de ADN menores. Se demostró que los valores de protuberancia eran 6,2 kJ / mol en el caso de la intercalación de HL en el ADN y 2,5 kJ / mol en el caso de su unión con surcos de ADN menores y mayores (Tabla 1). Los valores de Int fueron 8,7 kJ / mol en el caso de la intercalación de HL en el ADN, 6,3 kJ / mol en el caso de su unión con un surco mayor del ADN y 3,6 kJ / mol en el caso de su unión con un surco menor del ADN. Estos datos mostraron que la unión de HL con un surco menor de ADN era la más estable.

Interacción combinada de HL y C ₆₀ Fullereno con ADN

Previamente con el uso de simulación por computadora, hemos demostrado que C ₆₀ molécula podría interactuar con el ADN y formar un C ₆₀ estable + Complejo de ADN cuando se une con el surco menor del ADN [15]. Como se muestra en la Fig.4, C ₆₀ El fullereno también podría formar enlaces ion-π con CCl ₃ grupos de moléculas de HL.

Interacción combinada de difenil-N- (tricloroacetil) -amidofosfato (HL) y C ₆₀ fullereno con ADN (HL + C ₆₀ o C ₆₀ + Versiones HL): a , b encuadernación con surcos menores y mayores, c , d intercalación en surcos menores y mayores. Las estructuras de ADN utilizadas de la base de datos PDB: a , b —2M2C, c —1XRW y d —2MIW

Hemos utilizado dos versiones de modelado molecular de HL, C ₆₀ fullereno y la interacción del ADN, que se propusieron en [16] y demostraron ser útiles para la interpretación de los resultados de la simulación de MD. Hemos utilizado la estructura 1XRW PDB de la molécula de ADN en la versión, cuando inicialmente HL y luego C ₆₀ la molécula se intercala en el ADN (HL + C ₆₀ ) y estructura 2MIW PDB de la molécula de ADN - en la versión, cuando inicialmente C ₆₀ molécula y luego HL se intercala en el ADN (C ₆₀ + HL).

La unión con un surco menor de ADN en el caso de HL + C ₆₀ la versión ocurrió a través de nucleótidos GCTA-GCAT (Fig. 4a). Los grupos fenilo llenaron un surco menor y entraron en interacciones de apilamiento:un grupo con C ₆₀ fullereno y el otro con la base nitrogenada del nucleótido G. Las interacciones electrostáticas surgieron entre CCl ₃ grupo de HL y la base nitrogenada del nucleótido G y C ₆₀ fullereno.

Según los resultados de la simulación de MD, una doble hélice de ADN en este caso se caracterizó por una movilidad considerable (el valor RMSD es 3,08 Å), el valor RMSD para HL fue 2,04 Å, mientras que C ₆₀ el fullereno permaneció virtualmente inamovible. Como resultado, el entorno de nucleótidos de HL + C ₆₀ TGC-GCATG cambió la estructura. Además, un enlace de hidrógeno entre el grupo amino de HL y el ADN e interacciones de apilamiento entre los nucleótidos de las bases GC nitrogenadas y C ₆₀ apareció el fullereno.

La unión de HL + C ₆₀ con un surco de ADN principal se produjo a través de nucleótidos C-ATCC (Fig. 4b). Se formaron enlaces de hidrógeno entre el grupo HL CO y la base nitrogenada del nucleótido A. Los grupos fenilo llenaron un surco principal del ADN y entraron en interacción de apilamiento con C ₆₀ fullereno.

Según los resultados de la simulación de MD, el entorno de nucleótidos de HL + C ₆₀ la estructura no se modificó:los valores de RMSD para ADN y HL fueron 3,14 y 2,24 Å, respectivamente, C ₆₀ el fullereno permaneció virtualmente inamovible. En este caso, todas las interacciones entre HL y C ₆₀ el fullereno desapareció y el HL interactuó estéricamente sólo con el ADN. Se supone que como resultado C ₆₀ tanto el fullereno como el HL serían expulsados ​​del surco principal del ADN.

Cuando HL + C ₆₀ se intercalaron en un surco menor de ADN (Fig. 4c), se produjo la unión con nucleótidos CGT-GAG. C ₆₀ El fullereno se construyó en un surco menor del ADN e interactuó con él estéricamente. Los grupos fenilo HL formaron interacciones de apilamiento con las bases nitrogenadas de los nucleótidos CG-CG. Según la simulación de MD, los valores de RMSD para ADN y HL fueron 2,29 y 2,13 Å, respectivamente, C ₆₀ fullereno permaneció virtualmente inamovible, y CC1 ₃ grupo de HL entró en interacción electrostática con la base nitrogenada del nucleótido G.

En el caso de C ₆₀ + Versión HL, la unión con un surco de ADN menor (Fig. 4d) se produjo a través de nucleótidos CGC-GCC. Uno de los grupos fenilo HL formó un apilamiento con C ₆₀ fullereno y el otro con nucleótido G. El CC1 ₃ El grupo de HL pareció formar un enlace electrostático con la base nitrogenada del nucleótido C. Según el análisis de MD, los valores de RMSD para ADN y HL en este caso fueron 2,35 y 2,75 Å, respectivamente, C ₆₀ fullereno permaneció inamovible, y el entorno de nucleótidos de C ₆₀ La estructura de + HL fue cambiada por CGCT-GC. Además, el C ₆₀ La molécula penetró más profundamente en el ADN y formó una interacción de apilamiento con la base de nitrógeno del nucleótido C.

Según los parámetros energéticos calculados, el complejo formado en el caso de C ₆₀ La intercalación de + HL en un surco menor de ADN fue la más rígida (el valor de Bump 20,0 kJ / mol) (Tabla 1). En contraste en el caso de HL + C ₆₀ interacción con el ADN, este parámetro fue de solo 6.2 kJ / mol cuando HL + C ₆₀ se intercaló en un surco de ADN menor, 7,8 kJ / mol cuando se unió con un surco de ADN menor, y 8,8 kJ / mol cuando se unió con un surco de ADN mayor. Además, los parámetros de energía mostraron que la formación de enlaces de hidrógeno fuertes dentro de HL + C ₆₀ + El complejo de ADN solo fue posible en el caso de la unión con un surco principal de ADN, cuando el valor de Hbnd era - 2,3 kJ / mol, en otros tipos de interacción era igual a cero o - 1,0 kJ / mol (Tabla 1). Además, según los resultados de MD en este caso, tanto C ₆₀ fullereno y HL parecían estar desplazados de un surco principal del ADN.

Por lo tanto, C ₆₀ Se sugiere que la unión de + HL con un surco de ADN menor es la versión más probable de C ₆₀ Interacción combinada de fullereno, HL y ADN.

Estudio in vitro de los efectos biológicos del HL

Viabilidad de las células CCRF-CЕM

En experimentos in vitro, la influencia a largo plazo del difenil-N (tricloroacetil) amidofosfato (HL) en el rango de 2,5 a 10 µM sobre la viabilidad de las células leucémicas humanas CCRF-CЕM se estimó mediante la prueba MTT. Las células se incubaron durante 24, 48 y 72 h en medio RPMI 1640 con C ₆₀ 16 μM fullereno o HL solos o su combinación. Viabilidad de las células incubadas sin C ₆₀ o HL se consideró 100%.

A las 24 h de incubación, no se observó ningún efecto de HL sobre la viabilidad de las células CCRF-CЕM (Fig. 5). Aún con una incubación más prolongada, la actividad citotóxica de HL en concentraciones de 5 y 10 μM se hizo evidente, la viabilidad celular a las 48 h se inhibió en un 25 y 33%, respectivamente, y continuó cayendo a las 72 h.

Viabilidad de las células CCRF-CEM incubadas con difenil-N- (tricloroacetil) -amidofosfato (HL) en diferentes concentraciones. (M ± m, n =8); * p <0.05 en comparación con las celdas de control

Cabe señalar que la disminución del 50% de la viabilidad de las células CCRF-CЕM (IC ₅₀ ) se detectó a las 72 h bajo la acción de HL en concentración 10 μM (Fig.5). Recientemente, hemos demostrado que otra dimorfolido-N-triclorocetilfosforilamida representativa de CAPh causó una disminución del 50% de la viabilidad de las células CCRF-CЕM a las 72 h en una concentración de 1 mM [16]. El análisis comparativo de estos datos demuestra que la introducción de fenoxi en lugar de grupos morfolido en la estructura del derivado de CAPh permitió disminuir en dos órdenes su concentración tóxica efectiva contra las células leucémicas. Suponemos que la flexibilidad conformacional de –P (O) (OC ₆ H ₅ ) garantizó una interacción más eficaz de este compuesto con el ADN.

Sin influencia de C ₆₀ Se detectó fullereno usado solo sobre la viabilidad celular durante el período de incubación (datos no presentados). Al mismo tiempo, los resultados que se muestran en la Fig.6 demuestran que C ₆₀ fullereno intensificó la actividad citotóxica de HL contra las células CCRF-CЕM. Bajo la acción combinada de C ₆₀ fullereno y HL, se observó una disminución del 50% de la viabilidad celular a menor concentración de HL (5 μM) y en un período de incubación más temprano (48 h) que bajo la acción de HL por sí mismo. Además a las 72 h de acción combinada de C ₆₀ fullereno y HL, el efecto citotóxico del HL se detectó en una concentración baja de 2,5 μM en la que el HL por sí solo no influyó en la viabilidad celular (Fig. 6).

Viabilidad de las células CCRF-CEM incubadas con difenil-N- (tricloroacetil) amidofosfato (HL) solo o en combinación con C ₆₀ 16 μM fullereno. (M ± m, n =8); * p <0,05 en comparación con las células de control; ^# p <0.05 en comparación con HL

Por lo tanto, C ₆₀ Se demostró que el fullereno potencia los efectos citotóxicos del HL y aumenta significativamente la sensibilidad de las células leucémicas a su acción en una concentración baja. Teniendo en cuenta que C ₆₀ fullereno es capaz de acumularse dentro de las células leucémicas durante 24 h [28] y de localizarse en compartimentos intracelulares [29,30,31], particularmente en el núcleo [32, 33], su interacción con el ADN nuclear de las células cancerosas proliferadas activamente no debe ser excluido.

Por tanto, los datos obtenidos in vitro están de acuerdo con los resultados del estudio in silico y demuestran que la unión inicial de C ₆₀ molécula y luego de HL con surco menor de ADN con formación de un complejo estable podría ser una de las posibles razones de su inhibición sinérgica de la proliferación de células CCRF-CЕM.

Resistencia de los eritrocitos a la hemólisis

Sobre la estimación del potencial anticáncer de HL y C ₆₀ combinación de fullereno, es importante tener en cuenta sus posibles efectos sobre las células no malignas, en particular sobre las células sanguíneas.

El estudio de la resistencia de los eritrocitos a la hemólisis ácida permite dilucidar la influencia del agente farmacológico a nivel de membrana. La dinámica de la hemólisis refleja la dinámica de la rotura de la membrana plasmática de los eritrocitos y, por tanto, la estabilidad de su organización estructural. En la Fig.7, la dependencia del porcentaje de hemólisis eritrocitos se incubó durante 1 h en solución de NaCl sin adiciones (control) y con HL o C ₆₀ fullereno solo o en combinación. Sin influencia de 16 μM C ​​ ₆₀ fullereno en eritrocitos se detectó hemólisis (no mostrado). HL en concentración de 2,5 μM solo o en combinación con C ₆₀ Resistencia de los eritrocitos afectados a la hemólisis (Fig. 7). Mientras tanto, bajo la acción de HL en una concentración de 10 μM se detectó una aceleración de la hemólisis con un máximo a los 20 s. Acción combinada de 10 μM HL y C ₆₀ El fullereno fue seguido de una mayor intensificación de la hemólisis con un 60% de eritrocitos hemolizados a los 20 s.

Resistencia de los eritrocitos a la hemólisis en presencia de difenil-N- (tricloroacetil) amidofosfato (HL) por separado y en combinación con C ₆₀ 16 μM fullereno. (M ± m, n =8)

Los datos obtenidos mostraron que la aplicación de C ₆₀ El fullereno en combinación con 2,5 µM de HL no tuvo ningún efecto perjudicial sobre la estabilidad estructural de la membrana de los eritrocitos sanguíneos y al mismo tiempo permitió aumentar significativamente la actividad citotóxica de HL en esta baja concentración contra las células leucémicas. A pesar del efecto citotóxico sinérgico de C ₆₀ fullereno y HL en una concentración de 10 μM contra las células leucémicas, la aplicación de su combinación parecía estar limitada por la intensificación del efecto hemolítico.

Finalmente, en el contexto del estudio in vitro anterior, es importante enfatizar que una interfaz agua / sólido tiene agua confinada que también puede afectar tanto el transporte, las propiedades termodinámicas de las nanoestructuras [34, 35], y su interacción con las membranas celulares. [36].

Hay datos bibliográficos sobre la localización intracelular de derivados de carbacilamidofosfatos, en particular, la penetración de fosforamidatos en las células. Por tanto, los derivados de fosforamidato pueden penetrar en la membrana de las líneas celulares de cáncer de mama y de pulmón (H460, H383 y H2009) MDA-231 [37]. Se demostró que las mostazas de nitrobencilfosforamida penetran a través de las membranas celulares y se localizan en las mitocondrias de NTR ⁺ células de mamífero [10]. No se excluye que C ₆₀ El fullereno, que es capaz de penetrar la membrana de la célula cancerosa debido a la difusión pasiva o endocitosis [28, 30, 32] con acumulación en el núcleo y las mitocondrias [30, 32, 33], podría ser un transportador de pequeñas moléculas antitumorales [ 38,39,40].

Conclusiones

Se sintetizó un nuevo representante de derivados de carbacilamidofosfatos que tienen dos sustituyentes fenoxi cerca del grupo fosforilo difenil-N- (tricloroacetil) amidofosfato (HL) y se probó como un agente citotóxico en sí mismo y en combinación con C ₆₀ fullereno. Según los resultados de la simulación molecular, cuando C ₆₀ fullereno y luego HL se unieron con un surco menor de ADN, se formó un complejo rígido estabilizado apilando interacciones de grupos fenilo HL con C ₆₀ fullereno y nucleótido de ADN G, así como por interacciones de HL CCl ₃ agrupar por enlaces ion-π con C ₆₀ molécula y mediante enlaces electrostáticos con el nucleótido del ADN G.

Con el uso de la prueba MTT, hemos demostrado actividad citotóxica de HL contra células CCRF-CM leucémicas humanas con IC ₅₀ valor detectado a una concentración de 10 μM a las 72 h de tratamiento con células. El efecto citotóxico de HL fue facilitado por C ₆₀ fullereno. Bajo la acción combinada de 16 μM C ​​ ₆₀ fullereno y HL, el valor de IC ₅₀ se detectó a una concentración más baja de 5 μM de HL y en un período de incubación de 48 h más temprano y, además, se observó el efecto citotóxico de HL a una concentración baja de 2.5 μM en la que el HL por sí solo no influyó en la viabilidad celular.

Anteriormente, hemos demostrado un efecto tóxico significativo de dimorfolido-N-tricloroacetilfosforamida contra células leucémicas humanas de diferente origen, pero su concentración efectiva fue alta y no aumentó la toxicidad después de la acción combinada con C ₆₀ se observó fullereno [16]. Suponemos que la introducción de flexible de –P (O) (OC ₆ H ₅ ) grupos en lugar de grupos morfolido en el derivado de CAPh contribuyó a reducir su concentración tóxica contra las células leucémicas humanas asegurando su interacción efectiva con C ₆₀ molécula y ADN. Enlace de C ₆₀ Se supone que el fullereno y HL con surco menor de ADN con formación de un complejo estable es una de las posibles razones de su inhibición sinérgica de la proliferación de células CCRF-CЕM.

Hemos revelado que la aplicación de C ₆₀ El fullereno en combinación con 2,5 μM HL no tuvo ningún efecto dañino sobre la estabilidad estructural de la membrana de los eritrocitos sanguíneos, mientras que la combinación de C ₆₀ El fullereno con 10 μM de HL parecía estar limitado por la intensificación del efecto hemolítico.

Por lo tanto, C ₆₀ Se demostró que el fullereno potencia el efecto citotóxico de HL y aumenta significativamente la sensibilidad de las células leucémicas humanas a su acción en una concentración baja. Una combinación de C ₆₀ El fullereno con HL en una concentración baja de 2,5 μM puede ser prometedor para más estudios biomédicos.

Abreviaturas

DMSO:

Dimetilsulfóxido

ADN:

Ácido desoxirribonucleico

FBS:

Suero fetal bovino

HL:

Difenil-N- (tricloroacetil) amidofosfato

IR:

Espectroscopia infrarroja

MD:

Dinámica molecular

MTT:

Bromuro de 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolio

RMN:

Resonancia magnética nuclear

RPMI - 1640 medio:

Medio del Roswell Park Memorial Institute

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