La complejación con fullereno C60 aumenta la eficacia de la doxorrubicina contra las células leucémicas in vitro

Tamaño hidrodinámico (diámetro, nm) de 1 μM С ₆₀ -Complejos Dox en medio de cultivo celular RPMI suplementado con FBS al 10% a 0 ( a ) y 72 h ( b ) incubación. Porcentaje de intensidad (%) de toda la intensidad de luz dispersa

Los datos de dispersión de luz dinámica en 1 μM C ​​ ₆₀ -La distribución del diámetro hidrodinámico del nanocomplejo Dox 1:1 y 2:1 en cultivo celular suplementado con FBS mostró que su tamaño era 138 ± 6 nm y 139 ± 5 nm cuando se midió inmediatamente (Fig. 3a) y 146 ± 4 nm y 144 ± 5 nm después de 72 h de incubación (Fig. 3b), respectivamente.

La estabilidad detectada del máximo (alrededor de 140 nm) indicó que no hubo agregación adicional del C ₆₀ -Complejos de Dox durante una incubación prolongada en medio de cultivo celular complementado con FBS que confirmó su idoneidad para estudios in vitro.

Viabilidad celular

La viabilidad de las células leucémicas humanas de diferentes líneas se estimó mediante la prueba MTT a las 24, 48 y 72 h de incubación en presencia de C ₆₀ -Complejos de Dox así como de Dox libre por separado a concentraciones equivalentes. C ₆₀ solo en concentraciones equivalentes a las de los complejos no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad de las células leucémicas (datos no mostrados).

La Figura 4 presenta la disminución dependiente del tiempo y de la concentración de la viabilidad de las células leucémicas bajo el tratamiento con Dox. Se demostró que el fármaco presenta toxicidad contra las células leucémicas en el rango nanomolar. Se encontró que la sensibilidad de las células leucémicas al Dox sigue el orden Molt-16 ˃ THP1 ˃ Jurkat ˃ CCRF-CEM (menos sensible).

Viabilidad de las células leucémicas CCRF-CEM, Jurkat, THP1 y Molt16, tratadas con dosis iguales de Dox o C ₆₀ libres -Complejos Dox durante 24, 48 y 72 h (* p ≤ 0.05 en comparación con el Dox gratuito, ** p ≤ 0.05 en comparación con el C ₆₀ -Complejo Dox 1:1, n =5)

Bajo la acción de Dox 100 nM, la viabilidad de las células CCRF-CEM disminuyó a 84 ± 7, 50 ± 4 y 34 ± 7% en comparación con el control a las 24, 48 y 72 h, respectivamente. El patrón comparable de efecto tóxico Dox 100 nM se encontró en células Jurkat. Se encontró que la viabilidad de las células THP1 después del tratamiento con células Dox 100 nM era 50 ± 4, 47 ± 5 y 13 ± 4% a las 24, 48 y 72 h, respectivamente. Se estimó que las concentraciones de Dox inhibidoras semimáximas (IC50) para las células CCRF-CEM, THP1 y Jurkat a las 72 h de incubación eran 80 ± 9, 43 ± 5 y 38 ± 6 nM, respectivamente. Estos datos corresponden a datos de la literatura [48, 49]. Las células Molt-16 parecían ser las más sensibles al fármaco, ya que su efecto tóxico se detectó en el rango de 1 a 25 nM en todos los períodos de incubación celular. La viabilidad de las células Molt-16 tratadas con 5 nM Dox disminuyó a 75 ± 4, 28 ± 4 y 18 ± 4% de la del control a las 24, 48 y 72 h, respectivamente, y el valor de IC50 a las 72 h fue igual a solo 2,0 nM. La alta sensibilidad similar de las células Molt-16 con una inducción de apoptosis 10 veces más intensa en comparación con las células Jurkat bajo tratamiento con un alcaloide herbal fue previamente informada por Cai et al. [50].

Las células tratadas con Dox libre se utilizaron como control para evaluar la viabilidad bajo la acción de C ₆₀ -Complejos Dox a las dosis equivalentes del fármaco. El valor de IC50 para Dox y C ₆₀ gratuitos -Los complejos Dox se calcularon para cada punto de tiempo y línea celular y se enumeran en la Fig. 4.

Se demostró que tanto C ₆₀ -Los complejos Dox poseían un mayor potencial tóxico en comparación con el Dox libre contra las líneas celulares leucémicas humanas (Fig. 4).

En resumen, nuestros numerosos experimentos mostraron para las cuatro líneas celulares una variedad de toxicidades mejoradas hasta 3,5 veces. C ₆₀ -El complejo Dox 1:1 ha mostrado una mayor toxicidad en comparación con el complejo 2:1. El efecto menos pronunciado (disminución de IC50 ≥ 2,5 veces en comparación con el de Dox libre) del complejo 2:1 se puede atribuir a la mayor concentración de C ₆₀ como su componente. Debido a su actividad antioxidante [11, 13], el exceso de C ₆₀ puede proteger las células contra el estrés oxidativo asociado a Dox [27].

Acumulación intracelular de Dox libre y C ₆₀ -Complejos Dox

Para investigar una posible correlación del efecto tóxico mejorado de C ₆₀ -Dox complejos con una acumulación de fármaco intracelular más eficaz, la captación celular de Dox libre y C ₆₀ -Dox fue estudiado. Dado que Dox posee una fuerte absorción y fluorescencia en la región espectral visible [43, 45] (Fig. 2), el seguimiento de los complejos Dox es posible con técnicas no invasivas basadas en fluorescencia directa. Las células CCRF-CEM se incubaron en presencia de Dox 1 μM o C ₆₀ -Complejos de Dox en una concentración equivalente de fármaco, examinados con microscopía fluorescente y sometidos a citometría de flujo para cuantificar el nivel intracelular de fármaco acumulado después de 1, 3 y 6 h de tratamiento (Fig. 5). La intensidad de fluorescencia media de cada muestra se calculó a partir de histogramas logarítmicos de FACS mediante el valor de la señal fluorescente roja Dox respectiva (λ _ex =488 nm, λ _em =585/29 nm) y se presenta en la Tabla 2. Se utilizó la autofluorescencia de las células no tratadas como control negativo (Fig. 5a).

Acumulación intracelular de 1 μM libre y C ₆₀ Dox complejado. Citometría de flujo ( a ) e imágenes de microscopía fluorescente ( b ) de células CCRF-CEM incubadas con Dox y C ₆₀ -Dox en ratio 1:1 y 2:1 durante 1, 3 y 6 h. Barra de escala 20 μM

La acumulación dependiente del tiempo de Dox 1 µM se estimó mediante el aumento de la intensidad de la fluorescencia (Fig. 5, Tabla 2). Las imágenes de microscopía de fluorescencia ilustran que C ₆₀ -Los complejos de Dox se internalizaron más rápidamente que el fármaco libre, como lo demuestra la fluorescencia intracelular mucho más brillante (Fig. 5b). Las intensidades fluorescentes medias de las células CCRF-CEM, tratadas con C ₆₀ 1:1 -Dox complejo a 1 μM de concentración de Dox-equivalente, se incrementaron en 1,5, 1,7 y 2,2 veces en comparación con Dox libre a 1, 3 y 6 h, respectivamente. 2:1 C ₆₀ -El complejo Dox exhibió una acumulación de fármaco intracelular retardada que alcanzó el mismo nivel que el complejo 1:1 a las 6 h (Fig. 5, Tabla 2).

Los datos obtenidos demostraron que la complejación de Dox con C ₆₀ promovió la entrada en las células pero no afectó su localización. La tinción de control de las células estudiadas con el colorante de unión al ADN Hoechst 33342 reveló su colocalización con la señal Dox (datos no mostrados). Evidentemente, moléculas Dox de C ₆₀ complejos y el fármaco libre entraron en los núcleos que reflejan su impacto antiproliferativo a través del daño del ADN [26, 27, 28]. Una mayor captación intracelular del fármaco tras la complejación con C ₆₀ apunta a que este último funciona como un promotor del transporte de fármacos. C ₆₀ Se demostró que la nanoestructura transmigra la membrana plasmática celular debido a la difusión pasiva [51] y / o endocitosis / pinocitosis [52, 53], mientras que moléculas tan pequeñas como Dox pueden penetrar sólo a través de la difusión pasiva. El C ₆₀ La estructura se asemeja a la estructura de la clatrina [54, 55], el principal componente de la capa de formación de vesículas durante la endocitosis. Por lo tanto, C ₆₀ puede funcionar como un transportador de pequeñas moléculas aromáticas [56]. Por el contrario, un enlace covalente entre el portador y la carga introduce una alteración estructural en la molécula del fármaco. En consecuencia, el patrón de acumulación y la interacción con los objetivos intracelulares se alteran dando como resultado la pérdida total o parcial de la función del fármaco. Liu y col. [15] mostró que C ₆₀ con dos moléculas Dox unidas a través de un enlace amida se distribuyó predominantemente en el citoplasma.

Conclusión

Las propiedades fisicoquímicas del C ₆₀ -Se determinaron los complejos Dox con relación 1:1 y 2:1 de los componentes, y se estimó su toxicidad contra las células leucémicas humanas CCRF-CEM, Jurkat, Molt-16 y THP1.

El análisis HPLC-MS / MS reveló distinciones evidentes en los cromatogramas de Dox libre y los liberados de C ₆₀ -Complejos Dox. Complejamiento de C ₆₀ con Dox fue confirmado por efecto hipocrómico de absorción y extinción de fluorescencia en C ₆₀ -Complejos Dox. Determinamos que el tamaño de C ₆₀ -Los complejos Dox alrededor de 140 nm se retuvieron en presencia de proteína y una incubación prolongada en el medio. Los estudios sobre líneas celulares leucémicas humanas revelaron que C ₆₀ -Los complejos Dox poseían una mayor citotoxicidad en comparación con el fármaco libre en concentraciones equivalentes. A las 72 h de incubación de las células, el valor de IC50 para los complejos 1:1 y 2:1 disminuyó en ≤ 3,5 y ≤ 2,5 veces, respectivamente, en comparación con IC50 para el fármaco libre. Complejamiento con C ₆₀ promovió la entrada de Dox en las células leucémicas. Un tratamiento de células CCRF-CEM durante 6 h con C ₆₀ -A los complejos de Dox en una concentración equivalente de Dox 1 μM le siguió un aumento de 2,2 veces del nivel intracelular del fármaco en comparación con el tratamiento con Dox libre.

Nuestros resultados confirman la función de C ₆₀ como nanoportador y la perspectiva de su aplicación para la optimización de la eficiencia Dox contra las células leucémicas. Como Dox es solo una sustancia representativa o modelo para muchos medicamentos antitumorales, esperamos que nuestros hallazgos puedan transferirse a otros medicamentos. El aumento de la absorción de un fármaco en las células tumorales y / o sus cualidades antitumorales puede apuntar hacia nuevas estrategias de tratamiento. La complejación de fármacos con nanoportadores puede servir para reducir sus tasas de dosis eficaces y, por lo tanto, atenuar los efectos secundarios no deseados.

Historial de cambios

Abreviaturas

C ₆₀ :

C ₆₀ fullereno

DMSO:

Dimetilsulfóxido

Dox:

Doxorrubicina

ESI:

Ionización por electropulverización

FBS:

Suero fetal bovino

HPLC-MS / MS:

Espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de alto rendimiento

IC50:

Concentración inhibitoria semimáxima

LOD:

Límite de detección

LOQ:

Limit of quantification

MRM:

Multiple reactions monitoring

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

Caracterizaciones estructurales y propiedades dieléctricas de polvos de PbTiO3 en forma de esfera y varilla sintetizados mediante síntesis de sales fundidas Fácil preparación y caracterización de la matriz de nanotubos de TiO2 codecorados con polianilina y CeO2 y su actividad fotoelectrocatalítica altamente eficiente