Nanocomplejos de Fullereno C₆₀ Potencian Doxorubicina Contra Células Leucémicas In Vitro

Resumen

La quimioterapia tradicional a menudo falla debido a efectos secundarios severos y la rápida aparición de multirresistencia a fármacos. Investigamos el fullereno C₆₀ como transportador a nanoescala para doxorubicina (Dox) para mejorar la entrega específica a células leucémicas. Complejos no covalentes C₆₀-Dox (ratios 1:1 y 2:1) se caracterizaron por UV/Vis, dispersión dinámica de luz y HPLC-MS/MS, confirmando un tamaño de nanopartícula estable de 140 nm adecuado para uso biológico. En líneas celulares leucémicas (CCRF-CEM, Jurkat, THP-1, Molt-16), estos complejos mostraron hasta 3,5 veces mayor citotoxicidad que Dox libre a concentraciones nanomolares, con evidencia de acumulación intracelular que respalda una entrega mejorada. Estos hallazgos sugieren el fullereno C₆₀ como un nanotransportador prometedor para mejorar la eficacia de Dox contra la leucemia.

Introducción

La nanotecnología biológica ofrece una vía hacia terapias anticancerígenas más selectivas y potentes. El fullereno C₆₀, una nanoestructura de carbono esférica, exhibe propiedades fisicoquímicas únicas, actividad antioxidante intrínseca y capacidades probadas de carga de fármacos. La doxorubicina, aunque efectiva, está limitada por cardiotoxicidad y estrés oxidativo. Combinar Dox con C₆₀ aprovecha las propiedades antioxidantes del fullereno y su potencial de entrega de fármacos para mitigar efectos secundarios y mejorar la dirigencia tumoral. Estudios previos han mostrado que complejos no covalentes de C₆₀ pueden mejorar la actividad anticancerígena in vitro e in vivo. Este estudio evalúa las características fisicoquímicas, captación celular y potencia citotóxica de complejos C₆₀-Dox contra líneas celulares leucémicas humanas.

Métodos

Materiales

Químicos y líneas celulares se obtuvieron de proveedores estándar (Biochrom, Sigma-Aldrich, Instituto Leibniz DSMZ). Las condiciones de cultivo celular siguieron protocolos estándar ISO.

Preparación de Complejos

Coloides acuosos de C₆₀ prístino se prepararon vía sonicación por ultrasonido, logrando pureza de 150 µg mL⁻¹ y diámetro hidrodinámico de 100 nm. Dox se disolvió a 150 µg mL⁻¹ y se mezcló con C₆₀ en ratios de peso 1:1 o 2:1, sonicado por 30 min y agitado 24 h a temperatura ambiente. El fármaco libre en exceso se removió por diálisis. Las concentraciones finales de complejos fueron 75 µg mL⁻¹ (1:1) y 100/50 µg mL⁻¹ (2:1). La estabilidad se confirmó por 6 meses en salina.

Caracterización Analítica

HPLC-MS/MS (Shimadzu LCMS-8040) cuantificó la liberación de Dox, usando columna C18 y fase móvil acetonitrilo:agua con 0,1 % ácido fórmico 80:20. Espectros de absorción UV/Vis y fluorescencia se registraron con un Tecan Infinite M200 Pro. Dispersión dinámica de luz (Malvern Zetasizer Nano S) midió tamaño de partícula en PBS y RPMI-1640 +10 % FBS.

Viabilidad Celular

Ensayos MTT evaluaron viabilidad de 10⁴ células/pozo tras 24, 48 y 72 h de exposición a Dox libre o complejos C₆₀-Dox a 0,1–100 µM. Valores IC₅₀ se derivaron via regresión no lineal (GraphPad Prism 7).

Estudios de Captación

Microscopía de fluorescencia (Keyence BZ-9000) y citometría de flujo (BD FACSJazz) cuantificaron Dox intracelular tras 1, 3 y 6 h de exposición a 1 µM fármaco libre o complejado en células CCRF-CEM.

Resultados

Estabilidad y Tamaño del Complejo

Los cromatogramas HPLC-MS/MS revelaron tiempos de retención distintos para Dox libre (11,66 min) versus Dox unido al complejo (9,44 min), confirmando la formación del complejo. Los espectros UV/Vis mostraron un desplazamiento hipocrómico del 30 % en absorbancia, mientras que el apagado de fluorescencia (~50 % a 3 µM) indicó apilamiento π-π cercano entre Dox y C₆₀. DLS determinó un diámetro hidrodinámico promedio de ~140 nm, estable en PBS y tras 72 h incubación en RPMI-1640 +10 % FBS.

Citotoxicidad Mejorada

Las cuatro líneas leucémicas exhibieron sensibilidad nanomolar a Dox, con valores IC₅₀ variando de 2 nM (Molt-16) a 80 nM (CCRF-CEM). Los complejos C₆₀-Dox redujeron consistentemente los valores IC₅₀ hasta 3,5 veces comparado al fármaco libre, con el complejo 1:1 superando al ratio 2:1. El mayor contenido de C₆₀ en el complejo 2:1 puede conferir protección antioxidante, mitigando el estrés oxidativo inducido por Dox.

Aumento de Captación Intracelular

Microscopía de fluorescencia y citometría de flujo demostraron que los complejos C₆₀-Dox entraron a las células más rápidamente que Dox libre, logrando un aumento de 1,5–2,2 veces en fluorescencia intracelular a las 6 h. Dox se localizó en el núcleo en ambas formulaciones, confirmado por colocalización con tinción Hoechst 33342.

Conclusión

El fullereno C₆₀ forma complejos estables, de 140 nm, no covalentes con doxorubicina que aumentan marcadamente su citotoxicidad contra células leucémicas humanas. El nanotransportador facilita una captación celular más rápida sin alterar la localización del fármaco, logrando hasta 3,5 veces mayor potencia a dosis equivalentes. Estos resultados apoyan el desarrollo adicional de nanocomplejos C₆₀ para reducir concentraciones efectivas de Dox, potencialmente reduciendo cardiotoxicidad y otros efectos adversos en entornos clínicos.