Nanoagujas funcionalizadas con folato y libres de disolventes para la administración dirigida de 10-hidroxicanptotecina

Antecedentes

Durante las últimas dos décadas, la investigación se ha centrado en superar las limitaciones farmacocinéticas de la quimioterapia convencional mediante sistemas de administración basados en nanopartículas que proporcionan circulación prolongada, direccionamiento activo y capacidades de imagen multimodal [1, 2]. Los avances recientes han resaltado la importancia de la forma de la partícula, ya que las nanoestructuras de alta relación de aspecto muestran una internalización celular y penetración tumoral mejoradas [10, 26]. Sin embargo, la mayoría de estas estrategias aún dependen de disolventes orgánicos para solubilizar fármacos hidrofóbicos, lo que genera preocupaciones sobre residuos de disolventes que pueden acumularse en el organismo y suponer riesgos de seguridad [27]. Nuestro estudio aborda esta brecha desarrollando nanoagujas cargadas con HCPT y modificadas con folato mediante un método completamente ecológico y libre de disolventes, combinando así alta carga de fármaco, administración dirigida y potencial de imagen.

Métodos

Materiales

Todos los reactivos fueron de grado analítico y se utilizaron tal como se recibieron. Se empleó agua desionizada en todo momento. El ácido fólico (FA) se obtuvo de Bio Basic Inc.; la HCPT (> 99 % pureza) de Lishizhen Pharmaceutical Co.; el quitosano (Pm = 70 kDa, 90 % desacetilación) de Zhejiang Aoxing; NHS y EDC de Sigma‑Aldrich.

Síntesis del conjugado FA‑quitosano

El FA (10 mg), quitosano (20 mg), EDC (4 mg) y NHS (4 mg) se agitaron en 2 mL de PBS (pH 5,5) a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla se dializó contra tampón pH 10 para eliminar el exceso de FA, luego se centrifugó (5 000 rpm) y liofilizó durante 24 h para obtener el polvo CS‑FA.

Preparación de las HFND

La HCPT (10 µg) se disolvió en 200 µL de NaOH 0,1 M (solución A); el CS‑FA (10 µg) en 200 µL de HCl 0,1 M (solución B). Las soluciones A y B se añadieron gota a gota a 1 mL de agua pura bajo agitación vigorosa durante 30 s, y luego se sonicaron (200 W, baño de hielo) durante 6 min. La suspensión resultante se centrifugó (10 000 rpm, 5 min) y liofilizó durante 24 h. Para comparación, se utilizó quitosano solo en lugar de CS‑FA en la solución B para producir nanoagujas no dirigidas (ND).

Caracterización

La morfología se visualizó mediante MEB (UV‑70, 15 kV). El tamaño de partícula y el potencial zeta se midieron con un Malvern Zetasizer Nano‑ZS. La difracción de rayos X (XRD, X'pert PRO) evaluó la cristalinidad. El contenido de FA se cuantificó por UV a 281 nm; la carga de HCPT por fluorescencia a 383 nm. Las eficiencias de carga y encapsulación se calcularon usando las ecuaciones (1)–(4) a continuación.

$$ \begin{aligned} \text{Carga de fármaco \%} &= \frac{\text{peso de HCPT en HFND}}{\text{peso de HFND}} \times 100\% \quad (1) \\ \text{Eficiencia de encapsulación \%} &= \frac{\text{peso de fármaco en HFND}}{\text{peso de fármaco alimentado}} \times 100\% \quad (2) \\ \text{FA \% en conjugación} &= \frac{\text{peso de FA en conjugación}}{\text{peso de conjugación}} \times 100\% \quad (3) \\ \text{Carga de FA \%} &= (1 - \text{carga de HCPT \%}) \times \text{FA \% en conjugación} \times 100\% \quad (4) \end{aligned} $$

Estudio de liberación in vitro

Las HFND se dispersaron en 10 mL de PBS y se colocaron en una bolsa de diálisis de 3 kDa MWCO, luego se sumergieron en 200 mL de PBS (pH 7,4) a 37 °C, 100 rpm. Las muestras se recolectaron durante 48 h y analizaron por espectroscopía de fluorescencia.

Imagen confocal de células

Las células HeLa se sembraron e incubaron 24 h antes de la exposición a las HFND durante 8 h. La obtención de imágenes se realizó en un microscopio confocal Leica (excitación HCPT 382 nm, emisión 500–550 nm).

Captación celular medida por fluorescencia

Tras 6 h de incubación con ND o HFND (HCPT equivalente), las células se lavaron, digirieron con tripsina/EDTA y sonicaron. El contenido de HCPT se cuantificó por fluorescencia a 382 nm.

Ensayos de citotoxicidad

Los ensayos MTT se realizaron en células HeLa sembradas en placas de 96 pocillos. Tras 24 h de exposición al fármaco, se añadieron 20 µL de MTT 5 mg/mL durante 4 h, seguidos de 150 µL de DMSO. La absorbancia se leyó a 570 nm.

Biodistribución

Las ND y HFND cargadas con DiR se inyectaron por vía intravenosa en ratones nu portadores de xenoinjertos de HeLa. La obtención de imágenes por fluorescencia se realizó con un sistema Maestro a 1, 4, 8, 12 y 24 h. La obtención de imágenes ex vivo del tumor y órganos principales se realizó a las 24 h.

Inhibición tumoral in vivo

Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron ~60 mm³, los ratones recibieron inyecciones intravenosas de suero salino, HCPT libre, ND o HFND (80 µg HCPT por ratón) cada 3 días. El volumen tumoral (0,5 × L × W²) y el peso corporal se monitorizaron durante 21 días. Post mortem, los tumores se pesaron y se tiñeron con H&E para histología.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante prueba t de Student bilateral; p < 0,05 indicó significancia (95 % confianza).

Resultados y discusión

Síntesis del conjugado FA‑quitosano

El FA se enlazó covalentemente al quitosano mediante una amidación mediada por EDC/NHS (Fig. 1). Los espectros FT‑IR (Fig. 2) revelaron un estiramiento C=O pronunciado a 1605 cm⁻¹, confirmando la formación del enlace amida. La cuantificación por UV arrojó una carga de FA del 23,4 ± 2,5 % en el conjugado.

Preparación de las HFND

Se aprovechó la insolubilidad acuosa de la HCPT y la solubilidad ácida del quitosano: la HCPT se disolvió en NaOH y el CS‑FA en HCl. La neutralización de ambas soluciones produjo un disolvente pobre para ambas especies, desencadenando la precipitación de HCPT y la encapsulación simultánea de CS‑FA en nanoagujas (Fig. 3a). Los ultrasónicos y la estabilización estérica del CS‑FA impidieron el crecimiento masivo de cristales, generando nanoagujas de alta relación de aspecto (Fig. 3b–c). Un cribado de diseño de experimentos (Tabla 1) optimizó la relación HCPT:CS‑FA, potencia ultrasónica, pH y concentración para lograr la morfología deseada.

El análisis MEB (Fig. 4) mostró que el exceso de CS‑FA recubría la superficie de la partícula, mientras que un CS‑FA insuficiente provocaba agregación. El pH neutro fue esencial para preservar la integridad de las nanoagujas, y la potencia ultrasónica influyó en la agregación y fragmentación. Una mayor concentración de la mezcla redujo el tamaño de partícula, confirmado por DLS (Fig. 4f). Las HFND optimizadas mostraron una longitud media de ~800 nm, anchura ~80 nm, diámetro hidrodinámico 104,3 ± 5,7 nm y potencial zeta +16,3 ± 1,9 mV. La dispersión al 2 % p/v permaneció estable durante ≥2,5 días.

La carga de fármaco fue 70,2 ± 3,1 % y la eficiencia de encapsulación 83,1 %. El FA representó el 7,0 % de la masa total, calculado a partir del porcentaje de FA en el conjugado.

Análisis XRD

Los patrones XRD (Fig. 5) confirmaron que la HCPT permaneció cristalina dentro de las HFND, mientras que el quitosano semicristalino aportó picos anchos. En contraste, los cristales masivos de HCPT (Fig. 6) fueron en forma de varilla y >10 µm de largo, subrayando el papel del CS‑FA en la modulación de la cinética de crecimiento de HCPT.

Estudios de liberación in vitro

La HCPT libre liberó el 30 % en 1 h y casi el 100 % a las 18 h. Las HFND exhibieron una liberación marcadamente más lenta y sostenida durante 48 h (Fig. 7), atribuida a la barrera de difusión del recubrimiento CS‑FA. Este perfil es ideal para mantener concentraciones terapéuticas mientras se minimiza la toxicidad relacionada con picos.

Captación celular

La obtención de imágenes confocales (Fig. 8) reveló una fluorescencia de HCPT más intensa en células HeLa tratadas con HFND versus ND no dirigidas, indicando captación mediada por folato. La fluorescencia cuantitativa (Fig. 9) corroboró una mayor tasa de internalización para las HFND, validando la estrategia de direccionamiento.

Ensayos de citotoxicidad

Los resultados MTT (Fig. 10) mostraron que las HFND lograron mayor muerte celular que HCPT libre o ND a concentraciones equivalentes de HCPT, subrayando el doble beneficio de la administración dirigida y liberación sostenida. La citotoxicidad mejorada se atribuye a una internalización eficiente mediada por receptores y un perfil prolongado de liberación intracelular del fármaco.

Biodistribución

La obtención de imágenes in vivo (Fig. 11a) demostró señal tumoral despreciable para DiR‑ND, mientras que DiR‑HFND mostró una acumulación pronunciada y dependiente del tiempo, con pico a las 12 h. El análisis ex vivo (Fig. 11b–c) confirmó mayor fluorescencia tumoral para HFND, indicando direccionamiento tumoral mediado por folato exitoso.

Inhibición tumoral in vivo

Las HFND lograron la supresión más significativa del crecimiento tumoral, con pesos tumorales finales marcadamente menores que HCPT libre o ND (Fig. 12c). La histología (Fig. 12d) reveló necrosis extensa en tumores tratados con HFND. Importante, las HFND no causaron pérdida de peso ni toxicidad evidente, contrastando con los efectos secundarios pronunciados observados con HCPT libre (Fig. 12b). Estos hallazgos demuestran que las HFND combinan potente actividad antitumoral con un perfil de seguridad favorable.

Conclusiones

Hemos introducido una ruta completamente ecológica y libre de disolventes para producir nanoagujas de HCPT funcionalizadas con folato que combinan alta carga de fármaco, captación celular dirigida y liberación sostenida. Los datos in vitro e in vivo confirman una actividad anticancerígena superior y toxicidad sistémica reducida comparada con formulaciones convencionales. Esta plataforma ejemplifica cómo la química ambientalmente responsable puede aprovecharse para avanzar en terapéuticos basados en nanopartículas.