Efecto mejorado de la combinación de ácido clorogénico en nanopartículas de selenio para inhibir la agregación β de amiloide y la formación de especies reactivas de oxígeno in vitro

Resumen

El depósito de placas de amiloide-β (Aβ) y la formación de especies reactivas de oxígeno neurotóxicas (ROS) es una firma patológica significativa de la enfermedad de Alzheimer (EA). Aquí, se informa una nueva estrategia para combinar la propiedad única de absorción de Aβ de las nanopartículas de selenio con el agente antioxidante natural ácido clorogénico (CGA) para formar CGA @ SeNPs. La evaluación biológica in vitro reveló que CGA podría eliminar las ROS inducidas por los agregados de Aβ40, pero no inhibió la agregación de Aβ40 ni el daño de la membrana celular que también fueron causados por los agregados de Aβ40. Curiosamente, los CGA @ SeNP muestran un efecto de inhibición mejorado sobre la agregación de Aβ40 y, lo que es más importante, protegen las células PC12 de la muerte celular inducida por la agregación de Aβ. Se cree que los CGA @ SeNP son más eficientes que los CGA para reducir el Aβ40 tóxico en el uso a largo plazo.

Antecedentes

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva irreversible caracterizada por deterioro cognitivo progresivo y pérdida neuronal [1]. Actualmente se acepta ampliamente que la acumulación de placas amiloidales extracelulares en el cerebro es una característica patológica común en la EA [2, 3]. Las placas contienen el plegamiento incorrecto y la agregación de la proteína amiloide-β (Aβ) [4]. Aunque el papel exacto de las protofibrillas u oligómeros Aβ en la patogénesis de la EA no se comprende completamente, la evidencia acumulada sugiere que la mayoría de ellos son especies tóxicas responsables de la disfunción neuronal y la muerte [5,6,7,8]. Además, los agregados de Aβ ya existen en el cerebro de un paciente con EA. Estos agregados continuarán formateando especies reactivas de oxígeno (ROS) de neurotoxinas, que desencadenarán una serie de daños de componentes celulares como ADN, lípidos y proteínas y causarán estrés oxidativo en la EA [9]. El daño a la neurona generalmente resulta en déficits de aprendizaje y memoria. Por lo tanto, se prevé que la inhibición de la agregación β amiloide y la formación de especies reactivas de oxígeno podrían ser dianas terapéuticas prometedoras para prevenir o aliviar la patología de la EA.

Los nanomateriales tienen propiedades fisicoquímicas únicas, como tamaño pequeño, área de superficie grande y alta reactividad. Recientemente, la investigación ha hecho hincapié en que con las modificaciones de superficie adecuadas, las nanopartículas (NP) se pueden utilizar como herramientas para la administración de fármacos, la obtención de imágenes y las aplicaciones terapéuticas en la EA [10, 11, 12]. Generalmente, los NP tienen una gran superficie que aporta grandes capacidades de adsorción. Específicamente, Aβ puede unirse a algunas NP para retardar los procesos de fibrilación de Aβ. Por ejemplo, la unión de un monómero Aβ sobre polioxometalatos reduciría la concentración de monómeros libres y alejaría el equilibrio de la fibrilación [13]. Entre estos nanomateriales, las nanopartículas de selenio (SeNP) presentan varias características que las hacen muy adecuadas para aplicaciones biomédicas, como la preparación y la estabilidad sencillas. El selenio es un oligoelemento esencial, que juega un papel importante en la regulación redox celular, la desintoxicación y la protección del sistema inmunológico [14]. Por lo tanto, en comparación con los compuestos de selenio orgánicos e inorgánicos, los SeNP tienen mejor biocompatibilidad y menor toxicidad [15]. Hoy en día, las modificaciones superficiales de las NP facilitan la afinidad de unión entre las NP y Aβ y ayudan a remediar las propiedades bioquímicas de las moléculas conjugadas. Nuestro estudio anterior encontró que la capacidad anti-amiloide de los SeNPs podría mejorarse aún más mediante el injerto de un péptido anti-amiloide (LPFFD) en una superficie de SeNP [12]. Sin embargo, la mayoría de estas investigaciones no se centraron en la capacidad antioxidante de las NP después de las modificaciones de la superficie.

El ácido clorogénico (CGA) es el principal componente polifenol en frutas como manzanas, peras y bayas y es particularmente abundante en el café [16]. La CGA tiene varias propiedades farmacológicas, como anticancerígenas, antiinflamatorias y antibacterianas [16]. Especialmente, la CGA tiene actividades antioxidantes y neuroprotectoras, lo que permite su aplicación para tratar la enfermedad de Alzheimer [17, 18]. Sin embargo, nunca se ha informado del efecto de CGA sobre la agregación de Aβ. Además, el uso de CGA está limitado por su baja biodisponibilidad y estabilidad, y solo un tercio del CGA absorbido del tracto gastrointestinal llega a la circulación sanguínea [19]. Varios estudios han informado que debido al pequeño tamaño de los NP, pueden ingresar al torrente sanguíneo directamente por inhalación, ingestión y transporte a través de la circulación a muchos órganos. Por lo tanto, para resolver este problema, hemos explorado la unión de CGA a SeNPs (CGA @ SeNPs) para mejorar la eficacia terapéutica potencial de CGA. En este contexto, el objetivo de este estudio fue investigar la potencial eficacia terapéutica de los CGA @ SeNPs en la agregación anti-Aβ y la antioxidación. Hasta donde sabemos, no existe ningún informe previo sobre el uso de CGA @ SeNPs para la terapia de la EA.

Métodos / Experimental

Materiales y líneas celulares

Se sintetizó Aβ40 en GL Biochem Ltd. (Shanghai, China). Dióxido de selenio (Na ₂ SeO ₃ ), NaBH ₄ , bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT), tioflavina T y diacetato de 2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) eran de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). CGA se compró a Aladdin (Shanghai, China). El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el suero fetal bovino (FBS) y el suero de caballo se obtuvieron de Gibco (Life Technologies AG, Suiza). Se cultivaron células PC12 (feocromocitoma de rata, American Type Culture Collection) en medio DMEM suplementado con FBS al 5% y suero de caballo al 10% a 37 ° C en CO ₂ al 5% ambiente humidificado a 37 ° C.

Preparación de CGA @ SeNPs

Primero, soluciones madre de CGA 25 mM, Na ₂ 0,1 M SeO ₃ y 0,1 M NaBH ₄ estaban preparados. Luego, alícuota de 200 μL de Na ₂ SeO ₃ La solución se mezcló con volúmenes variados de CGA y las proporciones de concentración de reactivo de Na ₂ SeO ₃ a CGA fueron 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 y 1:8. Después de eso, 200 μL de 0.1 M NaBH ₄ se añadió a la mezcla y se agitó durante 30 min. El color de la solución se cambió a rojo. Exceso de CGA y Na ₂ SeO ₃ fueron removidos por diálisis. Descubrimos que la mejor relación de concentración de Na ₂ SeO ₃ a CGA fue 1:6.

Caracterización de CGA @ SeNPs

Las CGA @ SeNP preparadas se caracterizaron mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM; Hitachi, H-7650), espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR; espectrómetro IR Equinox 55) y espectroscopia UV-vis (espectrofotómetro Carry 5000). La distribución de tamaño fue determinada por el analizador de partículas Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited). La fluorescencia de las nanopartículas se realizó con un espectrofluorómetro JASCO FP6500 ( λ ex =350 nm).

H ₂ O ₂ Ensayo de generación

El radical hidroxilo, ácido 2, 29-azinobis- (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS ⁺ ), y las actividades de captación de aniones superóxido de CGA y CGA @ SeNPs se analizaron mediante kits comerciales (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). El poder reductor de las muestras se midió de la siguiente manera:se incubaron 2 mL de CGA o CGA @ SeNPs con 2 mL de tampón fosfato (0.2 mol / L, pH 6.6) y 2 mL de K ₃ Fe (CN) ₆ (1%, w / v ) a 50 ° C durante 20 min. Después de eso, la reacción se detuvo agregando 2.5 mL de ácido tricloroacético (10%, w / v ) y se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min. Se mezclaron dos mililitros del sobrenadante con 2 mL de agua destilada y 1 mL de FeCl ₃ (0,1%, w / v ) a temperatura ambiente durante 10 min. Finalmente, se midió la absorbancia a 700 nm. La vitamina c (Vc) se utilizó como control positivo en el ensayo de actividad antioxidante.

El H ₂ O ₂ La generación en Aβ40 se analizó mediante DCFH-DA. Solución madre de DCFH-DA (1 mM) comprada en el Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China). Se prepararon cuatro micromolares de peroxidasa de rábano picante (HRP) en tampón (Tris-HCl 20 mM / NaCl 150 mM, pH 7,4). Las soluciones de muestra que contenían 35 μM de Aβ40 con o sin 20, 40 y 60 μg / mL de CGA @ SeNPs / CGA se incubaron a 37 ° C durante 3 días. Se añadió ascorbato (10 μM) a cada muestra y se incubó adicionalmente durante 1 h. Los análisis de muestras se realizaron agregando DCFH-DA (20 μL, 100 μM) y HRP (2 μL, 0.04 μM) a la solución de muestra (10 μL). Los espectros de fluorescencia con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 y 525 nm se midieron con un espectrofluorómetro JASCO FP6500.

Mediciones de fluorescencia de tioflavina T

La cinética de la fibrilación de Aβ40 se detectó usando el colorante tioflavina T (ThT). Brevemente, se incubó Aβ40 35 μM con 20, 40 y 60 μg / mL de CGA @ SeNPs / CGA a 37 ° C de 0 a 5 días. Cada día, se extrajeron 50 μL de solución y se agregaron a 200 μL de solución de ThT (15 μM de ThT en PBS 50 mM, pH 7,4). Luego, la excitación de ThT fue de 440 nm y se registró la longitud de onda de emisión de 490 nm.

TEM

Se observaron morfologías de Aβ40 en presencia o ausencia de CGA @ SeNPs / CGA mediante TEM (Hitachi, H-7650). Las muestras se prepararon de la misma forma que en el ensayo de fluorescencia de ThT. Después de 3 días de incubación, se colocaron 10 μL de solución de muestra en las rejillas de cobre recubiertas de carbón durante 10 min. Luego, cada cuadrícula se tiñó con 1.5% ( w / v ) ácido fosfotúngstico (pH 7,4) y se deja secar.

La unión de nanopartículas a Aβ40 también fue confirmada por TEM. En primer lugar, se incubó Aβ40 35 µM durante 3 días para formatear las fibras. Luego, se agregaron nanopartículas de 20 μg / mL a la solución preincubada y se incubaron durante otras 6 h. Después de eso, esta muestra se examinó en TEM.

Mediciones de dispersión de luz por resonancia

La dispersión de luz de resonancia (RSL) se midió según el método de Yu et al. [20] con algunas modificaciones. Se diluyó una cierta cantidad de dispersión de Aβ40 a 1 ml con H ₂ O, mientras que la concentración final de CGA @ SeNPs varió de 0.05 a 0.45 μg / mL. La mezcla se incubó durante 10 min. Las intensidades de RLS se registraron en el fluoroespectrofotómetro Cary Eclipse (Agilent Technologies, EE. UU.) Mediante el escaneo sincrónico de los monocromadores de excitación y emisión (Δ λ =0 nm) entre 200 y 800 nm. Tanto el ancho de rendija de excitación como de emisión se establecieron en 5 nm.

Ensayo de citotoxicidad

La viabilidad celular se analizó utilizando un ensayo MTT. Las células PC12 se sembraron en placas a una densidad de 5000 células por pocillo en placas de 96 pocillos en medio fresco sin FBS. Se co-incubó Aβ (35 μM) con o sin 60 μg / mL de CGA @ SeNPs / CGA durante 3 días. Después de eso, las células se trataron con estas muestras durante otras 72 h. Después de la incubación, las células se trataron con 10 μL de MTT por pocillo, siguiendo el manual del ensayo de proliferación celular Cell Titer 96 Aqueous One Solution (Promega). Se ensayó la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) usando el kit de detección comercial. Las células PC12 se trataron como anteriormente. Al final de los tratamientos, la placa de 96 pocillos se centrifugó a 1500 × g durante 10 min. La actividad de LDH en los sobrenadantes se midió de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Generación de ROS intracelulares

Los efectos de CGA @ SeNPs / CGA sobre la generación de ROS intracelulares inducida por Aβ40 se controlaron mediante el ensayo DCFH-DA. Las celdas PC12 (1 × 10 ⁵ por pocillo) se trataron de la misma forma que en el ensayo MTT. Luego, las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con DCFH-DA (10 mM) a 37 ° C durante 30 min. El nivel de ROS intracelular se examinó con un microscopio fluorescente (aumento x 200) con las longitudes de onda de excitación y emisión a 488 nm y 525 nm, respectivamente. Para medir el nivel de ROS intracelular, las células se trataron de la misma manera y se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en PBS. Luego, las células se analizaron mediante citometría de flujo.

Ensayo de tinción conjunta TUNEL-DAPI

Las células PC12 se trataron de la misma forma que en el ensayo MTT. Después de eso, las células en los portaobjetos de la cámara se fijaron con un aldehído de forma al 3,7% y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% en PBS. El ensayo de tinción se llevó a cabo utilizando el kit de ensayo de marcaje de extremos de muesca dUTP de transferasa terminal (TUNEL) (KeyGen BioTECH, Nanjing, China) siguiendo el protocolo del fabricante. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio fluorescente (aumento × 200).

Estadísticas

La significación estadística se estimó mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Bonferroni. La significancia estadística se estableció en P <0.05.

Resultados y discusión

Caracterización de CGA @ SeNPs

En este estudio, usamos un método simple para sintetizar CGA @ SeNPs mediante la reducción de una mezcla de CGA y Na ₂ SeO ₃ con NaBH ₄ . Las nanopartículas con un tamaño comprendido entre 30 y 150 nm fueron más favorables para la captación celular [21]. TEM mostró que los CGA @ SeNPs tienen una estructura esférica con un diámetro de aproximadamente 100 nm (Fig. 1a), lo que sugiere que el tamaño de CGA @ SeNPs era adecuado para la aplicación biológica. El análisis de composición elemental mostró que Se, C y O se pueden encontrar fácilmente en el gráfico de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDX) de CGA @ SeNPs (Fig. 1b). La señal de los átomos de Se fue del 30,00%, junto con la señal del átomo de C fuerte (52,60%) y la señal del átomo de O (1,50%) de CGA, lo que indica que hemos preparado con éxito los CGA @ SeNPs.

Caracterización de CGA @ SeNPs. un Imágenes TEM de CGA @ SeNPs. b Análisis EDX de CGA @ SeNPs. c Espectro de absorción UV-vis de CGA @ SeNPs. d El espectro de emisión de CGA @ SeNPs

El espectro de absorción UV-vis de CGA muestra un pico de absorción característico a 334 nm (Fig. 1c). Sin embargo, se observó un ligero cambio en el espectro de absorción UV-vis de CGA @ SeNPs y el pico de absorción se cambió a 337 nm. Las longitudes de onda de emisión de CGA y CGA @ SeNP se detectaron mediante espectrofotómetro de fluorescencia. La longitud de onda de emisión de CGA fue 442,9 nm, que se desplazó a 437,5 nm en CGA @ SeNPs (Fig. 1d). Estos resultados confirmaron la presencia de CGA en la superficie de SeNPs. El espectro FT-IR de CGA @ SeNPs da evidencia de que CGA ha formado parte del nanocompuesto. La frecuencia de estiramiento O – H se encuentra en 3353,99 cm ⁻¹ en el espectro FT-IR de CGA (archivo adicional 1:Figura S1); sin embargo, este pico característico en CGA @ SeNPs se cambió a 3419,00 cm ⁻¹ . El cambio confirmó que CGA se conjugó con la superficie de SeNP a través del grupo -OH.

La estabilidad de CGA @ SeNP en condiciones fisiológicas es importante para evaluar sus aplicaciones futuras. Por tanto, se controló la distribución de tamaño de CGA @ SeNPs en PBS (pH 7,4) a temperatura ambiente durante 7 días. Como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S2, el tamaño de CGA @ SeNPs se mantuvo estable con un tamaño promedio de alrededor de 100 nm, y CGA @ SeNPs retuvo una buena dispersabilidad del agua en PBS dentro de los 7 días. La estabilidad favorable de CGA @ SeNPs respalda su aplicación potencial en el área médica.

Inhibición de la generación ROS

El Aβ depositado puede activar la microglía y estimular la microglía para que produzca neurotoxinas, como las ROS, que pueden causar además un daño neuronal severo en el cerebro [22]. Además, ROS como el peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ) también pueden ser generados por agregados de Aβ [23]. Por lo tanto, investigamos las actividades antioxidantes de CGA @ SeNPs y el efecto de CGA @ SeNPs sobre el H ₂ inducido por el agregado Aβ. O ₂ formación. Como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S3, los CGA @ SeNP tienen una fuerte actividad de barrido contra los radicales de una manera dependiente de la concentración. Cuando la concentración alcanzó 60 μg / mL, el radical hidroxilo, ABTS ⁺ y las actividades de captación de aniones superóxido alcanzaron el 70,3%, 95,2% y 95,1%, respectivamente. Obviamente, el poder reductor de CGA @ SeNPs aumentó con concentraciones crecientes. Entre todas las muestras, los CGA @ SeNP exhibieron un fuerte poder reductor y capacidades de eliminación del radical hidroxilo, ABTS ⁺ y anión superóxido que Vc y CGA. Estos resultados sugirieron que los CGA @ SeNP mostraron una mayor actividad antioxidante, lo que puede ayudar a eliminar el oxígeno activo en la EA. El punto a señalar es que la modificación de CGA en SeNPs ejerce un efecto sinérgico sobre la actividad antioxidante.

El efecto de CGA @ SeNPs en el H ₂ mediado por Aβ O ₂ La generación se investigó mediante un ensayo DCFH-DA [24], que puede indicar la generación de H ₂ O ₂ del Aβ en presencia o ausencia de CGA @ SeNPs. Como se muestra en la Fig.2, CGA @ SeNPs y CGA disminuyeron H ₂ O ₂ de una manera dependiente de la dosis. Más importante aún, las muestras de Aβ que contienen CGA @ SeNPs muestran menos H ₂ O ₂ que los que contienen CGA, revelando que la alta actividad antioxidante de CGA @ SeNPs mostró más efecto que CGA en la reducción del H ₂ inducido por Aβ O ₂ generación.

H ₂ O ₂ generación a partir de reacciones de Aβ40 en presencia o ausencia de nanopartículas. Aβ =35 μM, nanopartículas / CGA =20, 40 y 60 μg / mL

Inhibición de la agregación de Aβ por parte de CGA @ SeNPs

Aunque la actividad antioxidante de CGA es una propiedad bien conocida, aún se desconoce la actividad de agregación anti-amiloide de CGA. Para verificar la viabilidad de los CGA @ SeNP para aplicaciones terapéuticas de la EA, el efecto de inhibición de CGA @ SeNP sobre la agregación de Aβ se investigó primero mediante un ensayo fluorométrico basado en ThT, que es un método bien establecido para monitorear la formación de hojas β en condiciones continuas. tiempo [25]. Como se muestra en la Fig. 3a, Aβ40 se agregó espontáneamente y la fluorescencia de las fibrillas de Aβ aumentó gradualmente hasta que alcanzó una meseta a los 3 días de incubación. Hemos observado que CGA @ SeNPs fueron capaces de agregar proteínas amiloides lentamente con el aumento de la concentración. Se logró una intensidad de fluorescencia de las fibras de Aβ40 aproximadamente dos veces más que la de Aβ40 incubadas con 60 µg / ml de CGA @ SeNPs. Sin embargo, se observó poco o ningún cambio en la intensidad de fluorescencia de ThT en CGA, lo que sugiere que CGA solo inhibió ligeramente la agregación de Aβ40.

Efecto inhibidor de CGA @ SeNPs sobre la fibrilación de Aβ40. un Fluorescencia ThT de la formación de fibrillas de Aβ40 en presencia o ausencia de nanopartículas / CGA de 0 a 5 días. Aβ40 =35 μM, nanopartículas / CGA =20, 40 y 60 μg / mL. b Morfología de Aβ40 incubado con o sin nanopartículas o CGA durante 3 días. Aβ40 =35 μM, nanopartículas / CGA =60 μg / mL

Los cambios morfológicos de Aβ40 incubado con o sin CGA o CGA @ SeNPs se muestran en la Fig. 3b. El Aβ40 incubado en 3 días formó abundantes fibrillas, mientras que en presencia de CGA @ SeNPs (60 μg / mL), no se formaron fibrillas. Como se esperaba, CGA no inhibió significativamente la fibrilogénesis de Aβ, mientras que se observaron grandes cantidades de agregados en la solución de Aβ40 tratado con CGA, lo que fue consistente con el ensayo fluorométrico de ThT. Estos resultados indicaron que después de la modificación de CGA en SeNP, obviamente podría disminuir la formación de hojas β.

Actividad de enlace de CGA @ SeNPs a Aβ40

Para obtener una mejor comprensión de la actividad inhibidora de CGA @ SeNPs sobre la agregación de Aβ, investigamos la afinidad de unión de CGA @ SeNPs por Aβ40. En primer lugar, para evaluar la unión de nanopartículas en fibras Aβ40 a nivel ultraestructural, se incubaron fibras Aβ40 con CGA @ SeNPs. Observamos que las fibrillas se unían específicamente a la superficie de los SeNP sin la presencia de nanopartículas suspendidas libres no asociadas (Fig. 4a).

Afinidad de CGA @ SeNPs por Aβ40. un La capacidad de unión de CGA @ SeNPs en fibras Aβ40. Las fibras realizadas de Aβ40 se incubaron con CGA @ SeNPs y se examinaron en TEM. Aβ40 =35 μM, CGA @ SeNPs =60 μg / mL. b Afinidad y especificación de CGA @ SeNPs para el monómero Aβ40. Los espectros de RLS del monómero Aβ40 en presencia de diferentes concentraciones de CGA @ SeNPs. Aβ40 =600 nM, concentración de nanopartículas, 1–9:0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35 y 0.4 μg / mL. c Los espectros de RLS de CGA @ SeNPs, concentración de nanopartículas, 1–9:0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4 y 0.45 μg / mL

La dispersión de luz por resonancia (RLS) es una poderosa técnica óptica basada en la dispersión de luz elástica y se ha aplicado ampliamente para estudiar el tamaño, la forma y la distribución de nanopartículas en solución [26]. Por lo tanto, a continuación usamos RLS para analizar la interacción entre el monómero Aβ40 y CGA @ SeNPs. Como se muestra en la Fig. 4b, c, la intensidad de RLS de las NP es mucho menor que la de las NP incubadas con monómero de Aβ40 600 nM a la misma concentración. Una vez que los CGA @ SeNP se expusieron a las moléculas de Aβ, se cree que el Aβ se une a la superficie de los SeNP a través de donantes de N que contienen cadenas laterales de aminoácidos para formar un enlace Se-N [27]. La formación de conjugados de moléculas Aβ en CGA @ SeNPs da como resultado un aumento del tamaño de las dispersiones, lo que mejora la intensidad del RLS del sistema (Fig. 4b). Combinado con el resultado del ensayo ThT y TEM, se especula que las interacciones entre la gran superficie CGA @ SeNP y el monómero Aβ40 podrían resultar en condiciones desfavorables para la nucleación y el crecimiento de fibrillas a través del bloqueo del contacto directo entre los monómeros. Por lo tanto, los CGA @ SeNP ejercen más efecto que los CGA en la inhibición de la agregación de Aβ40.

Inhibición de la neurotoxicidad Aβ40

La citotoxicidad de Aβ40 en presencia o ausencia de CGA @ SeNPs en células PC12 se investigó mediante ensayo MTT. La Figura 5a muestra que las fibras Aβ40 eran tóxicas para las células PC12, lo que redujo la viabilidad celular al 53%. En presencia de CGA @ SeNP, la supervivencia de las células aumentó hasta aproximadamente el 95%. Sin embargo, el pretratamiento de las células con CGA solo aumentó ligeramente la supervivencia de las células al 66%. Además, los CGA @ SeNPs no eran tóxicos para las células PC12 (Archivo adicional 1:Figura S4), lo que sugiere que CGA @ SeNPs podría inhibir la neurotoxicidad de Aβ40.

La neurotoxicidad de Aβ40 incubado con o sin CGA @ SeNPs / CGA. un La viabilidad celular de las células PC12 hacia Aβ40 en presencia de CGA @ SeNPs o CGA probada mediante ensayo MTT. b La liberación de LDH en el medio de cultivo. Aβ40 =35 μM, CGA @ SeNPs / CGA =60 μg / mL

Se ha informado de que el Aβ se inmoviliza preferentemente en la superficie celular y causa el daño de la membrana celular [28]. Por lo tanto, para determinar la integridad de la membrana celular después de la exposición a Aβ40 en presencia o ausencia de NP / CGA, medimos los niveles extracelulares de LDH en medio de cultivo celular. En este ensayo, el alto nivel de LDH refleja el daño de la membrana celular. Como se muestra en la Fig. 5b, en comparación con el control, después de la exposición a Aβ40, la liberación de LDH aumentó al 142%. De acuerdo con el resultado de MTT, en presencia de CGA @ SeNP, la liberación de LDH se redujo a un nivel normal. Curiosamente, observamos que CGA no redujo la concentración de LDH, lo que sugiere que CGA no puede evitar que las células PC12 sufran daños en la membrana celular inducidos por agregados de Aβ.

Prevención de la generación de ROS inducida por Aβ40 en células PC12

Los agregados Aβ son capaces de producir ROS que podrían causar estrés oxidativo en la EA [29]. Debido a las propiedades anti-oxidación y anti-agregación de CGA @ SeNPs, planteamos la hipótesis de que podría reducir la generación de ROS inducida por Aβ40 en la célula PC12. Por tanto, el efecto de las NP sobre la generación de ROS inducida por el agregado de Aβ40 se midió mediante DCFH-DA. DCF es un marcador fluorescente derivado de la reacción de DCFH-DA no fluorescente con ROS, que puede indicar la generación de ROS inducida por agregados de Aβ40. Como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S5, el tratamiento con agregados de Aβ40 provocó un aumento de más de 1,5 veces en el contenido de ROS en relación con las células no tratadas. El tratamiento con CGA @ SeNP disminuyó la intensidad de fluorescencia de DCF en las células PC12, lo que indica que las CGA @ SeNP disminuyeron las ROS inducidas por fibrillas Aβ a un nivel normal. Curiosamente, CGA también redujo la generación de ROS en las células PC12, pero no tan obviamente como CGA @ SeNPs.

Prevención de la apoptosis celular inducida por Aβ40 en células PC12

Se ha informado que la muerte de las células neuronales causada por la fibrilla Aβ es un evento crítico en la patología de la EA [30]. Para estudiar más a fondo la citotoxicidad de las fibrillas de Aβ40, realizamos una tinción conjunta de TUNEL-DAPI para determinar el efecto de las NP o CGA en la apoptosis celular inducida por Aβ40. La fragmentación del ADN es un sello distintivo de la apoptosis celular, que podría detectarse en las primeras etapas de la apoptosis utilizando TUNEL [31]. Como se muestra en la Fig. 6, los núcleos apoptóticos se tiñeron con verde fluorescente brillante por TUNEL. Aβ40 aumentó drásticamente el número de núcleos teñidos con TUNEL, mientras que el tratamiento con CGA @ SeNP provocó una disminución de los núcleos TUNEL-positivos, lo que demuestra que CGA @ SeNPs podría proteger a las neuronas de la apoptosis de células PC12 inducida por Aβ40. De lo contrario, los niveles altos de ROS en las células también participan en la apoptosis [32]. Por tanto, estos resultados connotaban que la apoptosis provocada por Aβ40 podría atribuirse a la generación de ROS. Vale la pena señalar que CGA también puede reducir la apoptosis celular inducida por Aβ40. A partir del ensayo de MTT y LDH, CGA no mejoró la supervivencia de la célula y disminuyó el daño de la membrana celular inducido por el agregado Aβ. Resultados combinados del ensayo TEM y ThT, encontramos que el CGA tiene una propiedad antioxidante que puede eliminar el oxígeno activo en el proceso de agregación de Aβ, pero no puede inhibir por completo la agregación de Aβ. Por lo tanto, CGA podría disminuir la generación de ROS en la solución de incubación y las células PC12, protegiendo la apoptosis celular inducida por ROS, pero no puede disminuir el daño de la membrana celular inducido por el agregado Aβ. El daño de la membrana celular dará como resultado la fuga de contenido intracelular al tejido circundante, lo que podría provocar daño e inflamación tisular [33]. Por lo tanto, la combinación de la agregación inhibida de Aβ y la formación de especies reactivas de oxígeno podría considerarse como un nuevo método terapéutico.

Los CGA @ SeNP previenen la apoptosis celular inducida por Aβ40 en células PC12. La apoptosis celular se detectó mediante el ensayo de co-tinción TUNEL-DAPI. El núcleo de la célula normal se tiñó de azul y el fragmento de ADN se tiñó de verde. Aβ40 =35 μM, CGA @ SeNPs / CGA =60 μg / mL

Conclusiones

En resumen, CGA tiene una propiedad farmacológica antioxidante, pero no tiene ningún efecto en la inhibición de la fibrilación de Aβ. La modificación de la superficie de CGA en SeNPs le da una nueva propiedad anti-agregación. Aβ40 podría unirse a la superficie de CGA @ SeNPs, lo que da como resultado condiciones desfavorables para la nucleación y el crecimiento de fibrillas a través del bloqueo del contacto directo entre monómeros. En ese caso, CGA @ SeNPs inhibió la agregación de Aβ40, eliminaron las ROS y protegieron las células PC12 de la rotura de la membrana celular y la apoptosis mediada por ROS inducida por agregados de Aβ40. Sin embargo, en el grupo CGA, los agregados de Aβ se inmovilizaron en la superficie celular y causaron el daño de la membrana celular, lo que también resultó en la muerte celular. En general, los CGA @ SeNP son más eficientes que los CGA para reducir el Aβ40 tóxico en el uso a largo plazo.