Cinética y especificidad de la captación de vesículas extracelulares HEK293T mediante citometría de flujo por imágenes

Resumen

Las vesículas extracelulares (VE) son vesículas unidas a bicapas lipídicas de tamaño nanométrico que se secretan naturalmente por la mayoría de los tipos de células como mecanismo de comunicación para suministrar proteínas, lípidos y material genético. A pesar del potencial terapéutico de los EV, existe información limitada sobre la cinética y la especificidad de la absorción de EV. Aquí, optimizamos una plataforma basada en citometría de flujo de imágenes (IFC) para evaluar cuantitativamente la dosis, el tiempo y los efectos de especificidad de la célula receptora en la internalización de EV de células de riñón embrionario humano (HEK293T) de una manera de alto rendimiento. Descubrimos que la absorción de HEK293T EV es un proceso activo que depende de la dosis y el tiempo. Además, la selectividad de la absorción de EV se cuantificó in vitro , y encontramos que los EV HEK293T fueron internalizados en cantidades mayores por células del mismo origen. Por último, las células madre neurales internalizaron significativamente más EV HEK293T en relación con las neuronas maduras, lo que sugiere que las células madre o progenitoras, que son más metabólicamente activas que las células diferenciadas terminalmente, pueden tener tasas más altas de internalización EV activa. La caracterización de la absorción de EV, en particular la especificidad, la dependencia de la dosis y el tiempo, y los ensayos cinéticos ayudarán a informar y desarrollar terapias específicas y eficientes basadas en EV.

Introducción

La investigación de vesículas extracelulares es un campo en auge debido a la utilidad terapéutica y diagnóstica de las vesículas extracelulares (VE) naturales y diseñadas. Los EV varían de 50 a 1000 nm de diámetro, se producen a partir de todos los tipos de células y están enriquecidos con proteínas transmembrana, incluidas CD63, CD81 y CD9; lípidos proteinas; y ADN, ARN, ARNm y microARN [1, 2, 3, 4, 5]. El contenido de EV, en particular ARNm y miARN activos, se ha implicado en la modulación de las células receptoras mediante la traducción de novo y la regulación postraduccional de las células diana [4, 6]. Comprender y luego modificar la absorción e internalización cinética de EV eventualmente conducirá a una entrega optimizada del contenido de EV a las células diana con concentraciones lo suficientemente altas como para tener un beneficio terapéutico.

Una vez que se pensó que eran "la basura de las células", los vehículos eléctricos se han aprovechado como una alternativa a las terapias celulares debido a muchas ventajas que incluyen su biocompatibilidad, baja inmunogenicidad y toxicidad, capacidad para dosis repetidas, varias vías de administración y potencial para administrar medicamentos. y terapias genéticas [3]. Nuestro grupo ha informado anteriormente sobre los efectos positivos de los vehículos eléctricos derivados de células madre neurales en accidentes cerebrovasculares y lesiones cerebrales traumáticas. Tanto en los modelos de accidente cerebrovascular murino como en el porcino, los vehículos eléctricos mejoraron la recuperación tisular y funcional después del accidente cerebrovascular [3, 7, 8]. También hemos demostrado que los vehículos eléctricos son neuroprotectores con beneficios funcionales en un modelo de lesión cerebral traumática en roedores [9]. A pesar de estos efectos observados y el potencial futuro de los EV, hay poca comprensión de la cinética y la especificidad de la absorción de EV, lo que puede dificultar la traducción de la terapéutica de EV en la clínica.

Los vehículos eléctricos también se han diseñado como vectores de transferencia y se han cargado con agentes terapéuticos que incluyen terapias génicas y compuestos químicos como una alternativa a las terapias de nanopartículas y los vectores de administración [4, 10, 11, 12]. Las células HEK293T se han utilizado ampliamente como células productoras de EV debido a su rápida proliferación inherente, alto rendimiento de EV y facilidad de manipulación genética [13,14,15,16,17]. Los EV HEK293T administraron terapias génicas que incluyen terapias de miARN para el cáncer de mama [12] y se han utilizado para administrar quimioterapias y construcciones de proteínas terapéuticas en un modelo de schwannoma [18]. De manera similar a los estudios de nanopartículas sintéticas que evalúan la citotoxicidad in vitro, los ensayos de toxicidad MTT mostraron una baja toxicidad de los EV HEK293T descargados y una alta citotoxicidad posterior cuando se cargaron con quimioterápicos [10, 18, 19, 20, 21]. Debido a esta abundante utilización de HEK293T EV, analizamos su cinética y especificidad en este estudio.

La captación selectiva o específica se refiere a la capacidad natural de un vehículo eléctrico para apuntar a tipos de células específicos. Existe abundante evidencia sobre los mecanismos de internalización de EV con poco consenso sobre la especificidad de captación [22]. A menudo, los EV exhiben una captación selectiva por células receptoras similares a las de sus células madre, las células epiteliales internalizan más EV derivados del epitelio que otras células receptoras [23, 24], y las células madre mesenquimales (MSC) internalizan una cantidad significativamente mayor de EV derivados del MSC en comparación con otras líneas celulares in vitro [24]. Sin embargo, otros estudios encontraron que los VE son internalizados por todos los tipos de células y muestran una biodistribución no selectiva cuando se administran in vivo [22, 25]. A pesar del inmenso potencial terapéutico y el interés de los VE, existe una deficiencia en la comprensión de la especificidad de la captación de VE. Al comprender mejor la especificidad de la absorción de EV, podemos elegir adecuadamente las células productoras de EV que son internalizadas selectivamente por las células receptoras de interés y, por lo tanto, mejoran la aplicabilidad terapéutica de los EV.

Una posible razón para los resultados contradictorios de la absorción de vehículos eléctricos es la falta de estandarización en las plataformas de medición, incluidos los análisis de los efectos de la dosis y el tiempo. Recientemente, un grupo de expertos de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) publicó un documento de posición que enfatizaba la necesidad de analizar la dosis y el tiempo, entre otros factores de confusión sobre la captación de EV [26]. El grupo afirmó que "una dosis no sirve para todos" y que esa dosis puede afectar la captación o selectividad de EV [26]. La elevación de las dosis de HEK293T EVs modifica el patrón de biodistribución in vivo [27]. Los perfiles de captación de los vehículos eléctricos derivados del suero se alteraron significativamente con la dosis [28]. Además, los tiempos de co-incubación de los EV con las células receptoras que oscilan entre 15 min y 48 h [24, 29, 30, 31, 32, 33] pueden alterar las mediciones de captación. Si los investigadores de vehículos eléctricos y la industria lo adoptan, un proceso cuantificable y confiable para determinar la dosis estándar y las curvas de tiempo para ayudar a identificar la dosis mínima efectiva puede conducir a estudios más sólidos y útiles.

Anteriormente, los investigadores habían utilizado la citometría de flujo estándar junto con varias formas de microscopía de bajo rendimiento, incluida la microscopía confocal para analizar la captación de EV [32,33,34]. Sin embargo, estas tecnologías tienen varias limitaciones. La microscopía confocal puede llevar mucho tiempo y ser subjetiva. Los citómetros de flujo tradicionales se han diseñado para medir partículas biológicas en el rango celular, no pueden diferenciar el enjambre o la coincidencia de EV y tienen un aumento de ruido debido a la activación [35,36,37,38]. Como mencionó el grupo ISEV, existe una creciente conciencia de las limitaciones físicas de la citometría de flujo tradicional y destaca la demanda de citometría de flujo especializada con límites de detección en el rango de 100 nm [26, 38]. La citometría de flujo de imágenes (IFC) combina la naturaleza cuantitativa de alto rendimiento de la citometría de flujo junto con la tecnología de imágenes de fluorescencia que puede resolver partículas fluorescentes inherentemente pequeñas, de hasta 100 nm de diámetro [38]. Las capacidades de IFC conducen a un bajo nivel de ruido / fondo, disminución del enjambre y dispositivos acoplados cargados para la claridad de la imagen [37, 39]. Estas características ayudan a desarrollar una estrategia de activación para caracterizar los vehículos eléctricos y la captación con confirmación visual de una manera de alto rendimiento como una plataforma de captación de vehículos eléctricos precisa y cuantificable [36, 37, 40].

En este estudio, las células HEK293T que expresan CD63-eGFP se utilizaron como línea celular donante para la producción de EV debido a su uso común en el desarrollo terapéutico. Los EV fluorescentes aislados se cultivaron conjuntamente con las líneas celulares receptoras, incluidas las células neurales y endoteliales. La captación se cuantificó utilizando IFC, lo que resultó en una plataforma estandarizada para medir las importantes características cinéticas de captación e internalización de EV para sistemas celulares in vitro. Además, proporcionamos datos sobre un proceso para cuantificar la captación de EV fluorescente en diferentes condiciones y líneas de células cultivadas para dilucidar la captación selectiva de EV.

Materiales y métodos

Cultivo celular

Se adquirieron células de riñón embrionario humano (HEK293T) de ATCC y se cultivaron en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%, 100 U / ml de penicilina y 100 µg / ml de estreptomicina. Se cultivaron células madre neurales humanas (hNSC), células neurales SH-SY5Y, células epiteliales hepáticas C3A, células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y neuronas en condiciones estándar a 37 ° C, 5% CO ₂ antes de los ensayos de captación de vesículas extracelulares.

Etiquetado y aislamiento de vehículos eléctricos

El ADN del plásmido CD63-eGFP se obtuvo de Addgene (nº 62964). CD63-pEGFP C2 fue un regalo de Paul Luzio (plásmido Addgene nº 62964). Se cultivaron células HEK293T hasta una confluencia del 70% en placas de 10 cm y se transfectaron 10 µg de ADN plasmídico usando Lipofectamine 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, los medios se cambiaron a medios HEK293T estándar desprovistos de suero bovino fetal y se recogieron durante 3 días consecutivos. Como se describió anteriormente [3], los medios HEK293T se filtraron a través de un filtro de 0,22 μm y se enriquecieron mediante ultrafiltración utilizando unidades de filtro centrífugo Amicon de celulosa regenerada de 100 kDa y se lavaron dos veces con PBS ++. Los vehículos eléctricos se concentraron a 1 ml y las distribuciones de concentración y tamaño se midieron en Nanosight NS300 mediante el protocolo del fabricante (Malvern, Reino Unido). Los vehículos eléctricos se aislaron de diferentes recipientes de cultivo HEK293T, cada recipiente se consideró réplicas biológicas independientes, con tres réplicas técnicas dentro de cada réplica biológica (mínimo de nueve muestras en total para cada condición).

Ensayos de captación

Las líneas celulares receptoras se sembraron al 60% de confluencia en una placa de 6 pocillos durante 24 h en condiciones de cultivo estándar a 37 ° C. Los medios estándar se cambiaron a medios sin suero bovino fetal (FBS-) antes del cocultivo de vesículas extracelulares. Se administraron EV marcados con proteína verde fluorescente (GFP) a las células en diferentes dosis y puntos de tiempo. Después del cocultivo, las células se resuspendieron en tripsina al 5% y se concentraron a alrededor de un millón de células por 50 μl para la citometría de flujo. Treinta y siete grados Celsius es el estándar para los experimentos de captación de EV en nuestros ensayos, ya que ha sido el estándar utilizado tanto para el cultivo celular como para las plataformas de captación de EV in vitro [31, 41,42,43,44].

Ensayos inhibidores

Ensayo en frío

Los vehículos eléctricos se cultivaron conjuntamente con células receptoras a 4 ° C para "pausar" eficazmente el crecimiento del cultivo celular e inhibir los procesos activos [45]. Cuatro grados Celsius inhibe todas las formas activas de captación de EV [31, 41,42,43,44].

Ensayo fijo

Las células receptoras se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 30 min en hielo y se lavaron con PBS inmediatamente antes del cocultivo con EV para inhibir todas las formas activas de captación de EV.

Adquisición de ImageStreamX

La adquisición se realizó en el citómetro de flujo de imágenes ImageStreamX Mark II (Luminex Corporation, Seattle, Washington) utilizando el software INSPIRE. Se adquirieron un mínimo de 5000-10 000 eventos celulares. Cada muestra biológica se replicó en tres pocillos de réplica técnica y se adquirió individualmente en el ISx. Las imágenes de campo brillante se recogieron en el canal uno y la dispersión lateral (785 nm) en el canal seis. La proteína verde fluorescente (GFP) se excitó mediante láser de argón de 488 nm a 200 mW y se recogió la fluorescencia en el canal dos (480-560 nm). Se utilizó un aumento de 60 × en cada muestra junto con una tasa de adquisición baja para una alta sensibilidad.

Análisis de IDEAS

Los análisis de datos e imágenes se realizaron utilizando el software IDEAS (Luminex). La estrategia de activación es la siguiente:

1.
La puerta de enfoque se determinó para eliminar las celdas que no estaban en el campo de enfoque utilizando el valor RMS de gradiente.
2.
Las celdas enfocadas fueron cerradas para eliminar dobletes y escombros usando el campo brillante del área frente al campo brillante de la relación de aspecto. Los datos cerrados se utilizaron para crear histogramas y generar referencias estadísticas que miden la intensidad de la fluorescencia (suma de todos los píxeles en una imagen), la intensidad máxima de píxeles (intensidad de los píxeles más brillantes en una imagen), junto con los valores de recuento de puntos a través de algoritmos internos para cada muestra. Las funciones de recuento de puntos se generaron utilizando los asistentes de IDEAS correspondientes. El recuento de puntos, la intensidad media y la proporción máxima de píxeles se calculan mediante la fórmula (Valor de salida con EV / Valor de salida sin EV).

Estadísticas

Todos los datos cuantitativos se analizaron mediante GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, California) y se realizaron por triplicado. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). La significancia estadística se determinó utilizando una T no aparejada prueba o un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con comparación múltiple post hoc de Tukey o Dunnett en comparación con controles cuando sea apropiado. p <0,05 se consideró significativo.

Resultados

Propiedades de la vesícula extracelular HEK293T etiquetada con CD63-eGFP

Para generar EV marcados con fluorescencia para analizar la cinética y la captación de vesículas extracelulares, se transfectaron células HEK293T con un plásmido que lleva la proteína de fusión CD63-eGFP. CD63 es una proteína tetraspanina comúnmente enriquecida en la membrana de los exosomas, lo que la convierte en un objetivo óptimo para el etiquetado fluorescente de EV [46, 47]. Los medios gastados se recogieron del cultivo de células HEK293T y los vehículos eléctricos se aislaron como se informó anteriormente [8]. Comparamos el tamaño y la distribución de los vehículos eléctricos aislados de células HEK293T transfectadas con CD63-eGFP con células HEK293T no transfectadas. Los EV HEK293T transfectados con CD63-eGFP y de control mostraron un diámetro medio promedio de 110,28 nm y 103,616 nm, respectivamente, según lo medido por el software de nanotracking (Fig. 1a), que es consistente con el tamaño informado de los EV HEK293T [13, 15, 27 , 48]. Sin diferencias significativas en el diámetro mediano ( p =0.1615) y distribución ( p =0,4225) de EV aislados de células HEK293T no transfectadas y transfectadas con CD63-eGFP. El etiquetado eGFP no alteró el tamaño de los EV HEK293T (Fig. 1b).

Caracterización de vehículos eléctricos HEK293T etiquetados con CD63-eGFP. Los EV se aislaron de HEK293T (control) y HEK293T que expresaban medios de cultivo de células CD63-eGFP. un Distribución representativa del tamaño de los vehículos eléctricos registrada mediante software de nanotracking. b Cuantificación de la distribución del diámetro medio de los EV HEK293T transfectados frente a los no transfectados. c Imágenes IFC de microesferas de control negativo, vehículos eléctricos de control HEK293T y vehículos eléctricos etiquetados con CD63-eGFP. BF significa campo brillante, GFP significa proteína verde fluorescente (láser de excitación de 488 nm) y SSC significa dispersión lateral. EGFP positivo en el canal GFP significa vehículos eléctricos HEK293T fluorescentes. d Expresión del marcador de superficie MACSPlex basada en citometría de flujo de EV HEK293T no transfectados y EV HEK293T CD63-eGFP. Ambas fuentes de EV son positivas para CD29, CD9, CD63 y CD81, según se mide en fluorescencia relativa (indicada por X para positivo). Las barras representan la media ± SEM; N =3; prueba T para datos no apareados. n.s. significa p > 0,05

Se realizó un ensayo de IFC para determinar si el CD63-eGFP estaba asociado con los vehículos eléctricos. Como control negativo fluorescente, las perlas de 1,34 μM en solución tampón (Fig.1c, arriba) carecían de fluorescencia cuando se exponían a la longitud de onda de excitación de 488 nm, pero eran visibles en campo brillante (BF) y dispersión lateral (SSC). Los EV HEK293T sin etiquetar fueron negativos en BF, GFP y SSC, lo que sugiere un tamaño pequeño por debajo del umbral BF y falta de fluorescencia (Fig. 1d, centro). La ausencia en BF significa un tamaño de EV menor de 300 nm, lo que sugiere un enjambre mínimo de EV. Por último, los EV marcados con CD63-eGFP son negativos en BF y positivos en el canal GFP, lo que significa fluorescencia positiva de los EV HEK293T (Fig. 1c, abajo). La señal positiva en el canal GFP puede ser indicativa de un solo EV o un grupo de EV fluorescentes. En conjunto, estos resultados muestran que los EV HEK293T aislados tienen un tamaño estándar y perfiles de marcadores de proteínas consistentes con informes anteriores de exosomas HEK293T, y el etiquetado eGFP no altera el tamaño de los EV HEK293T [5, 27].

Utilizando un método basado en citometría de flujo disponible comercialmente para medir marcadores EV comunes, determinamos el perfil general de tetraspanina EV [5]. Los EV HEK293T aislados de las células HEK293T que expresan CD63-eGFP y de control fueron positivos para los marcadores EV estándar, incluidos CD9, CD63 y CD81, medidos en unidades de fluorescencia relativa (Fig. 1d). Como se informó anteriormente, el CD29 también se encontró en la superficie de los EV HEK293T y los EV HEK293T transfectados con CD63-eGFP [5]. Estos resultados indican que los métodos de aislamiento y etiquetado para HEK293T EV dan como resultado vehículos eléctricos con marcadores de exosoma HEK293T comunes.

Captación activa de vehículos eléctricos HEK293T

Se realizaron dos ensayos de internalización inhibitoria. Los EV HEK293T se cocultivaron con células receptoras a 4 ° C (frío) o con células receptoras previamente fijadas con paraformaldehído (fijadas). Los tratamientos disminuyeron la presencia de EV marcados con eGFP en las células receptoras en comparación con las células receptoras cocultivadas con EV en condiciones fisiológicas (Fig. 2a). Los ensayos inhibidores fijos y en frío redujeron el recuento de manchas (frío: p =0.0127, fijo: p =0,0078), intensidad (frío: p =0.0105, fijo: p =0.0374) y píxel máximo (frío: p =0.0159, fijo: p =0,0149) de señales de fluorescencia en células receptoras sin tratamientos, lo que indica inhibición de la captación de EV. Estos resultados infieren que la localización de eGFP y los aumentos en los parámetros de salida significan que los EV HEK293T se internalizan para los siguientes ensayos de absorción.

Ensayos de inhibición de internalización de EV. Se cocultivaron células HEK293T con EV HEK293T en diversas condiciones. El control (37 ° C) se refiere al cocultivo en un ambiente fisiológico de 37 ° C. El frío se refiere al cocultivo en un ambiente de 4 ° C. La inhibición fija se refiere a un ensayo en el que las células receptoras se fijaron con PFA antes del cocultivo. un Imágenes IFC representativas de células receptoras. La columna 1, BF, significa campo brillante. La columna 2, GFP, significa proteína verde fluorescente (láser de excitación de 488 nm) y la columna 3 significa una combinación de BF y GFP. El control muestra GFP positivo que representa la internalización de EV. b - d Cuantificación de los ensayos de inhibición en comparación con los controles mediante el recuento de puntos, la intensidad de fluorescencia media y el píxel máximo. Las barras representan la media ± SEM; N =3; ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey en comparación con el control. * p <0,05; *** p <0.01

Absorción de HEK293T EV dependiente de la dosis

Para desarrollar una curva de dosis estándar para la plataforma IFC, los EV HEK293T se cultivaron conjuntamente con células receptoras HEK293T a dosis crecientes que van de 0 a 20 000 EV por celda a 37 ° C. Las imágenes de IFC representativas mostraron un aumento visual de la fluorescencia de eGFP con dosis elevadas de EV (Fig. 3a). El número más bajo de EV que se pudo detectar fue de 6000 EV por célula HEK293T cocultivada. En este nivel, recuento de puntos ( p =0,0012), intensidad ( p =0,0075) y píxel máximo ( p =0,0005) las mediciones fueron significativamente mayores que las de las células receptoras sin EV (Fig. 3b-d). Por lo tanto, dosis de 6000 HEK293T EV es el umbral bajo para la absorción en nuestra condición experimental. De manera similar, las dosis de 10,000 y 20,000 EV tuvieron un recuento de manchas más alto (10,000: p =0,0009; 20 000: p <0,0001), intensidad (10,000: p <0,0001; 20 000: p <0,0001) y píxel máximo (10,000: p <0,0001; 20 000: p <0,0001) en comparación con células sin vehículos eléctricos. Al comparar las dosis más altas, no hay diferencias significativas en el recuento de manchas (6000 frente a 10,000: p =0,999, 10.000 frente a 20.000: p =0,0927), intensidad (6000 frente a 10.000: p =0,8482, 10.000 frente a 20.000: p =0,999) y la cantidad máxima de píxeles (6000 frente a 10,000: p =0,6056, 10.000 frente a 20.000: p =0.5281) entre 6000 y 10,000, junto con 10,000 vs 20,000. De manera similar, al comparar entre 6000 y 20,000, no hay diferencia estadística en el recuento de puntos ( p =0.0787) e intensidad ( p =0,8083). Hay una diferencia significativa en el píxel máximo entre 6000 y 20,000 ( p =0,0140). En general, la curva de rendimiento muestra una dependencia significativa de la dosis en todos los parámetros (punto, intensidad, píxel máximo, p <0,0001). Estos resultados indican que la absorción de HEK293T EV depende de la dosis con un umbral mínimo de 6000 HEK293T EV por celda.

La absorción de HEK293T EV tiene un efecto de dosis con un umbral mínimo de 6000 EV. Se cocultivaron células HEK293T con HEK293T EVS a dosis crecientes de 0 a 20.000 / célula. un Imágenes IFC representativas de células receptoras con respectivas dosis de EV. La localización de GFP significa la captación de HEK293T EV. b - d Cuantificación de los ensayos de dosis en comparación con los controles y cada grupo mediante el recuento de puntos, la intensidad media de fluorescencia y las proporciones máximas de píxeles. Las barras representan la media ± SEM; N =3; ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. * p <0,05; *** p <0.01

Captación temporal de HEK293T EV

Usando 6000 EV por celda, HEK293T EV se cultivaron conjuntamente con células HEK293T durante períodos de tiempo cada vez mayores antes de la IFC, que van desde 5 min hasta 24 h. La duración de la exposición al EV jugó un papel clave en la cantidad de fluorescencia visible en las células receptoras, disminuyendo después de 12 h (Fig. 4a). Inicialmente, 30 minutos de cocultivo mostraron un aumento significativo en el recuento de manchas ( p =0,0081) sugiriendo una posible tendencia hacia la absorción de EV, pero no en otros parámetros de absorción (intensidad: p =0.3073, píxel máximo: p =0.0952) (Fig. 4b – d). A las 2 h de cocultivo, recuento de manchas significativamente mayor ( p =0,0028), intensidad ( p =0.0420) y píxel máximo ( p =0,0006) se registraron en comparación con las células receptoras sin EV. Nuevamente, a las 4 h de co-cultivo, todos los parámetros fueron mayores que los controles (recuento de puntos: p =0.0003, intensidad: p <0,0001, píxel máximo: p <0,0001). La intensidad y el píxel máximo continuaron siendo más altos que los controles a las 4, 12 y 24 h de cocultivo. No hubo diferencias en los parámetros de captación entre 4 y 12 h de cocultivo (spot: p =0.999, intensidad: p =0,5797; píxel máximo: p =0,2489). Sin embargo, la intensidad ( p =0.0191) y píxel máximo ( p =0. 0027) disminuyó entre 12 y 24 h de cocultivo (Fig. 4 c, d). Similar a la curva de dosis, la captación de HEK293T EV depende del tiempo con una captación constante de EV a las 4 h de incubación y un pico a las 12 h. En conjunto, se ha estandarizado una dosis de 6000 EV por célula sembrada y un cocultivo de 4 h para los siguientes ensayos de captación.

La absorción de HEK293T EV depende del tiempo. Las células HEK293T se cultivaron conjuntamente con 6000 HEK293T EV / célula durante períodos de tiempo cada vez mayores. un Imágenes IFC representativas de células receptoras, respectivamente. La localización de GFP significa una mayor absorción de HEK293T EV. b - d Cuantificación de los ensayos del curso del tiempo en comparación con los controles y cada grupo mediante el recuento de puntos, la intensidad media de fluorescencia y las proporciones máximas de píxeles. Las barras representan la media ± SEM; N =3; ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. * p <0,05; *** p <0.01

Captación comparativa de EV HEK293T por múltiples líneas celulares

La hipótesis de que la absorción de EV es un proceso selectivo en el que los EV son absorbidos preferentemente por células de su propio origen se probó utilizando IFC. Los EV HEK293T se cultivaron conjuntamente con células HEK293T u otras líneas celulares:epiteliales (células hepáticas C3A), endoteliales (células endoteliales de la vena umbilical humana) y neurales (células de glioblastoma SH-SY5Y). La fluorescencia de eGFP es más abundante en las células HEK293T en comparación con los otros tipos de células (Fig. 5a). En comparación con C3A y HUVEC, las células HEK293T tenían una intensidad de fluorescencia significativamente mayor (C3A: p =0,0321; HUVEC: p =0,0055) (Fig. 5c), cuando se co-cultivó con HEK293T EVs. Además, las celdas HEK293T tenían un píxel máximo más alto (C3A: p =0,0221; HUVEC: p =0,0079; SH-SY5Y: p =0,0486) (Fig. 5d) en comparación con todas las demás líneas celulares receptoras (Fig. 5b). En cuanto a la intensidad, las células SH-SY5Y fueron significativamente más altas que las HUVEC cuando se cultivaron conjuntamente con HEK293T EV ( p =0,0304). Estos resultados apoyan la captación selectiva de HEK293T EV por las células HEK293T en comparación con otras líneas celulares in vitro.

Los EV HEK293T muestran preferencia de aceptación de las células HEK293T. Los EV HEK293T se cultivaron conjuntamente con células HEK293T, células epiteliales C3A, células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y células neurales SY5Y. un Imágenes IFC representativas de células receptoras cocultivadas con EV HEK293T. b - d Cuantificación de los ensayos de preferencia de absorción de EV en comparación con los controles y entre sí mediante el recuento de puntos, la intensidad de fluorescencia media y las proporciones máximas de píxeles. Las barras representan la media ± SEM; N =3; ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. * p <0,05; *** p <0.01

Estado de diferenciación de células neuronales e internalización de HEK293T EV

Dado que los vehículos eléctricos han sido implicados con fines terapéuticos y de administración dirigidos a enfermedades neurales, las células madre neurales humanas (hNSC) y las neuronas humanas maduras se utilizaron como líneas celulares receptoras en nuestro sistema para examinar si el estado de diferenciación de la célula receptora juega un papel en la captación selectiva. de vehículos eléctricos. Las imágenes representativas de IFC mostraron evidencia visual de captación en ambos tipos de células, pero con la mayor localización de eGFP en hNSC (Fig. 6a). Los hNSC cocultivados con los EV HEK293T tienen un recuento de manchas más alto ( p =0,0082) y píxel máximo ( p =0,0083) en comparación con las neuronas maduras. Juntos, estos resultados sugieren que el estado de diferenciación de las células neurales afecta la captación de los EV HEK293T.

El estado de diferenciación neuronal afecta la captación de HEK293T EV. Los EV HEK293T se cultivaron conjuntamente con neuronas humanas maduras y células madre neurales humanas. un Imágenes IFC representativas de células receptoras cocultivadas con EV HEK293T. b - d Cuantificación de los ensayos de preferencia de absorción de EV en comparación con los controles y entre sí mediante el recuento de puntos, la intensidad de fluorescencia media y las proporciones máximas de píxeles. Las barras representan la media ± SEM; N =3; T no emparejado prueba. * p <0,05; *** p <0.01 en comparación con 0 EV (control)

Discusión

Proceso de estandarización de absorción in vitro de EV

Un grupo de expertos internacionales en vehículos eléctricos hizo hincapié en la necesidad de determinar eficazmente la dosis mínima efectiva de vehículos eléctricos para los ensayos de absorción, y aquí hemos desarrollado un sistema que puede ser adoptado eficazmente en el campo [26]. Existen desafíos al analizar la absorción de vehículos eléctricos. Por ejemplo, como nosotros y otros observamos, los resultados pueden diferir si se modifican la dosis de EV y el tiempo de exposición [26]. Abordamos la dosis y la concentración de HEK293T EV como una variable cinética. Además, una dosis mínima eficaz in vitro puede predecir de manera más uniforme la biodistribución in vivo de los EV y usarse para desarrollar parámetros de dosificación in vivo más consistentes para la terapéutica y la administración de EV. En un estudio de biodistribución de EV en ratón in vivo, el aumento de la dosis de EV HEK293T dio como resultado un cambio en la distribución relativa de EV en los órganos [27]. De manera similar a los hallazgos en un estudio in vitro previo que utilizó VE de cáncer de vejiga [39], los VE HEK293T mostraron una fuerte dependencia de la dosis con una dosis mínima efectiva de 6000 VE en nuestro estudio. Somos los primeros en utilizar partículas por célula como una medida de dosis sensible in vitro, que se correlaciona mejor con modelos in vivo que utilizan partículas por peso corporal. Nuestros datos también indicaron un límite de saturación de dosis después de 6000 EV, lo que podría informar futuros estudios de rango de dosis in vivo al indicar que las dosis más altas pueden tener beneficios limitados.

Otra variable de confusión de la medición de la absorción de EV son los posibles efectos temporales sobre la absorción de EV. En nuestro sistema, encontramos una fuerte dependencia del tiempo con una captación tan temprana como a las 2 h con una disminución potencial entre las 12 y las 24 h. De manera similar a nuestros hallazgos, la dependencia del tiempo se informó en pocos estudios que utilizaron células de cáncer de vejiga, células tumorales y otras con captación desde los 15 minutos hasta las 24 horas [29, 30, 31, 32, 33, 39, 43, 49]. Como se vio con los EV HEK293T, los valores más bajos a las 24 h de cocultivo pueden ser el resultado de la división celular o el reciclaje / degradación de los EV internalizados en puntos temporales tempranos [50]. Específicamente, dado que se ha demostrado que los VE se internalizan y luego se descomponen o internalizan y luego se liberan después de 24 h, las incubaciones más largas pueden generar lecturas de internalización inexactas [31, 50]. Nuestro estudio es el primero en utilizar IFC para proporcionar evidencia visual y cuantitativa de una curva de rendimiento dependiente del tiempo en la absorción de HEK293T EV.

Como sugiere el documento de posición de ISEV, la elección de una etiqueta de EV puede afectar la captación, lo que requiere técnicas menos disruptivas como los métodos de etiquetado de GFP utilizados en nuestro estudio. Específicamente, el 72% de los investigadores que participan en una encuesta afirman que los experimentos con colorantes lipídicos no son fiables a menos que se utilicen los controles adecuados [26]. Los colorantes EV no se correlacionan de manera confiable con un contenido pequeño de EV e incluso pueden aumentar el tamaño de las vesículas. La contaminación de las lipoproteínas mal etiquetadas y el contenido de proteínas y la agregación del colorante contribuyeron a los falsos positivos [51, 52]. Por lo tanto, fusionamos CD63 con un eGFP para etiquetar los EV HEK293T. Similar to other reports of protein tagging, HEK293T EVs were GFP positive with no observed differences in diameter and maintained standard EV surface protein composition [38, 46]. Despite this, it is important to note that labeling EVs with specific EV proteins may limit the tracking to only a few subtypes of EVs expressing the respective markers. Other potential limitations may be that the fluorescence intensity is dependent on protein expression level, the efficiency of EV membrane labeling, and excitation strength of the light source [53]. However, IFC is sensitive, detecting low fluorescence intensity with accurate visualization of CD63-GFP particles at the 100-nm range [38, 54].

Selective Uptake

EVs display proteins and other signals that may confer selective uptake [22, 23, 55]. Since the first step of EV biogenesis is the invagination of the plasma membrane, the EV membrane contains similar proteins, receptors, adhesion molecules, and integrins when compared with the donor cell membrane [22, 24, 55]. The lipid composition and tetraspanin proteins on EV membranes regulated by donor cells may contribute to EV tropisms with recipient cells [23, 34, 56]. MSC EVs selectively transported contents into MSCs, despite closer proximity to monocytes [24]. In contrast, others report that natural EVs were taken up equally by any cell type, regardless of EV origin [11, 22, 25, 57] when utilizing imaging or functional knockdown assays. Using the IFC platform, we found that HEK293T extracellular vesicles are taken up at greater quantities by HEK293T cells than other reported cell lines, thus suggesting an inherent EV uptake specificity. Through this outcome and the versatility of IFC, EV sources can be appropriately selected and analyzed for targeting specific recipient cells. To our knowledge, this is the first study utilizing imaging flow cytometry to analyze the specificity of HEK293T EVs.

In addition to self-selectivity, differentiation status of recipient cells has been hypothesized to play a role in uptake of EVs [32, 58, 59]. As our group and others have shown, EVs have therapeutic effects in the central nervous system and are known to modulate cell functions in neuronal development and adults [3, 7,8,9, 60]. Here for the first time, differentiation status of neurons affected EV uptake, where human neural stem cells had significantly greater uptake of HEK293T EVs compared to mature neurons. Immature hNSCs more actively internalize exogenous EVs than quiescent mature neurons. Since hNSCs are highly proliferative cells in culture, they may nonspecifically internalize nutrients and EVs. Similarly, immature dendritic cells internalized EVs at higher levels than mature dendritic cells [32, 59]. However, another study with myeloid precursor cells found that the mature dendritic cells and macrophages internalized more EVs than immature dendritic cells and monocytes [58]. The observed differences can be attributed to the phagocytic activity of further differentiated myeloid cells. Due to the in vitro evidence supporting selective uptake, HEK293T EVs can be used to modulate undifferentiated neurons in future therapeutic applications.

Conclusiones

In summary, we have further developed a quantitative and high-throughput platform for quantifying HEK293T EV uptake kinetics. This platform can be extended to other donor EVs and recipient cell types and assays for liposomes and synthetic nanoparticle delivery vectors. Significantly, we found that HEK293T EV uptake is a selective process, with specificity towards HEK293T cells. The IFC assays developed here can be used to better define parameters used in in vivo dose escalation and biodistribution studies and provide instrumental information for a predictive model of EV uptake outcomes in vivo.

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos generados y / o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Abreviaturas

EV:: Extracellular vesicles
HEK293T:: Human embryonic kidney cell line
IFC:: Imaging flow cytometry
hNSC:: Human neural stem cell
GFP:: Green fluorescent protein
BF:: Campo brillante
SSC:: Side scatter
ISEV:: International Society of Extracellular Vesicles

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