Optimización de Citometría de Flujo por Imagen para Cuantificar Cinética y Especificidad de Captación de Vesículas Extracelulares HEK293T

Resumen

Las vesículas extracelulares (VEs) son vesículas de bicapa lipídica de tamaño nanométrico que se secretan naturalmente desde la mayoría de los tipos celulares como mecanismo de comunicación para entregar proteínas, lípidos y material genético. A pesar del potencial terapéutico de las VEs, hay información limitada sobre la cinética y especificidad de captación de VEs. Aquí, optimizamos una plataforma basada en citometría de flujo por imagen (CFI) para evaluar cuantitativamente los efectos de dosis, tiempo y especificidad de célula receptora en la internalización de VEs de células renales embrionarias humanas (HEK293T) de manera de alto rendimiento. Encontramos que la captación de VEs HEK293T es un proceso activo que es dependiente de dosis y tiempo. Además, la selectividad de captación de VEs se cuantificó in vitro, y encontramos que las VEs HEK293T fueron internalizadas en mayores cantidades por células del mismo origen. Por último, las células madre neuronales internalizaron significativamente más VEs HEK293T relativas a neuronas maduras, sugiriendo que las células madre o progenitoras, que son metabólicamente más activas que las células terminalmente diferenciadas, pueden tener tasas más altas de internalización activa de VEs. La caracterización de la captación de VEs, notablemente especificidad, dependencia de dosis y tiempo, y ensayos cinéticos ayudarán a informar y desarrollar terapéuticas basadas en VEs dirigidas y eficientes.

Introducción

La investigación de vesículas extracelulares es un campo en auge debido a la utilidad terapéutica y diagnóstica de vesículas extracelulares (VEs) naturales e ingenieradas. Las VEs varían de 50 a 1000 nm de diámetro, se producen de todos los tipos celulares, y están enriquecidas con proteínas transmembrana, incluyendo CD63, CD81 y CD9; lípidos; proteínas; y ADN, ARN, ARNm y microARN [1-5]. El contenido de VEs, notablemente ARNm y miARN activos, ha sido implicado en la modulación de células receptoras vía traducción de novo y regulación post-traduccional de células diana [4, 6]. Entender y luego modificar la captación cinética e internalización de VEs eventualmente llevará a una entrega optimizada de contenidos de VEs a células diana con concentraciones lo suficientemente altas para tener un beneficio terapéutico.

Una vez consideradas "la basura de las células", las VEs han sido aprovechadas como alternativa a terapias celulares debido a muchas ventajas incluyendo su biocompatibilidad, baja inmunogenicidad y toxicidad, capacidad para dosificación repetida, diversas rutas de administración, y potencial para entregar fármacos y terapias génicas [3]. Nuestro grupo ha reportado previamente efectos positivos de VEs derivadas de células madre neurales en accidente cerebrovascular y lesión cerebral traumática. En modelos murinos y porcinos de accidente cerebrovascular, las VEs mejoraron la recuperación tisular y funcional post-accidente cerebrovascular [3, 7, 8]. También hemos mostrado que las VEs son neuroprotectoras con beneficios funcionales en un modelo de roedor de lesión cerebral traumática [9]. A pesar de estos efectos observados y el potencial futuro de las VEs, hay poca comprensión de la especificidad y cinética de captación de VEs, lo que puede obstaculizar la traducción de terapéuticas de VEs a la clínica.

Las VEs también han sido ingenieradas como vectores de transferencia y cargadas con agentes terapéuticos incluyendo terapias génicas y compuestos químicos como alternativa a terapéuticas y vectores de entrega de nanopartículas sintéticas [4, 10-12]. Las células HEK293T han sido ampliamente usadas como células productoras de VEs debido a su proliferación rápida inherente, alto rendimiento de VEs, y facilidad de manipulación genética [13-17]. Las VEs HEK293T entregaron terapias génicas incluyendo terapéuticos miARN para cáncer de mama [12] y se han usado para entregar quimioterapéuticos y constructos de proteínas terapéuticas en un modelo de schwannoma [18]. Similar a estudios de nanopartículas sintéticas evaluando citotoxicidad in vitro, ensayos de toxicidad MTT mostraron baja toxicidad de VEs HEK293T sin cargar y alta citotoxicidad subsiguiente cuando se cargaron con quimioterapéuticos [10, 18-21]. Debido a esta abundante utilización de VEs HEK293T, analizamos su cinética y especificidad en este estudio.

La captación selectiva o específica se refiere a la capacidad natural de una VE para dirigirse a tipos celulares específicos. Hay abundante evidencia sobre los mecanismos de internalización de VEs con poco consenso sobre la especificidad de captación [22]. A menudo las VEs exhiben captación selectiva por células receptoras similares a sus células parentales, células epiteliales internalizan más VEs derivadas de epitelio que otras células receptoras [23, 24], y células madre mesenquimales (CMM) internalizan una cantidad significativamente mayor de VEs derivadas de CMM comparadas con otras líneas celulares in vitro [24]. Sin embargo, otros estudios encontraron que las VEs son internalizadas por todos los tipos celulares y muestran una biodistribución no selectiva cuando se administran in vivo [22, 25]. A pesar del inmenso potencial terapéutico e interés de las VEs, hay una deficiencia en la comprensión de la especificidad de captación de VEs. Al entender mejor la especificidad de captación de VEs, podemos elegir apropiadamente células productoras de VEs que sean selectivamente internalizadas por células receptoras de interés y así mejorar la aplicabilidad terapéutica de las VEs.

Una razón potencial para resultados conflictivos de captación de VEs es la falta de estandarización en plataformas de medición, incluyendo análisis de efectos de dosis y tiempo. Recientemente, un grupo de expertos de la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) publicó un documento de posición enfatizando la necesidad de análisis de dosis y tiempo, entre otros factores confusos en la captación de VEs [26]. El grupo declaró que "una dosis no sirve para todos" y que la dosis puede afectar la captación o selectividad de VEs [26]. Elevar dosis de VEs HEK293T cambia el patrón de biodistribución in vivo [27]. Los perfiles de captación de VEs derivadas de suero fueron alterados significativamente por la dosis [28]. Además, los tiempos de co-incubación de VEs con células receptoras que van desde 15 min a 48 h [24, 29-33] pueden alterar las mediciones de captación. Si es adoptado por investigadores e industria de VEs, un proceso cuantificable y confiable para determinar curvas estándar de dosis y tiempo para ayudar a identificar la dosis mínima efectiva puede llevar a estudios más robustos y útiles.

Previamente, los investigadores han usado citometría de flujo estándar junto con varias formas de microscopía de bajo rendimiento incluyendo microscopía confocal para analizar la captación de VEs [32-34]. Sin embargo, estas tecnologías tienen varias limitaciones. La microscopía confocal puede ser lenta y subjetiva. Los citómetros de flujo tradicionales han sido diseñados para medir partículas biológicas en el rango celular, no pueden diferenciar enjambre o coincidencia de VEs, y tienen ruido incrementado debido al disparo [35-38]. Como mencionó el grupo ISEV, hay una conciencia creciente de las limitaciones físicas de la citometría de flujo tradicional y destacan la demanda de citometría de flujo especializada con límites de detección en el rango de 100 nm [26, 38]. La citometría de flujo por imagen (CFI) combina la naturaleza cuantitativa de alto rendimiento de la citometría de flujo junto con tecnología de imagen de fluorescencia que puede resolver partículas fluorescentes inherentemente pequeñas, hasta 100 nm de diámetro [38]. Las capacidades de CFI conducen a bajo ruido/fondo, disminución de enjambre, y dispositivos de carga acoplada para claridad de imagen [37, 39]. Estas características ayudan a desarrollar una estrategia de gating para caracterizar VEs y captación con confirmación visual de manera de alto rendimiento como una plataforma de captación de VEs precisa y cuantificable [36, 37, 40].

En este estudio, se utilizaron células HEK293T expresando CD63-eGFP como línea celular donadora para producción de VEs debido a su uso común en desarrollo terapéutico. Las VEs fluorescentes aisladas se co-cultivaron con líneas celulares receptoras incluyendo células neurales y endoteliales. La captación se cuantificó usando CFI, resultando en una plataforma estandarizada para medir las importantes características cinéticas de captación e internalización de VEs para sistemas celulares in vitro. Además, proporcionamos datos sobre un proceso para cuantificar la captación de VEs fluorescentes en condiciones diferentes y líneas celulares cultivadas para elucidar la captación selectiva de VEs.

Materiales y Métodos

Cultivo Celular

Células renales embrionarias humanas (HEK293T) se compraron de ATCC y se cultivaron en DMEM conteniendo 10% suero fetal bovino, 100 U/mL penicilina, y 100 μg/mL estreptomicina. Células madre neurales humanas (hNSC), células neurales SH-SY5Y, células epiteliales hepáticas C3A, células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), y neuronas se cultivaron todas bajo condiciones estándar a 37 °C, 5% CO₂ antes de los ensayos de captación de vesículas extracelulares.

Etiquetado y Aislamiento de VEs

ADN plasmídico CD63-eGFP se obtuvo de Addgene (#62964). CD63-pEGFP C2 fue un regalo de Paul Luzio (plasmido Addgene #62964). Las células HEK293T se cultivaron al 70% de confluencia en platos de 10 cm, y 10 μg de ADN plasmídico se transfectaron usando Lipofectamine 2000 según instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas post-transfección, los medios se cambiaron a medios estándar HEK293T desprovistos de suero fetal bovino y se recolectaron por 3 días consecutivos. Como se describió previamente [3], los medios HEK293T se filtraron a través de un filtro de 0.22-μm y se enriquecieron por ultrafiltración usando unidades de filtro centrífugo de celulosa regenerada 100-kDa Amicon y se lavaron dos veces con PBS++. Las VEs se concentraron a 1 mL, y la concentración y distribuciones de tamaño se midieron en Nanosight NS300 por el protocolo del fabricante (Malvern, UK). Las VEs se aislaron de diferentes vasos de cultivo HEK293T, cada vaso considerado réplicas biológicas separadas, con tres réplicas técnicas dentro de cada réplica biológica (mínimo de nueve muestras totales para cada condición).

Ensayos de Captación

Las líneas celulares receptoras se sembraron al 60% de confluencia en placa de 6 pocillos por 24 h bajo condiciones de cultivo estándar a 37 °C. Los medios estándar se cambiaron a medios libres de suero fetal bovino (FBS−) antes de la co-cultura con vesículas extracelulares. VEs etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) se administraron a células a dosis y puntos de tiempo variables. Después de la co-cultura, las células se resuspendieron en 5% tripsina y se concentraron a alrededor de un millón de células por 50 μL para citometría de flujo. Treinta y siete grados Celsius es el estándar para experimentos de captación de VEs en nuestros ensayos ya que ha sido el estándar usado para tanto cultivo celular como plataformas de captación de VEs in vitro [31, 41-44].

Ensayos Inhibitorios

Ensayo en Frío

Las VEs se co-cultivaron con células receptoras a 4 °C para efectivamente "pausar" el crecimiento del cultivo celular e inhibir procesos activos [45]. Cuatro grados Celsius inhibe todas las formas activas de captación de VEs [31, 41-44].

Ensayo Fijado

Las células receptoras se fijaron en 4% paraformaldehído por 30 min en hielo y se lavaron con PBS inmediatamente antes de la co-cultura con VEs para inhibir todas las formas activas de captación de VEs.

Adquisición ImageStreamX

La adquisición se realizó en el Citómetro de Flujo por Imagen ImageStreamX Mark II (Luminex Corporation, Seattle, Washington) usando el software INSPIRE. Se adquirieron un mínimo de 5000–10,000 eventos celulares. Cada muestra biológica se replicó en tres pocillos de réplica técnica y se adquirió individualmente en el ISx. Imágenes de campo claro se colectaron en canal uno y dispersión lateral (785 nm) en canal seis. La proteína fluorescente verde (GFP) se excitó con láser argón 488 nm a 200 mW, y la fluorescencia se colectó en canal dos (480-560 nm). Una magnificación de 60× se usó en cada muestra junto con una tasa de adquisición baja para alta sensibilidad.

Análisis IDEAS

Los análisis de datos e imágenes se realizaron usando el software IDEAS (Luminex). La estrategia de gating es la siguiente:

1. Puerta de foco se determinó para eliminar células que no estaban en el campo de foco usando el valor Gradient RMS.

2. Las células enfocadas se gatingaron para eliminar dobletes y desechos usando área de campo claro vs. relación de aspecto de campo claro. Los datos gateados se usaron para crear histogramas y generar referencias estadísticas midiendo intensidad de fluorescencia (suma de todos los píxeles en una imagen), intensidad máxima de píxel (intensidad de los píxeles más brillantes en una imagen), junto con valores de conteo de manchas vía algoritmos internos para cada muestra. Las características de conteo de manchas se generaron usando los Asistentes IDEAS aplicables. Conteo de manchas, intensidad media, y razón de píxel máximo se calculan por la fórmula (Valor de salida con VEs/Valor de salida sin VEs).

Estadísticas

Todos los datos cuantitativos se analizaron vía GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, California) y se hicieron en triplicados. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). La significancia estadística se determinó usando una prueba T no pareada o un análisis de varianza de un factor (ANOVA) con prueba post hoc de Tukey o Dunnett comparado con controles cuando apropiado. p < 0.05 se consideró significativo.

Resultados

Propiedades de Vesículas Extracelulares HEK293T Etiquetadas con CD63-eGFP

Para generar VEs etiquetadas fluorescentemente para analizar la cinética y captación de vesículas extracelulares, las células HEK293T se transfectaron con un plásmido que porta proteína de fusión CD63-eGFP. CD63 es una proteína tetraspanina comúnmente enriquecida en la membrana de exosomas lo que la hace un objetivo óptimo para etiquetado fluorescente de VEs [46, 47]. Los medios gastados se recolectaron del cultivo de células HEK293T, y las VEs se aislaron como se reportó previamente [8]. Comparamos el tamaño y distribución de VEs aisladas de células HEK293T transfectadas con CD63-eGFP a células HEK293T no transfectadas. Las VEs de control y HEK293T transfectadas con CD63-eGFP mostraron un diámetro mediano promedio de 110.28 nm y 103.616 nm, respectivamente, como se midió por software de nanotracking (Fig. 1a), lo cual es consistente con el tamaño reportado de VEs HEK293T [13, 15, 27, 48]. No se observaron diferencias significativas en diámetro mediano (p = 0.1615) y distribución (p = 0.4225) de VEs aisladas de células HEK293T no transfectadas y transfectadas con CD63-eGFP. El etiquetado eGFP no alteró el tamaño de VEs HEK293T (Fig. 1b).

El ensayo CFI se realizó para determinar si el CD63-eGFP estaba asociado con VEs. Como control fluorescente negativo, cuentas de 1.34 μM en solución tampón (Fig. 1c, superior) carecían de fluorescencia cuando se exponían a la longitud de onda de excitación 488-nm, pero eran visibles en campo claro (BF) y dispersión lateral (SSC). VEs HEK293T sin etiquetar eran negativas en BF, GFP y SSC, sugiriendo un tamaño pequeño por debajo del umbral BF y falta de fluorescencia (Fig. 1d, medio). La ausencia en BF significa un tamaño de VE menor a 300 nm, lo que sugiere enjambre mínimo de VEs. Por último, VEs etiquetadas CD63-eGFP son negativas en BF y positivas en el canal GFP significando fluorescencia positiva de las VEs HEK293T (Fig. 1c, inferior). La señal positiva en el canal GFP puede ser indicativa de una sola VE o un grupo de VEs fluorescentes. Colectivamente, estos resultados muestran que las VEs HEK293T aisladas tienen tamaño estándar y perfiles de marcadores proteicos consistentes con reportes previos de exosomas HEK293T, y el etiquetado eGFP no altera el tamaño de VEs HEK293T [5, 27].

Usando un método comercial basado en citometría de flujo para medir marcadores comunes de VEs, determinamos el perfil general de tetraspaninas de VEs [5]. VEs HEK293T aisladas de control y células HEK293T expresando CD63-eGFP fueron positivas para marcadores estándar de VEs incluyendo CD9, CD63 y CD81 medidos en unidades de fluorescencia relativa (Fig. 1d). Como se reportó previamente, CD29 también se encontró en la superficie de VEs HEK293T y VEs HEK293T transfectadas con CD63-eGFP [5]. Estos resultados indican que los métodos de aislamiento y etiquetado para VEs HEK293T resultan en VEs con marcadores comunes de exosomas HEK293T.

Captación Activa de VEs HEK293T

Se realizaron dos ensayos inhibitorios de internalización. VEs HEK293T se co-cultivaron con células receptoras a 4 °C (frío) o con células receptoras previamente fijadas con paraformaldehído (fijado). Los tratamientos disminuyeron la presencia de VEs etiquetadas eGFP en las células receptoras comparadas con células receptoras co-cultivadas con VEs bajo condiciones fisiológicas (Fig. 2a). Los ensayos inhibitorios frío y fijado redujeron el conteo de manchas (frío: p = 0.0127, fijado: p = 0.0078), intensidad (frío: p = 0.0105, fijado: p = 0.0374), y píxel máximo (frío: p = 0.0159, fijado: p = 0.0149) de señales de fluorescencia en células receptoras sin tratamientos, indicando inhibición de captación de VEs. Estos resultados infieren que la localización eGFP e incrementos en parámetros de salida significan que las VEs HEK293T son internalizadas para los siguientes ensayos de captación.

Captación de VEs HEK293T Dependiente de Dosis

Para desarrollar una curva de dosis estándar para la plataforma CFI, las VEs HEK293T se co-cultivaron con células receptoras HEK293T a dosis crecientes desde 0 a 20,000 VEs por célula a 37 °C. Imágenes representativas CFI exhibieron un aumento visual de fluorescencia eGFP con dosis elevadas de VEs (Fig. 3a). El número más bajo de VEs que pudo detectarse fue 6000 VEs por célula HEK293T co-cultivada. A este nivel, conteo de manchas (p = 0.0012), intensidad (p = 0.0075), y píxel máximo (p = 0.0005) fueron significativamente mayores que células receptoras sin VEs (Fig. 3b–d). Por lo tanto, dosis de 6000 VEs HEK293T es el umbral bajo para captación en nuestra condición experimental. Similarmente, dosis de 10,000 y 20,000 VEs tuvieron mayor conteo de manchas (10,000: p = 0.0009; 20,000: p < 0.0001), intensidad (10,000: p < 0.0001; 20,000: p < 0.0001) y píxel máximo (10,000: p < 0.0001; 20,000: p < 0.0001) comparadas con células sin VEs. Comparando entre las dosis más altas, no hay diferencias significativas en conteo de manchas (6000 vs. 10,000: p = 0.999, 10,000 vs. 20,000: p = 0.0927), intensidad (6000 vs. 10,000: p = 0.8482, 10,000 vs. 20,000: p = 0.999), y conteo de píxel máximo (6000 vs. 10,000: p = 0.6056, 10,000 vs. 20,000: p = 0.5281) entre 6000 y 10,000, junto con 10,000 vs. 20,000. Similarmente, comparando entre 6000 y 20,000, no hay diferencia estadística en conteo de manchas (p = 0.0787) e intensidad (p = 0.8083). Hay una diferencia significativa en píxel máximo entre 6000 y 20,000 (p = 0.0140). En general, la curva de rendimiento muestra una dependencia de dosis significativa en todos los parámetros (mancha, intensidad, píxel máximo, p < 0.0001). Estos resultados indican que la captación de VEs HEK293T es dependiente de dosis con un umbral mínimo de 6000 VEs HEK293T por célula.

Captación Temporal de VEs HEK293T

Usando 6000 VEs por célula, las VEs HEK293T se co-cultivaron con células HEK293T por longitudes de tiempo crecientes antes de CFI, variando de 5 min a 24 h. La longitud de exposición a VEs jugó un papel clave en la cantidad de fluorescencia visible en las células receptoras, disminuyendo después de 12 h (Fig. 4a). Inicialmente, 30 min de co-cultura mostraron un aumento significativo en conteo de manchas (p = 0.0081) sugiriendo una posible tendencia hacia captación de VEs, pero no en otros parámetros de captación (intensidad: p = 0.3073, píxel máximo: p = 0.0952) (Fig. 4b–d). A 2 h de co-cultura, conteo de manchas significativamente mayor (p = 0.0028), intensidad (p = 0.0420), y píxel máximo (p = 0.0006) se registraron comparados con células receptoras sin VEs. De nuevo, a 4 h de co-cultura, todos los parámetros fueron mayores que controles (conteo de manchas: p = 0.0003, intensidad: p < 0.0001, píxel máximo: p < 0.0001). Intensidad y píxel máximo continuaron siendo mayores que controles a 4, 12 y 24 h de co-cultura. No hubo diferencias en ningún parámetro de captación entre 4 y 12 h de co-cultura (mancha: p = 0.999, intensidad: p = 0.5797; píxel máximo: p = 0.2489). Sin embargo, intensidad (p = 0.0191), y píxel máximo (p = 0.0027) disminuyeron entre 12 y 24 h de co-cultura (Fig. 4 c,d). Similar a la curva de dosis, la captación de VEs HEK293T es dependiente de tiempo con captación consistente a 4 h de incubación y un pico a 12 h. Colectivamente, una dosis de 6000 VEs por célula sembrada y una co-cultura de 4 h se ha estandarizado para los siguientes ensayos de captación.

Captación Comparativa de VEs HEK293T por Múltiples Líneas Celulares

La hipótesis de que la captación de VEs es un proceso selectivo donde las VEs son preferentemente internalizadas por células de su mismo origen se probó usando CFI. Las VEs HEK293T se co-cultivaron con células HEK293T u otras líneas celulares: epiteliales (células hepáticas C3A), endoteliales (células endoteliales de vena umbilical humana), y neurales (células glioblastoma SH-SY5Y). La fluorescencia eGFP es más abundante en células HEK293T comparadas con los otros tipos celulares (Fig. 5a). Comparadas con C3A y HUVECs, las células HEK293T tuvieron fluorescencia de intensidad significativamente mayor (C3A: p = 0.0321; HUVEC: p = 0.0055) (Fig. 5c), cuando se co-cultivaron con VEs HEK293T. Adicionalmente, las células HEK293T tuvieron mayor píxel máximo (C3A: p = 0.0221; HUVEC: p = 0.0079; SH-SY5Y: p = 0.0486) (Fig. 5d) comparadas con todas las otras líneas celulares receptoras (Fig. 5b). Respecto a intensidad, las células SH-SY5Y fueron significativamente mayores que HUVECs cuando se co-cultivaron con VEs HEK293T (p = 0.0304). Estos resultados apoyan la captación selectiva de VEs HEK293T por células HEK293T comparadas con otras líneas celulares in vitro.

Estado de Diferenciación de Células Neurales e Internalización de VEs HEK293T

Dado que las VEs han sido implicadas para propósitos terapéuticos y de entrega dirigidos a enfermedades neurales, células madre neurales humanas (hNSCs) y neuronas humanas maduras se usaron como líneas celulares receptoras en nuestro sistema para examinar si el estado de diferenciación de la célula receptora juega un papel en la captación selectiva de VEs. Imágenes representativas de CFI mostraron evidencia visual de captación en ambos tipos celulares, pero con la mayor localización eGFP en hNSCs (Fig. 6a). Las hNSCs co-cultivadas con VEs HEK293T tienen mayor conteo de manchas (p = 0.0082) y píxel máximo (p = 0.0083) comparadas con neuronas maduras. Juntos, estos resultados sugieren que el estado de diferenciación de células neurales afecta la captación de VEs HEK293T.

Discusión

Proceso de Estandarización de Captación de VEs in vitro

Un grupo de expertos internacionales en VEs enfatizó la necesidad de determinar efectivamente la dosis mínima efectiva de VEs para ensayos de captación, y aquí hemos desarrollado un sistema que puede ser efectivamente adoptado por el campo [26]. Hay desafíos al analizar la captación de VEs. Por ejemplo, como nosotros y otros observamos, los resultados pueden diferir si la dosis de VEs y el tiempo de exposición se alteran [26]. Abordamos la dosis y concentración de VEs HEK293T como variable cinética. También, una dosis mínima efectiva in vitro puede predecir más uniformemente la biodistribución in vivo de VEs y usarse para desarrollar parámetros de dosificación in vivo más consistentes para terapéuticas y entrega de VEs. En un estudio de biodistribución in vivo de VEs en ratón, el aumento de dosis de VEs HEK293T resultó en un cambio de la distribución relativa de VEs en órganos [27]. Similar a hallazgos en un estudio previo in vitro usando VEs de cáncer de vejiga [39], las VEs HEK293T mostraron una fuerte dependencia de dosis con una dosis mínima efectiva a 6000 VEs en nuestro estudio. Somos los primeros en usar partículas por célula como medición de dosis sensible in vitro, que mejor correlaciona con modelos in vivo usando partículas por peso corporal. Nuestros datos también indicaron un límite de saturación de dosis después de 6000 VEs, potencialmente informando futuros estudios de rango de dosis in vivo al indicar que dosis más altas pueden tener beneficios limitados.

Otra variable confusa de medir la captación de VEs es el potencial efecto temporal en la captación de VEs. En nuestro sistema, encontramos una fuerte dependencia de tiempo con captación tan temprana como 2 h con una disminución potencial entre 12 y 24 h. Similar a nuestros hallazgos, la dependencia de tiempo se reportó en pocos estudios usando células de cáncer de vejiga, células tumorales y otros con captación tan temprana como 15 min hasta 24 h [29-33, 39, 43, 49]. Como se vio con VEs HEK293T, los valores más bajos a 24 h de co-cultura pueden ser resultado de división celular o reciclaje/degradación de VEs internalizadas en puntos de tiempo tempranos [50]. Específicamente, desde que se ha mostrado que las VEs son internalizadas luego descompuestas o internalizadas luego liberadas después de 24 h, incubaciones más largas pueden generar lecturas de internalización inexactas [31, 50]. Nuestro estudio es el primero en usar CFI para proporcionar evidencia visual y cuantitativa de una curva de rendimiento dependiente de tiempo en la captación de VEs HEK293T.

Como sugiere el documento de posición ISEV, la elección de una etiqueta de VE puede afectar la captación, necesitando técnicas menos disruptivas como los métodos de etiquetado GFP usados en nuestro estudio. Específicamente, el 72% de investigadores participando en una encuesta afirman que los experimentos con tintes lipídicos son poco confiables a menos que se usen controles apropiados [26]. Los tintes de VEs no correlacionan confiablemente con contenido de VEs pequeñas e incluso pueden aumentar el tamaño de vesículas. Contaminación de lipoproteínas mal etiquetadas y contenido proteico y agregación de tinte contribuyeron a falsos positivos [51, 52]. Por lo tanto, fusionamos CD63 con eGFP para etiquetar las VEs HEK293T. Similar a otros reportes de etiquetado proteico, las VEs HEK293T fueron GFP positivas sin diferencias observadas en diámetro y mantuvieron la composición estándar de proteínas superficiales de VEs [38, 46]. A pesar de esto, es importante notar que etiquetar VEs con proteínas específicas de VEs puede limitar el rastreo a solo unos subtipos de VEs expresando los marcadores respectivos. Otras limitaciones potenciales pueden ser que la intensidad de fluorescencia depende del nivel de expresión proteica, la eficiencia de etiquetado de membrana de VEs, y la fuerza de excitación de la fuente de luz [53]. Sin embargo, CFI es sensible, detectando baja intensidad de fluorescencia con visualización precisa de partículas CD63-GFP en el rango de 100 nm [38, 54].

Captación Selectiva

Las VEs muestran proteínas y otras señales que pueden conferir captación selectiva [22, 23, 55]. Desde que el primer paso de biogénesis de VEs es la invaginación de la membrana plasmática, la membrana de VEs contiene proteínas similares, receptores, moléculas de adhesión e integrinas cuando se comparan con la membrana de la célula donadora [22, 24, 55]. La composición lipídica y proteínas tetraspaninas en membranas de VEs reguladas por células donadoras pueden contribuir a tropismos de VEs con células receptoras [23, 34, 56]. Las VEs CMM transportaron selectivamente contenidos en CMM, a pesar de mayor proximidad a monocitos [24]. En contraste, otros reportan que VEs naturales fueron internalizadas por igual por cualquier tipo celular, independientemente del origen de VEs [11, 22, 25, 57] cuando usando imágenes o ensayos de knockdown funcional. Usando la plataforma CFI, encontramos que las vesículas extracelulares HEK293T son internalizadas en mayores cantidades por células HEK293T que otras líneas celulares reportadas, sugiriendo una especificidad inherente de captación de VEs. A través de este resultado y la versatilidad de CFI, las fuentes de VEs pueden ser apropiadamente seleccionadas y analizadas para dirigirse a células receptoras específicas. A nuestro conocimiento, este es el primer estudio utilizando citometría de flujo por imagen para analizar la especificidad de VEs HEK293T.

Además de auto-selectividad, el estado de diferenciación de células receptoras se ha hipotetizado que juega un papel en la captación de VEs [32, 58, 59]. Como nuestro grupo y otros han mostrado, las VEs tienen efectos terapéuticos en el sistema nervioso central y se sabe que modulan funciones celulares en desarrollo neuronal y adultos [3, 7-9, 60]. Aquí por primera vez, el estado de diferenciación de neuronas afectó la captación de VEs, donde las células madre neurales humanas tuvieron captación significativamente mayor de VEs HEK293T comparadas con neuronas maduras. Las hNSCs inmaduras internalizan activamente VEs exógenas que neuronas maduras quiescentes. Dado que las hNSCs son células altamente proliferativas en cultivo, pueden internalizar inespecíficamente nutrientes y VEs. Similarmente, células dendríticas inmaduras internalizaron VEs a niveles más altos que células dendríticas maduras [32, 59]. Sin embargo, otro estudio con células precursoras mieloides encontró que las células dendríticas maduras y macrófagos internalizaron más VEs que células dendríticas inmaduras y monocitos [58]. Las diferencias observadas pueden atribuirse a la actividad fagocítica de células mieloides más diferenciadas. Debido a la evidencia in vitro apoyando captación selectiva, las VEs HEK293T pueden usarse para modular neuronas indiferenciadas en futuras aplicaciones terapéuticas.

Conclusiones

En resumen, hemos desarrolladoさらに una plataforma cuantitativa y de alto rendimiento para cuantificar la cinética de captación de VEs HEK293T. Esta plataforma puede extenderse a otras VEs donadoras y tipos celulares receptores y ensayos para liposomas y vectores de entrega de nanopartículas sintéticas. Significativamente, encontramos que la captación de VEs HEK293T es un proceso selectivo, con especificidad hacia células HEK293T. Los ensayos CFI desarrollados aquí pueden usarse para definir mejor parámetros usados en estudios de escalada de dosis y biodistribución in vivo y proporcionar información instrumental para un modelo predictivo de resultados de captación de VEs in vivo.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente bajo solicitud razonable.

Abreviaturas

VE:

Vesículas extracelulares

HEK293T:

Línea celular renal embrionaria humana

CFI:

Citometría de flujo por imagen

hNSC:

Célula madre neural humana

GFP:

Proteína fluorescente verde

BF:

Campo claro

SSC:

Dispersión lateral

ISEV:

Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares