Administración Dirigida de Doxorrubicina mediante Liposomas Funcionalizados con Aptámero Anti-EpCAM: Eficacia en Modelos de Carcinoma de Colon C26

Resumen

En este estudio, se funcionalizaron liposomas de doxorrubicina (DOX) pegilados (Caelyx®) con un aptámero anti-EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial) mediante post-inserción de DSPE-mPEG₂₀₀₀ conjugado al aptámero (ED-lip). Se determinaron el tamaño, la carga, el perfil de liberación, la citotoxicidad y la captación celular de la formulación. La caracterización del ED-lip mostró un ligero aumento en el tamaño y el índice de polidispersidad (PDI), junto con una disminución del potencial zeta, lo que confirma una post-inserción eficiente. Los resultados de citometría de flujo y microscopía de fluorescencia demostraron que el ED-lip aumentó significativamente la captación celular en la línea C26 frente a Caelyx®. El ED-lip también exhibió mayor efecto citotóxico, confirmando la eficacia del aptámero anti-EpCAM como ligando de direccionamiento. Los estudios farmacocinéticos y de biodistribución en ratones con tumores C26 revelaron que el ED-lip no alteró el perfil de distribución de la DOX respecto a Caelyx®, pero mejoró significativamente la acumulación tumoral del fármaco y prolongó la supervivencia de los animales. Estos resultados sugieren que la funcionalización de Caelyx® con aptámero anti-EpCAM es una estrategia prometedora en el tratamiento del cáncer que merece mayor investigación.

Introducción

Los sistemas de administración de fármacos a nanoescala (NDDS) de 100–200 nm se acumulan pasivamente en el microambiente tumoral mediante el efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR), a través del revestimiento endotelial laxo y el drenaje linfático deficiente. Sin embargo, datos recientes indican que menos del 1% del fármaco administrado alcanza el sitio tumoral. La incapacidad de penetrar la matriz extracelular (ECM) densa, el retorno del fármaco liberado a la circulación y la heterogeneidad tumoral explican este fallo. Se han empleado diversas estrategias para mejorar la acumulación tumoral de los NDDS usando estímulos endógenos y exógenos, incluyendo nanomateriales inorgánicos con capacidad anticancerígena, aunque su toxicidad y seguridad ambiental requieren atención.

La administración dirigida activa es un enfoque clave que permite a los NDDS entregar agentes terapéuticos de manera más eficiente a los tumores, minimizando la exposición a tejidos no diana. Un agente de direccionamiento ideal debe tener afinidad por proteínas o receptores de superficie celular sobreexpresados en células o tejidos específicos. La molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) es una glicoproteína transmembrana candidata para direccionamiento activo. Estudios recientes muestran que EpCAM tiene baja expresión en células epiteliales sanas, pero se sobreexpresa hasta 1000 veces en células cancerosas. Durante el desarrollo del cáncer, el patrón de expresión de EpCAM cambia de membranas basales y basolaterales en epitelio normal a la superficie apical en células epiteliales tumorales, lo que la convierte en un ligando muy atractivo para mejorar el índice terapéutico de los fármacos.

EpCAM se ha identificado como marcador de células madre cancerosas (CSC) o células iniciadoras de tumores (TIC), y su sobreexpresión se asocia a mal pronóstico. Las CSC/TIC poseen capacidad de autorrenovación y juegan roles clave en el desarrollo tumoral y la metástasis. La sobreexpresión de EpCAM se ha reportado en CSC de diversos tumores sólidos. Recientemente, los aptámeros han cobrado gran atención como moléculas potencialmente poderosas para usar como ligandos de direccionamiento en NDDS. Los aptámeros son oligonucleótidos de ADN o ARN con estructuras secundarias y terciarias que se unen a dianas como receptores de superficie celular. Ofrecen ventajas sobre los anticuerpos: son no inmunogénicos, de bajo peso molecular (8–25 kDa), químicamente y térmicamente estables, y su síntesis y modificación son económicas y escalables. El direccionamiento selectivo de NDDS mediante aptámero anti-EpCAM podría ser una opción efectiva para entregar quimioterápicos al microambiente tumoral. Diversos estudios han demostrado que nanoportadores funcionalizados con aptámero anti-EpCAM mejoran eficazmente la entrega de fármacos anticancerígenos a células tumorales.

El objetivo de este estudio fue desarrollar liposomas nanométricos pegilados cargados con doxorrubicina (DOX) y funcionalizados con aptámero de ADN anti-EpCAM (SYL3C) (ED-lip) como modelo de NDDS. La funcionalización se realizó mediante química de acoplamiento EDC/NHS entre el grupo amino del aptámero y el grupo carboxilo del DSPE-mPEG₂₀₀₀, que se post-inserta en el liposoma. Se caracterizó el ED-lip en cuanto a tamaño, potencial zeta, eficiencia de encapsulación de doxorrubicina, perfil de liberación y citotoxicidad. Posteriormente, se evaluó si el ED-lip mejoraba la captación celular in vitro y la entrega de DOX al tumor mediante direccionamiento activo en ratones con tumores de carcinoma de colon C26.

Resultados y Discusión

Conjugación de DSPE-mPEG₂₀₀₀ al Aptámero

Se utilizó química de acoplamiento EDC/NHS para conjugar aptámeros anti-EpCAM funcionalizados con amina al grupo carboxilo activado de DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH. La ventaja de esta reacción es la estabilidad del enlace amida formado y la reducción de interacciones inespecíficas entre aptámeros. Los aptámeros pueden modificarse con grupos amino o tiol para conjugación covalente a grupos carboxilo activados o grupos maleímida, respectivamente. Una limitación importante de la química maleímida-tiol es que los grupos tiol de los aptámeros pueden oxidarse durante el almacenamiento, formando enlaces disulfuro (S-S) entre dos aptámeros modificados con tiol. Estos aptámeros diméricos no participan en la reacción de conjugación con el grupo maleímida del DSPE-PEG₂₀₀₀. Por tanto, el uso de reacciones EDC/NHS aumenta el rendimiento del producto y mejora el método de post-inserción.

Los aptámeros presentan ventajas sobre los anticuerpos: facilidad de síntesis y escalado, baja toxicidad sistémica y ausencia de inmunogenicidad. Tras la conjugación del aptámero al lípido, se empleó el método de post-inserción para obtener Caelyx® decorado con aptámero anti-EpCAM (ED-lip). La técnica de post-inserción es un método simple y efectivo para unir aptámeros a la superficie de liposomas, proporcionando una alta tasa de incorporación.

Se utilizó electroforesis en gel de agarosa para evaluar la post-inserción del aptámero anti-EpCAM en el liposoma. Los aptámeros cargados negativamente migraron en el gel y se observaron sus bandas, mientras que no se observó banda correspondiente para la formulación ED-lip, ya que esta quedó retenida en el pozo y no pudo migrar. Estos resultados indicaron que las micelas conjugadas con aptámero se post-insertaron exitosamente en la superficie de los liposomas.

Caracterización Fisicoquímica del ED-lip

La caracterización fisicoquímica de Caelyx® y ED-lip se muestra en la Tabla 1. La modificación de Caelyx® con aptámero anti-EpCAM no tuvo efecto significativo en el tamaño de partícula (p > 0,05). El tamaño liposomal antes de la inserción del aptámero (Caelyx®) fue de ~96 nm con PDI de 0,11; tras la post-inserción (ED-lip), el tamaño aumentó parcialmente a 117 nm con PDI de 0,14, manteniendo un tamaño deseable para administración tumoral. Estudios previos también indican que la incorporación de ligandos de direccionamiento aumenta el tamaño y el PDI de los liposomas. El potencial zeta del ED-lip (−19,25 mV) se volvió más negativo que el de Caelyx® (−12 mV), consistente con la conjugación de aptámeros de ARN que disminuyen el potencial zeta. El aumento de tamaño y la mayor negatividad del potencial zeta evidencian la post-inserción exitosa de aptámeros conjugados en la superficie liposomal. Estos resultados concuerdan con estudios previos que mostraron un ligero aumento de tamaño y potencial zeta más negativo en Caelyx® funcionalizado con aptámero. La eficacia de la post-inserción debería optimizarse en términos de tiempo y temperatura de incubación para lograr liposomas post-insertados más eficientes con mejor tamaño y PDI. La eficiencia de encapsulación de Caelyx® y ED-lip fue del 100%.

El número de aptámeros post-insertados por liposoma se determinó mediante ensayo de fosfato. El contenido total de fosfolípidos fue de 14 mM. Dado que el número promedio de moléculas de lípido en un liposoma de 100 nm es 8×10⁴, el número de liposomas por mililitro es ~10¹⁴. Basado en el ensayo de fosfato, el número de moléculas de aptámero por mililitro de solución es 10¹⁵.

Perfil de Liberación de DOX

La inserción de micelas conjugadas con aptámero en la superficie externa de Caelyx® podría afectar el perfil de liberación de DOX. Se evaluó la liberación de DOX desde ED-lip frente a Caelyx® en dextrosa al 5% con 50% suero fetal bovino (FBS), medio que simula el comportamiento de liberación en plasma. No se observó diferencia significativa en la liberación de DOX entre ambas formulaciones durante 24 h, liberándose solo cantidades despreciables. Esto concuerda con estudios previos que indican que la inserción de aptámero en la superficie del liposoma no afecta la estabilidad de la membrana ni el perfil de liberación de DOX, debido a la estabilidad de la formulación Caelyx® lograda mediante el método de carga remota impulsada por gradiente de pH.

Interacción Celular y Captación Celular por Microscopía de Fluorescencia

La interacción y captación celular de las formulaciones liposomales se evaluó a 4 °C y 37 °C. No hubo diferencias en las intensidades medias de fluorescencia (MFI) de células CHO-K1 tratadas con Caelyx® y ED-lip a ambas temperaturas. Sin embargo, el ED-lip dirigido mostró captación significativamente mayor en células C26 frente a Caelyx® a 4 °C y 37 °C (p < 0,0001 a 37 °C), indicando mayor especificidad de direccionamiento debido a la afinidad del aptámero anti-EpCAM por la línea C26. La DOX libre mostró la mayor captación y citotoxicidad al difundir libremente a través de la bicapa lipídica. En Caelyx®, la pegilación limita la endocitosis y reduce la citotoxicidad. La presencia del aptámero anti-EpCAM en la superficie del liposoma (ED-lip) aumenta la tasa de internalización y la citotoxicidad frente a Caelyx®. La microscopía de fluorescencia mostró que la diferencia en captación celular entre ED-lip y DOX libre en C26 a 37 °C no fue significativa, aunque ambos mostraron diferencias estadísticamente significativas frente a Caelyx® (p < 0,001). A pesar de que las células C26 expresan bajos niveles de EpCAM, el aptámero anti-EpCAM mejoró la tasa de internalización de los liposomas.

Estudio de Citotoxicidad

Los efectos citotóxicos de DOX libre, Caelyx® y ED-lip se evaluaron mediante ensayo MTT. Todas las formulaciones mostraron efectos dependientes del tiempo y la dosis. La viabilidad de células C26 tratadas con ED-lip disminuyó frente a las tratadas con Caelyx®. Las células CHO-K1 (negativas para EpCAM) mostraron menor respuesta al ED-lip comparadas con C26, confirmando la entrega específica mediada por el aptámero anti-EpCAM. Estos resultados subrayan la importancia de la administración dirigida con agentes de direccionamiento específicos para la entrega selectiva de fármacos a células diana, reduciendo efectos secundarios por acción off-target. Estudios previos reportaron que el direccionamiento activo de Caelyx® con ligandos específicos como aptámeros y anticuerpos aumenta el direccionamiento tumoral activo y la entrega específica, mejorando la eficacia terapéutica de la DOX.

Biodistribución y Farmacocinética

Para evaluar cómo el aptámero anti-EpCAM afecta la biodistribución de DOX, se inyectaron 10 mg/kg de ED-lip y Caelyx® en ratones con tumores subcutáneos de carcinoma de colon C26. La concentración plasmática de DOX a 3, 12, 24, 48 y 72 h post-inyección fue similar en ambos grupos, sin diferencias significativas. La conjugación del aptámero disminuyó ligeramente la semivida de circulación de 39,3 h a 34,2 h y el tiempo medio de residencia (MRT) de 47,6 h a 42,9 h. Los parámetros farmacocinéticos indican que la conjugación del aptámero acelera ligeramente el aclaramiento de los liposomas, consistente con reportes previos. La adsorción de proteínas y la eliminación por el sistema fagocítico mononuclear (MPS) podrían explicar esta aceleración.

La biodistribución en órganos principales mostró que la acumulación de ED-lip en hígado, pulmón y bazo fue significativamente mayor que Caelyx® a las 3 h, posiblemente por la presencia de vasos sanguíneos permeables y el aumento de tamaño y PDI del ED-lip tras la post-inserción. Se ha mostrado que el aumento del tamaño de nanopartículas a 150 nm incrementa su acumulación en hígado, pulmón y bazo. Ambos ED-lip y Caelyx® se acumularon gradualmente en el tumor, alcanzando un máximo alrededor de 12 h, manteniéndose hasta 24 h y disminuyendo a 48 y 72 h. En todos los puntos temporales, la acumulación de ED-lip en el tumor fue significativamente mayor que Caelyx®, atribuible a la eficacia del direccionamiento activo con aptámero anti-EpCAM. La conjugación del aptámero no afectó la distribución de DOX en riñón. Los aptámeros anti-EpCAM promueven eficazmente la penetración tumoral específica de los liposomas, posiblemente debido a la sobreexpresión de EpCAM en células endoteliales vasculares tumorales. Estudios previos indicaron que aptámeros anti-EpCAM mejoran la penetración tumoral en xenoinjertos. Las CSC/TIC también son dianas de la terapia anti-EpCAM; la administración de aptámeros anti-EpCAM como ligandos de direccionamiento mostró efectos prometedores en el direccionamiento de CSC. Parte del efecto antitumoral eficiente del ED-lip podría deberse al direccionamiento exitoso de CSC.

Actividad Antitumorales In Vivo

La eficacia terapéutica del ED-lip se evaluó en modelo de carcinoma de colon C26. Se monitorizaron tamaño tumoral, peso corporal y supervivencia durante casi 2 meses. El ED-lip no influyó significativamente en el peso corporal de los ratones, al igual que Caelyx®. Tras la inyección intravenosa única, el crecimiento tumoral se inhibió eficientemente hasta el día 30 post-inyección en ambos grupos liposomales, sin diferencias significativas entre ellos. Después del día 30, la tasa de crecimiento tumoral se aceleró, pero permaneció más lenta que en el grupo control (PBS). La supervivencia, representada en curva de Kaplan-Meier, mostró que el ED-lip mejoró la supervivencia frente a PBS o Caelyx®. En el grupo ED-lip, tres ratones mostraron curación completa, por lo que la supervivencia media (MST) es indefinida. El tratamiento con ED-lip aumentó el tiempo para alcanzar el punto final (TTE) de 41,1 a 49,7 días y resultó en una actividad antitumoral efectiva con 90,27% de retraso en el crecimiento tumoral (TGD%) y MST indefinida por la remoción completa del tumor en tres ratones.

Los datos de tamaño tumoral demostraron que el ED-lip inhibe drásticamente el crecimiento tumoral. El análisis de supervivencia mostró que el tratamiento con ED-lip aumentó MST y TTE. El grupo ED-lip tuvo mayor TGD% y fue más efectivo que Caelyx®. Estos hallazgos concuerdan con la alta concentración de DOX en tejido tumoral del grupo tratado con ED-lip. Por tanto, la DOX liposomal conjugada con aptámero mejora su penetración y acumulación en el sitio tumoral, aumentando la eficacia de Caelyx® y el TGD% en datos de supervivencia. En conjunto, estos hallazgos indican que los aptámeros anti-EpCAM pueden servir como agentes de direccionamiento importantes para la administración de fármacos.

Conclusiones

Se funcionalizó la superficie de Caelyx® con aptámero anti-EpCAM (SYL3C) mediante post-inserción (ED-lip). La citometría de flujo y microscopía de fluorescencia mostraron alta captación de DOX en células C26, indicando que el aptámero aumenta la tasa de internalización del ED-lip. Los datos farmacocinéticos indicaron que la post-inserción de DSPE-mPEG-EpCAM no alteró la farmacocinética de la DOX frente a Caelyx®. Sin embargo, la biodistribución tisular mostró mayor acumulación tumoral de ED-lip frente a Caelyx® incluso a 72 h post-inyección. Se demostró que el ED-lip tiene efectos terapéuticos mejorados en ratones con tumores C26. Los parámetros de supervivencia mejorados en ratones tratados con ED-lip sugieren que el liposoma de DOX dirigido a EpCAM es un portador de administración de fármacos prometedor para el tratamiento del cáncer y merece mayor investigación.

Materiales y Métodos

Materiales

El aptámero de ADN anti-EpCAM 5′-Amina (secuencia 5′-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3′) (SYL3C) se adquirió de BIONEER (Daejeon, Corea del Sur). DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH se adquirió de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Dowex®, EDC, NHS, penicilina estreptomicina y Fluoroshield™ con DAPI se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Caelyx® comercial se adquirió de Behestan Darou Company (Teherán, Irán).

Conjugación de DSPE-mPEG₂₀₀₀ al Aptámero

El aptámero anti-EpCAM se unió a DSPE-mPEG₂₀₀₀ mediante enlace covalente de los grupos amino primarios (-NH2) del aptámero al grupo carboxilo (–COOH) de DSPE-mPEG₂₀₀₀. La conjugación se realizó mediante química de acoplamiento EDC/NHS. Brevemente, DSPE-mPEG₂₀₀₀ se dispersó en tampón MES (pH 6,5) y se añadieron EDC/NHS (400 mM EDC y 100 mM NHS). La dispersión se agitó 15 min para activar los grupos carboxilo del lípido. Luego se añadió el aptámero anti-EpCAM y se agitó 2 h a temperatura ambiente en oscuridad. La relación molar lípido:aptámero fue 1:1 y la relación EDC/NHS fue 10 veces la del lípido.

Modificación de Caelyx® con DSPE-mPEG-Aptámero Anti-EpCAM

El ED-lip se sintetizó mediante post-inserción. Se añadieron micelas de DSPE-mPEG-aptámero anti-EpCAM a 1 ml de Caelyx® durante 30 min a 60 °C. Las cantidades de DSPE-mPEG-aptámero se determinaron según el ensayo de fosfato de Bartlett. Basado en el número aproximado de liposomas por mililitro de Caelyx® (~10¹⁴), el volumen de DSPE-mPEG-aptámero se ajustó para alcanzar ~10 aptámeros por liposoma. La electroforesis en gel de agarosa confirmó la post-inserción.

Caracterización Fisicoquímica

El tamaño de partícula, índice de polidispersidad (PDI) y carga superficial se determinaron por dispersión dinámica de luz (DLS) (Nano-ZS; Malvern, Reino Unido). Para eliminar DOX libre, los liposomas se mezclaron con resina Dowex® y rotaron 60 min, luego se pasó por columnas Poly-Prep (Bio-Rad) para remover la resina. La cantidad de DOX en formulaciones liposomales se determinó por espectrofotometría de fluorescencia (LS-45, Perkin-Elmer, Reino Unido), excitación:emisión 485:590 nm.

Estudio de Liberación

Para evaluar la liberación de DOX, 1 ml de formulación se añadió a 9 ml de dextrosa (con 50% FBS) y en intervalos de tiempo (0, 1, 2, 4, 6, 12, 24 h) se tomaron muestras. Tras eliminar DOX libre con resina Dowex®, la cantidad de fármaco retenido en los liposomas se determinó por espectrofotometría de fluorescencia y se calculó el porcentaje de liberación.

Cultivo Celular

Las líneas celulares de carcinoma de colon C26 y ovario de hámster chino (CHO-K1) se adquirieron del Instituto Pasteur de Irán. Se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con 10% FBS (Gibco, Thermos Fisher Scientific, USA), 100 UI/ml penicilina y 100 mg/ml estreptomicina. Las células se incubaron a 37 °C con 5% CO₂ y 95% humedad.

Ensayo de Interacción Celular y Captación Celular

La interacción y captación celular se evaluó a 4 °C y 37 °C respectivamente. Se usaron líneas CHO-K1 y C26. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos (2,5×10⁵ por pocillo). Tras incubación nocturna a 37 °C, se añadieron los tratamientos y las placas se incubaron a 4 °C y 37 °C por 3 h adicionales. Luego se lavaron con PBS, tripsinizaron y la intensidad de fluorescencia de DOX se determinó por citometría de flujo (BD FACSCalibur). Los datos se analizaron con FlowJo v7.0.

Evaluación por Microscopía de Fluorescencia

Se sembraron 1×10⁶ células C26 por pocillo en placas de 6 pocillos con cubreobjetos estériles. Tras incubación nocturna a 37 °C y 5% humedad, las células se trataron con DOX libre, Caelyx® y ED-lip por 24 h para captación completa. Luego se lavaron con PBS, fijaron con formaldehído al 4% y tiñeron con Fluoroshield™ con DAPI. Los tratamientos se realizaron por triplicado. De cada portaobjetos, se seleccionaron seis zonas bajo aumento ×200. La fluorescencia intrínseca de DOX se usó para evaluar la captación celular. La cuantificación se basó en porcentajes de células con captación de DOX en cada campo microscópico: 1: 0–20%, 2: 20–40%, 3: 40–60%, 4: 60–80%, 5: 80–100%.

Evaluación de Citotoxicidad

Los valores IC50 de DOX libre, Caelyx® y ED-lip se determinaron por ensayo MTT. Células CHO-K1 y C26 se sembraron a 5×10³ células/pocillo en placas de 96 pocillos a 37 °C. Tras incubación nocturna, las formulaciones liposomales y solución de DOX libre se diluyeron en serie en medio sin FBS y se añadieron a los cultivos, incubando 1, 3 y 6 h a 37 °C. Luego se lavaron las células e incubaron 72 h. Las densidades ópticas (DO) se midieron a 570 nm contra fondo de 630 nm en lector de microplacas Stat-Fax 2100. Los valores IC50 se calcularon.

Estudio en Animales

Ratonas BALB/c (4–6 semanas, 18–20 g) se mantuvieron en jaulas separadas a 22±2 °C con dieta y agua ad libitum. La anestesia se realizó con inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina y xilacina (100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina). Se inyectaron 3×10⁵ células C26 por ratón en 60 μl PBS en flanco derecho, subcutáneamente. Dos semanas después, cuando los tumores alcanzaron ~5 mm³, los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos (n=3 para biodistribución y n=5 para estudio antitumoral por grupo). Todos los protocolos fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad de Ciencias Médicas de Mashhad y se realizaron según normas internacionales de derechos animales.

Estudios de Biodistribución y Farmacocinética

Catorce días tras la inoculación tumoral, los ratones recibieron 10 mg/kg de Caelyx® y ED-lip por vía intravenosa (i.v.) en vena cola. El grupo control recibió 200 μl PBS. En intervalos (3, 12, 24, 48, 72 h) post-inyección, los ratones fueron eutanasia y se recolectaron muestras de sangre y tejidos (hígado, bazo, riñón, pulmón, corazón, tumor). La concentración de doxorrubicina en cada muestra se midió por intensidad de fluorescencia usando espectrofotómetro LS-45 (Perkin-Elmer, Reino Unido). Los parámetros farmacocinéticos (AUC, AUMC, t_1/2, V_d, C_max, T_max, MRT, Cl) se calcularon mediante análisis no compartimental de perfiles concentración-tiempo en sangre.

Actividad Antitumorales In Vivo

Para evaluar la actividad antitumoral, 10 días tras la inoculación, ratones con tumores palpables recibieron dosis única i.v. de 10 mg/kg de Caelyx® y ED-lip. Se inyectó PBS en ratones control. Se determinaron: tiempo para alcanzar el punto final (TTE), porcentaje de retraso en crecimiento tumoral (TGD%), tiempo medio de supervivencia (MST) y supervivencia. Durante el estudio, se observó salud y cambios de peso corporal. El volumen tumoral se midió con calibrador digital y se calculó: Volumen Tumor = (Alto × Largo × Ancho) × 0,52. Por aspectos éticos, los ratones fueron sacrificados si el tumor >1000 mm³, pérdida de peso >20% o signos de debilidad.

Análisis Estadístico

Los datos se analizaron con GraphPad Prism 6.0. Se presentaron como media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. La prueba t se usó para evaluar liberación, citometría de flujo y biodistribución. ANOVA se empleó para microscopía de fluorescencia y volúmenes tumorales. El método Kaplan-Meier calculó parámetros de supervivencia (TTE, MST, TGD%). p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.