Nanopartículas de sílice mesoporosa co-entregan inhibidor NQO1 y 5-fluorouracilo, potenciando actividad antitumoral en carcinoma escamoso de cabeza y cuello

Resumen

Los carcinomas escamosos de cabeza y cuello (CECC) son una de las formas más mortales de cáncer, y el 90% de su origen proviene de células escamosas. La NAD(P)H:quinona oxidorreductasa 1 (NQO1), una enzima sobreexpresada en carcinoma escamoso, juega un papel importante en la proliferación y quimiorresistencia. Los objetivos principales fueron estudiar el efecto inhibitorio de β-lapachona (ARQ761 en forma clínica) en CECC y el efecto combinado de 5-FU y β-lap en la mejora de la eficacia terapéutica en CECC. Se prepararon nanopartículas de sílice mesoporosa con bicapa lipídica cargadas con 5-FU/β-lap y se estudiaron sus propiedades fisicoquímicas y biológicas. La β-lap mostró una inhibición dependiente de la concentración de la actividad enzimática NQO1 en células Cal33. Destacablemente, se observó un efecto inhibitorio significativo a dosis de 20–50 μg/ml de β-lap. La combinación 5-FU+β-lap resultó en menor viabilidad celular; más notablemente, las nanopartículas de sílice mesoporosa cargadas con 5-FU/β-lap (FNQ-MSN) exhibieron viabilidad celular significativamente menor comparada con cualquiera de los fármacos individuales o combinaciones físicas. La β-lap resultó en disminución de la banda proteica de NQO1 comparada con control; sin embargo, la disminución más notable en el nivel de NQO1 se observó en el grupo celular tratado con FNQ-MSN. FNQ-MSN resultó en más del 60% de apoptosis celular (temprana y tardía) y fragmentación nuclear predominante de células cancerosas indicando el efecto anticancerígeno superior de un régimen combinado basado en transportador. Se observó disminución notable en volumen tumoral con mezcla física de 5-FU+β-lap; sin embargo, el tratamiento combinado de 5-FU y β-lap basados en transportador (FNQ-MSN) retrasó significativamente el crecimiento tumoral y prolongó la supervivencia de ratones xenotrasplantados portadores de tumor. Estos hallazgos sugieren el potencial del inhibidor NQO1 en potenciar el potencial quimioterapéutico de 5-FU en el tratamiento de CECC.

Introducción

Los carcinomas escamosos de cabeza y cuello (CECC) son una de las formas más mortales de cáncer y el 90% de su origen proviene de células escamosas [1]. Los CECC son altamente angiogénicos y su vasculatura expresa diversas citocinas incluyendo factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) vinculados con mayor metástasis y supervivencia pobre [2]. La incidencia de CECC en China es sexta en muertes relacionadas con cáncer con aproximadamente 250.000 nuevos casos registrados en 2015 y 77.500 casos de muerte. La tasa global de supervivencia a 5 años de CECC es muy baja debido a factores incluyendo naturaleza agresiva, recaída temprana, alta metástasis y alta mortalidad por pronóstico pobre [3]. La opción principal de tratamiento en CECC es procedimiento quirúrgico seguido de radioterapia o quimioterapia. Específicamente, la quimioterapia si se usa eficazmente en etapas tempranas o post-quirúrgicas contrarrestaría el crecimiento tumoral [4, 5]. El uso eficaz de quimioterapia erradicaría células cancerosas dentro de tejidos tumorales e inhibiría la recaída tumoral. Sin embargo, la quimioterapia a largo plazo basada en agente único a menudo resulta en resistencia a fármacos y eficacia terapéutica reducida [6]. Por tanto, es necesario emplear estrategias innovadoras para mejorar la supervivencia y calidad de vida de pacientes con CECC.

Varios agentes anticancerígenos usados en tratamiento de CECC incluyen cisplatino, 5-fluorouracilo (5-FU), paclitaxel o docetaxel. Entre todos, el 5-fluorouracilo (5-FU) se emplea como terapia de primera línea en CECC y otros tratamientos de carcinoma escamoso [7]. El 5-FU es un análogo de pirimidina que actúa inhibiendo irreversiblemente la timidilato sintasa dentro de células cancerosas y suprime la replicación de ADN resultando en muerte celular [8]. Como todos los fármacos anticancerígenos, el 5-FU no está exento de efectos adversos en circulación sistémica y causa toxicidad en tejidos normales, mientras se reporta que la combinación de 5-FU con un agente secundario podría potencialmente reducir efectos secundarios y mejorar la eficacia terapéutica global en tratamiento de cáncer [9].

La NAD(P)H:quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) es una flavoproteína elevada en tejidos tumorales en rango 100-200 veces comparada con tejidos normales [10]. La oxidorreductasa de dos electrones es una enzima detoxificante de fase II inducible capaz de detoxificar quinonas formando hidroquinonas estables [11]. Se muestra que NQO1 se expresa en nivel basal bajo en tejidos humanos normales donde protege células contra ciclado redox y estrés oxidativo y estabiliza el supresor p53. NQO1 está constitutivamente sobreexpresada en varios cánceres incluyendo mama, páncreas y carcinomas escamosos [12]. La sobreexpresión de NQO1 promueve la progresión de carga cancerosa y hace células cancerosas más resistentes a fármacos quimioterapéuticos como 5-FU o cisplatino (inductores de estrés oxidativo) haciendo de NQO1 un oncobjetivo potencial para mejorar eficacia terapéutica [13]. Se ha reportado que la reducción de NQO1 por siRNA potenció el efecto citotóxico de múltiples fármacos como gemcitabina o doxorrubicina [14]. Además, se reportan varios inhibidores sintéticos y naturales de NQO1 como cumarinas, curcuminas o ES936 [15,16,17]. En este estudio, se empleó β-lapachona (β-lap, 3,4-Dihidro-2,2-dimetil-2H-nafto[1,2-b]piran-5,6-diona) como inhibidor NQO1 [18]. La β-lap actúa mediante mecanismo dependiente de NQO1 y crea cantidad significativa de especies reactivas de oxígeno (ROS) que llevan a daño de cadenas de ADN y causan muerte de células cancerosas [19].

El empleo de nanopartículas para administración sistémica de moléculas pequeñas se vuelve enfoque prometedor en tratamiento de cáncer [20]. Las nanopartículas cargadas con fármacos requieren menos dosificación y han mostrado mejorar eficacia anticancerígena y reducir relativamente efectos adversos. Entre todos transportadores, la nanopartícula de sílice mesoporosa (NSM) tiene potencial significativo para entregar eficazmente la carga a tejidos tumorales [21, 22]. Los poros de tamaño micrométrico permiten carga estable de fármacos y previenen su liberación en circulación sistémica y permiten acumulación preferencial en tejidos cancerosos permeables usando efecto de permeación y retención incrementada (EPR) [23].

En general, el objetivo principal del presente estudio fue combinar beneficios terapéuticos de 5-FU e inhibidor NQO1 para potenciar efecto anticancerígeno en CECC. El efecto anticancerígeno in vitro se analizó usando diversas técnicas como viabilidad celular, análisis western blot, citometría de flujo/ensayo apoptosis basado en Hoechst, y ensayo live/dead. Estudios in vivo se realizaron en modelo xenotrasplantado con células tumorales Cal33.

Conclusión

En resumen, formulamos exitosamente nanopartículas de sílice mesoporosa recubiertas con bicapa lipídica cargadas con 5-FU+β-lap. Mostramos que (i) efecto antitumoral de β-lap de manera dependiente de concentración en células tumorales CECC, (ii) combinación 5-FU+β-lap resulta en inhibición significativa de proteína NQO1 y proteína Bcl-2, (iii) FNQ-MSN basado en combinación demostró reducción significativa de carga tumoral en xenotrasplante CECC. Estos datos apuntan inequívocamente a que dosis subletales de inhibidor NQO1 (β-lap) podrían potencialmente potenciar la eficacia terapéutica de 5-FU en tumores CECC y potencialmente extenderse al tratamiento clínico de otras malignidades.

Materiales y Métodos

Preparación de Nanopartículas de Sílice Mesoporosa con Bicapa Lipídica Cargadas con 5-FU/β-lap

La NSM cargada con fármaco se preparó disolviendo bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (210 mg) en 180 ml de agua y calentando a 80 °C, seguido por adición de 5-FU y β-lap al 20% p/p del total de nanopartículas y luego fluoruro de amonio (NH4F) (30 mg) se añadió y agitó bien por 60 min. Luego, 1,6 ml de ortosilicato de tetraetilo (TEOS) se añadió gota a gota por 30 min y se agitó continuamente por 3 h. Coloides blancos semitransparentes se formaron y se recogieron tras centrifugar (15 min) a 10000 rpm a 24 ± 1 °C. Las NSM se resuspendieron en agua ultrapura, y el ciclo de centrifugación se repitió 2 veces. Separadamente, una membrana de película fina se preparó usando DSPE-PEG2000 (2% del peso total NSM) e hidrató con agua suspendida con NSM cargada de fármaco. La mezcla se sonificó inmediatamente con sonda por 5 min a 50 W a temperatura ambiente (25 °C). La NSM con bicapa lipídica PEGilada se lavó finalmente dos veces y resuspendió en agua ultrapura.

Análisis de Tamaño de Partícula, Potencial Zeta y Morfología

El diámetro de partícula, índice de polidispersidad (PDI) y potencial zeta se evaluaron usando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). Las partículas se analizaron mediante mecanismo de dispersión dinámica de luz (DLS) y las dispersiones de partículas se diluyeron bien antes del experimento. Todos los experimentos se realizaron en triplicado a temperatura ambiente. La morfología de nanopartículas se determinó por microscopía electrónica de transmisión (TEM) usando CM 200 UT, Philips, MA, USA) operado a 100 kV. Brevemente, dispersiones de partículas se diluyeron, una gota se colocó en rejilla TEM 300-mesh y se dejó sedimentar 10 min. Las partículas se contra-tiñeron con 2% ácido fosfotúngstico (PTA) como tinción negativa, se secaron al aire y observaron bajo microscopio TEM.

Carga de Fármaco

El análisis de carga de fármaco de dos vías se realizó calculando el fármaco no cargado o libre en el sobrenadante y el fármaco cargado en la nanopartícula. La eficiencia de carga de fármaco se realizó por método HPLC. El HPLC equipado con bomba Shimadzu LC-20 AD PLC y detector SPD-M20A PDA y software de análisis Shimadzu LC conteniendo columna de fase reversa C18 (Phenomenex C18, 150 4,6 mm, 5 μm). La fase móvil para 5-FU consiste en mezcla de acetonitrilo y agua (10:90, v/v) bombeada a 1 ml/min. La longitud de onda de detección fijada a 265 nm para 5-FU. La fase móvil para β-lap consistiendo en acetonitrilo/agua (31:69, v/v) y longitud de onda de detección fijada a 254 nm a 35 °C. La capacidad de carga (LC) y eficiencia de carga (LE) de 5-FU/β-lap se calcularon usando las fórmulas respectivas.

Estudio de Liberación de Fármaco

La liberación de 5-FU y β-lap se evaluó en PBS (pH 7,4) y ABS (pH 5,0) a 37 °C usando método de diálisis. Brevemente, 1 mg equivalente de cada nanopartícula cargada con fármaco se cargó en membrana de diálisis en 1 ml de tampón respectivo y extremos sellados. La membrana de diálisis sellada se colocó en 25 ml de ABS y PBS respectivos y se colocó en baño de agua con agitación a 37 °C. Las muestras se recogieron en intervalos de tiempo predeterminados y se reemplazaron con igual volumen de tampón fresco. La cantidad de fármaco liberado en el tampón respectivo se evaluó por método HPLC como se describió en la sección anterior.

Cultivo Celular y Ensayo de Actividad NAD(P)H:Quinona Oxidorreductasa 1 (NQO1)

La célula CECC Cal33 se cultivó en medio Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) suplementado con 10% SFB y 1% mezcla antibiótica. Las células se mantuvieron en condiciones ambientales en incubadora. Para ensayo actividad NQO1, células Cal33 se sembraron en placa 96-pocillos a densidad de siembra 8 × 10³ células por pocillo e incubaron overnight. Las células se trataron con diferentes concentraciones de β-lap e incubaron 24 h. 0,8% digitonina (50 μl de 2 nM EDTA) se usó para lisar células y el ensayo se realizó usando menadiona y MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) como reacción de acoplamiento sustrato y actividad medida a 620 nm. El ensayo se realizó en triplicado.

Ensayo de Viabilidad Celular In Vitro

Ensayo viabilidad celular de β-lap en concentración creciente y ensayo viabilidad celular de régimen individual y combinacional se probaron por ensayo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS). Brevemente, células Cal33 se sembraron en placa 96-pocillos a densidad 1 × 10⁴ células por pocillo e incubaron overnight. Al día siguiente, células se trataron con concentración creciente de β-lap, separadamente; células se trataron con régimen individual y combinacional de 5-FU y β-lap a concentración base 5, 10 y 20 μg/ml e incubaron 24 h. Las células se lavaron dos veces y trataron con solución MTS según directrices del fabricante. La viabilidad celular se calculó respecto a células no tratadas, y lector de microplacas se usó para absorbancia a 460 nm.

Análisis Western Blot

Las células sembradas en placa 6-pocillos se trataron con concentración creciente de β-lap, separadamente; células se trataron con régimen individual (5-FU o β-lap) y combinacional de 5-FU y β-lap (FNQ-MSN) e incubaron 24 h. Las células se cosecharon, lisaron (buffer M-per), centrifugaron, y el sobrenadante conteniendo proteína se recogió. La concentración proteica en lisado celular se evaluó usando método ácido bicinconínico (BCA). Gel de poliacrilamida Bis-Tris 10% se usó para separar proteínas e inmediatamente transfirió a membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se bloqueó usando 5% leche descremada preparada en buffer Tris-salino (TBS) conteniendo Tween 20 (TBST, pH 7,2). Anticuerpos primarios policlonales de conejo NQO1 (1:1000), monoclonales de ratón Bcl-2 (1:1000) y monoclonales de ratón GAPDH (1:1000) se incubaron en membrana overnight a 4 °C. La membrana se lavó con TBST e incubó con anticuerpos secundarios (anti-ratón o anti-conejo IgG) a dilución 1:10000. La membrana se lavó nuevamente con TBST y las bandas se expusieron a sustrato ECL y densidades de bandas proteicas evaluadas usando fotodesarrollador.

Apoptosis y Ensayo Hoechst

Células Cal33 se sembraron en placa 6-pocillos a densidad 2 × 10⁵ células por pocillo e incubaron overnight. Las células se trataron con régimen individual (5-FU o β-lap) y combinacional de 5-FU y β-lap (FNQ-MSN) e incubaron 24 h. Las células se cosecharon, lavaron, centrifugaron y pelletizaron. Las células se trataron con 2,5 μl anexina V y 2,5 μl PI e incubaron 15 min en oscuridad. Las células se completaron a 1 ml y evaluaron usando citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS, BD, FACSverse). Total 10.000 células analizadas. Procedimiento similar para siembra celular y tratamiento fármaco seguido y luego tiñeron con tinte Hoechst 33342 (10 μg/ml) e incubaron 10 min. Las células se lavaron y fijaron con 4% paraformaldehído (PFA) y lavaron de nuevo. La morfología celular se observó bajo microscopio de fluorescencia (Nikon A1, Japón).

Eficacia Antitumoral de FNQ-MSN en Modelo Xenotrasplantado de Tumor CECC

Ratones BALB/c machos de 18-22 g promediando 4-5 semanas se obtuvieron del Centro de Instalaciones Animales In-House de Universidad de Industria Ligera de Zhengzhou, Henan. Los animales se mantuvieron en habitación climatizada con ciclo 12 h oscuro-luz y acceso libre a comida y agua. Todos los protocolos animales fueron aprobados por Comité de Ética de Universidad de Industria Ligera de Zhengzhou, Henan. Para establecer modelo xenotrasplantado, 1 × 10⁷ células Cal33 en 150 μl medio cultivo se inocularon en cadera derecha del ratón subcutáneamente. Cuando tamaño promedio tumoral alcanza 80-100 mm³, ratones se dividieron aleatoriamente en 5 grupos para control, 5-FU, β-lap, 5-FU+β-lap y FNQ-MSN, respectivamente con 8 ratones cada grupo. El 5-FU se administró a dosis fija 5 mg/kg y β-lap a dosis fija 25 mg/kg y administró 3 veces con intervalo 3 días para cada inyección vena cola. Peso ratón y volumen tumoral monitoreados regularmente por 18 días. Volumen tumoral calculado usando fórmula:

V (mm³) = Ancho² (mm²) × Largo (mm) / 2

El presente estudio no observó muerte ratón por carga células tumorales y todos animales eutanasia con CO₂ y luego sacrificados por dislocación cervical al final del estudio.

Análisis Estadístico

Múltiples grupos comparados usando análisis varianza bidireccional (ANOVA). Nivel significancia p < 0,05 considerado significativo y todos datos presentados como media ± desviación estándar a menos que se mencione específicamente en experimentos respectivos.

Resultados y Discusión

Preparación de Nanopartículas de Sílice Mesoporosa Soportadas por Bicapa Lipídica Cargadas con 5-FU/β-lap

En este estudio, personalizamos una nanopartícula de sílice mesoporosa estabilizada por bicapa lipídica PEGilada. La NSM cargada con 5-FU/β-lap se preparó por método emulsión-sonificación, y luego NSM cargada con fármaco se introdujo en matraz conteniendo película lipídica fina consistente en DSPE-PEG2000. La mezcla se sonificó y se obtuvo NSM recubierta lipídica conteniendo 5-FU/β-lap (FNQ-MSN) (Fig. 1a). Eficiencias de carga (LE) de 5-FU y β-lap fueron 91,5 ± 1,65% y 92,9 ± 1,24%, respectivamente. FNQ-MSN exhibió 8,1 ± 1,12% p/p de 5-FU y 7,6 ± 0,95% p/p de β-lap indicando alta capacidad de carga (LC) de transportador NSM. La presencia de bicapa lipídica previene liberación no deseada en circulación sistémica y previene toxicidad. Tamaño partícula promedio NSM cargada fármaco fue 92,1 ± 0,85 nm (PDI ~ 0,089) mientras ensamblaje bicapa lipídica en superficie NSM (FNQ-MSN) aumentó tamaño partícula promedio a 128,4 ± 1,24 nm (PDI ~ 0,115) indicando presencia sólida materiales lipídicos en superficie NSM (Fig. 1b). Potencial zeta cambió de −18,2 ± 1,22 a −26,4 ± mV. Pequeño tamaño partícula FNQ-MSN permitirá acumulación preferencial transportador cargado fármaco en tejidos tumorales permeables por virtud efecto EPR. Además, PEGilación superficial conferirá excelente estabilidad y tiempo circulación sanguínea prolongado que aumentará oportunidades FNQ-MSN en tejidos tumorales. Imagen TEM mostró semejanza morfológica a liposoma y presentó forma esférica perfecta uniformemente extendida en rejilla. Imagen TEM mostró claramente capa exterior grisácea y núcleo más oscuro indicando presencia ensamblaje lipídico en superficie NSM (Fig. 1c). Tamaño observado TEM corrobora tamaño partícula DLS de zetasizer. NSM posee canales bien ordenados para distribución homogénea moléculas fármaco. Propiedad superficie poros es factor importante en carga estable moléculas pequeñas. Las diversas fuerzas físicas involucradas interacción huésped-huésped incluyen principalmente fuerzas hidrofóbicas y fuerzas interacción van der Waals. Mayor capacidad carga fármaco proporcionará mayor concentración intracelular y mayor eficiencia eliminación en sitios tumorales. FNQ-MSN exhibió excelente estabilidad en medio PBS y tamaño partícula permaneció inalterado durante período estudio hasta 30 días. Tal estabilidad mejorada sistema transportador y alta capacidad carga sistema transportador mejorará biodistribución y eficiencia en tratamiento tumoral.

Liberación In Vitro de Fármaco

La liberación in vitro de 5-FU y β-lap desde FNQ-MSN se estudió en PBS y ABS (Fig. 2). Como se muestra, dos tendencias liberación diferentes observadas en pH 7,4 y pH 5,0. Por ejemplo, 25% 5-FU liberado en 24 h en pH 7,4 comparado con ~40% liberación fármaco en pH 5,0 en 24 h. Similarmente, 20% y 30% β-lap liberado en pH 7,4 y pH 5,0 respectivamente. Cinética liberación idéntica durante período estudio con 50% 5-FU liberado en tampón alcalino y 80% liberación fármaco a pH 5,0 tras 72 h período estudio. Liberación fármaco sensible pH en condiciones ácidas es ventajosa para tratamiento cáncer. No se observó fenómeno liberación explosiva en ambas condiciones pH atribuido principalmente presencia capa DSPE-PEG que controló liberación fármaco desde FNQ-MSN durante período estudio. Diferencia significativa liberación fármaco observada entre pH 7,4 y pH 5,0. En condiciones pH 7,4, PEG-b-DSPE exhibe propiedad capa sigilosa alta previniendo liberación compuesto encapsulado. Resultado presente mostró liberación fármaco acelerada a pH 5,0, indicando desensamblaje capa protectora alrededor superficie NSM. Tasa liberación fármaco sensible pH, que asegura máxima liberación fármaco dentro células cancerosas, puede mejorar eficacia antitumoral y disminuir toxicidad no deseada tejidos normales. Es posible que en presencia elemento sensible pH, FNQ-MSN resulte en desprendimiento bicapa lipídica en NSM resultando liberación aumentada en condiciones pH bajo.

Sensibilidad NQO1 a β-lap

Como la regulación al alza NQO1 en muchas células cancerosas incluyendo CECC asociada con pronóstico pobre y resultado terapéutico pobre, fármacos dirigiendo NQO1 podrían ser estrategia potencial hacia tratamiento cáncer [24]. NQO1 sobreexpresada en nivel 100-200 veces en carcinoma escamoso comparado con tejidos normales. Por tanto, influencia β-lap en actividad enzimática NQO1 se estudió en células Cal33. Como se muestra, β-lap mostró inhibición dependiente concentración actividad enzimática NQO1 en células Cal33 (Fig. 3a). Notablemente, efecto inhibitorio significativo observado a dosis 20–50 μg/ml β-lap. Además, potencial inhibitorio β-lap en proteína NQO1 se estudió más por análisis western blot (Fig. 3b). Resultados revelaron claramente disminución significativa proteína NQO1 en células cancerosas con aumento concentración β-lap. Aproximadamente 80% inhibición NQO1 observada a 100 μg/ml β-lap. Fármaco bioactivable NQO1 como β-lap metabolizado por NQO1 forma compuesto hidroquinona inestable que inmediatamente convierte componente original dejando 2 oxidaciones un electrón y consume 2 O²⁻. Esto creará ciclo redox fútil en que 1 molécula β-lap generará 130 moles superóxido coste consumir 60-70 moles NAD(P)H6. Superóxido (O2.−) formado se convertirá peróxido hidrógeno (H2O2−) y causará apoptosis y muerte celular [25].

Efecto Anticancerígeno In Vitro FNQ-MSN en Células CECC

Efecto anticancerígeno in vitro β-lap en célula Cal33 se estudió por ensayo MTT. Resultados revelaron β-lap exhibió disminución típica dependiente concentración viabilidad celular (Fig. 4a). Notablemente, disminución significativa viabilidad celular observada a concentración 50 μg/ml. Para experimentos ulteriores, 20 μg/ml seleccionado (debajo valor IC50 β-lap). Luego, efecto potenciación β-lap en 5-FU se estudió a 3 concentraciones diferentes (5, 10 y 20 μg/ml). Como se muestra, combinación 5-FU+β-lap resultó menor viabilidad celular; más notablemente, FNQ-MSN exhibió viabilidad celular significativamente menor comparada con cualquiera fármaco individual o combinaciones físicas (Fig. 4b). Por ejemplo, 5-FU y β-lap mostraron viabilidad celular 35,7% y 70,2% mientras 5-FU+β-lap mostró 26,5% y FNQ-MSN mostró 13,1% respectivamente. Resultados mostraron claramente efecto citotóxico 5-FU aumentó significativamente combinado con β-lap. Cabe notar FNQ-MSN más efectivo comparado 5-FU+β-lap atribuido mejor internalización y liberación controlada terapéuticos cargados desde sistema transportador. Resultados revelan claramente efecto inhibitorio β-lap en actividad enzimática y niveles proteína NQO1 y potenció efecto anticancerígeno 5-FU resultando resultado terapéutico mejorado tratamiento CECC.

Papel FNQ-MSN en Vías Señalización: Análisis Western Blot

Mecanismo efecto citotóxico mediado β-lap explorado más por análisis western blot. Como se muestra, β-lap resultó disminución banda proteica NQO1 comparado control; sin embargo, disminución más notable nivel NQO1 observada grupo celular tratado FNQ-MSN (Fig. 4c). Mejora quimiosensibilidad Cal33 inducida β-lap mediante aumento apoptosis celular evaluada través nivel proteína Bcl-2. Familia Bcl-2 juega papel importante regulando homeostasis celular y controla proliferación y muerte células cancerosas. Proceso disminución Bcl-2 y aumento Bax resulta liberación citocromo C en citosol que iniciará cascada caspasa completa resultando muerte celular [26]. Resultados destacaron claramente combinación 5-FU y β-lap (FNQ-MSN) reguló significativamente a la baja Bcl-2 indicando efecto anticancerígeno mejorado en células cancerosas Cal33.

Análisis Apoptosis CECC

Tras análisis viabilidad celular, efecto apoptosis fármacos individual y combinado en células Cal33 evaluado por citometría flujo tras tinción anexina V/PI (Fig. 5). Efecto apoptosis 5-FU individual (10 μg/ml) o β-lap (30 μg/ml) no resultó apoptosis apreciable células cancerosas; sin embargo, 5-FU+β-lap resultó aumento dramático proporción apoptosis células cancerosas. Importante, FNQ-MSN resultó más 60% apoptosis celular (temprana y tardía) significando efecto terapéutico superior régimen combinado basado transportador. Efecto apoptosis confirmado además por tinción Hoechst 33342. Como se muestra, células tratadas FNQ-MSN resultan mayor cantidad células sufriendo apoptosis, condensación nuclear y características fragmentación comparado 5-FU o β-lap solos (Fig. 6). Durante proceso apoptosis, células se encogen sin daño membrana externa y resulta condensación cromatina con formación aumentada cuerpos apoptóticos.

Ensayo Live/Dead

Efecto anticancerígeno fármacos individual y combinado evaluado además por ensayo Live/Dead. Células tratadas sometidas tinción Calcein AM y bromuro etidio como marcadores respectivos células vivas y muertas (Fig. 7). Como se muestra, células no tratadas tiñeron 100% fluorescencia verde. Fármacos individuales, 5-FU (10 μg/ml) o β-lap (30 μg/ml) aunque mostraron leve fluorescencia roja células teñidas; sin embargo, células predominantes exhibieron fluorescencia verde indicando muerte celular limitada. Muerte celular notable observada células cancerosas tratadas FNQ-MSN mostrada por fluorescencia roja predominante y menos células teñidas fluorescencia verde. Mayor efecto anticancerígeno FNQ-MSN atribuido actividad sinérgica 5-FU y β-lap en células cancerosas y capacidad β-lap aumentar quimiosensibilidad 5-FU.

Eficacia Antitumoral In Vivo FNQ-MSN Contra Modelo Xenotrasplantado CECC

Para evaluar eficacia régimen combinacional en modelo animal, xenotrasplante CECC preparado y administró 5 mg/kg 5-FU y 10 mg/kg β-lap respectivamente. Grado farmacéutico β-lap es ARQ761 actualmente en ensayo clínico fase I para tratamiento malignidades metastásicas. β-lap estableció límite dosis máxima tolerable humanos según estudios preclínicos [27]. Teniendo esto en mente, seleccionamos óptimamente dosis 10 mg/kg β-lap para estudios in vivo. Como se muestra, no se observó disminución significativa volumen tumoral con 5-FU y β-lap administrados individualmente comparado control no tratado (Fig. 8a). Disminución notable volumen tumoral observada con mezcla física 5-FU+β-lap; sin embargo, tratamiento combinado 5-FU y β-lap basados transportador (FNQ-MSN) retrasó significativamente crecimiento tumoral y prolongó supervivencia ratones xenotrasplantados portadores tumor. Gráfico volumen tumoral FNQ-MSN dividió en dos partes; crecimiento insignificante volumen tumoral observado hasta día 9 mientras tumor aumentó significativamente tras día 9 hasta día 18, no obstante, volumen tumoral global manifold menor comparado control u otros grupos. Preocupación toxicidad régimen individual y combinacional evaluada en términos peso corporal (Fig. 8b). Como se muestra, mezcla física 5-FU+β-lap resultó toxicidad severa representada por más 10% pérdida peso corporal mientras 5-FU resultó 5% peso corporal. Como esperado, FNQ-MSN no resultó pérdida peso corporal indicando ventaja única sistema transportador basado lipido-NSM. Efecto antitumoral mejorado FNQ-MSN atribuido a efecto inhibitorio β-lap hacia enzima y proteína NQO1 que a su vez aumentó quimiosensibilidad 5-FU y resultó efecto anticancerígeno sinérgico tumores humanos Cal33, segundo, bicapa lipídica recubierta NSM protegió fármaco durante circulación sistémica y podría liberar manera controlada tejido tumoral, tercero, PEGilación nanotransportador podría prolongar tiempo circulación sanguínea permitiendo acumulación preferencial tejidos tumorales debido efecto EPR [28, 29]. NSM PEGiladas atrapadas principalmente RES hígado, bazo y pulmón, representando más 80% dosis administrada. Modificación PEG NSM disminuyó obviamente tasa aclaramiento NSM en órganos, demostrando NPs PEGiladas más difíciles remover órganos RES independientemente forma partícula [30, 31]. En general, estudio in vivo modelo CECC ofrece "prueba concepto" que combinación eficaz 5-FU+β-lap en nanotransportador estable podría mejorar eficacia terapéutica tumor aliviando efecto tóxico asociado.

Disponibilidad Datos y Materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están incluidos en este artículo publicado y sus archivos información suplementaria.

Abreviaturas

5-FU:

5-Fluorouracilo

EPR:

Efecto permeación y retención incrementada

FNQ-MSN:

Nanopartículas sílice mesoporosa cargadas 5-FU/β-lap

CECC:

Carcinomas escamosos cabeza y cuello

NSM:

Nanopartícula sílice mesoporosa

NQO1:

NAD(P)H:quinona oxidorreductasa 1

β-lap:

β-lapachona