Combinación basada en nanopartículas de sílice mesoporosa de inhibidor de NQO1 y 5-fluorouracilo para un efecto antitumoral potente contra el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)

Resumen

Los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) son una de las formas más mortales de cáncer y el 90% de su origen proviene de las células escamosas. NAD (P) H:quinona oxidorreductasa 1 (NQO1), una enzima sobreexpresada en el carcinoma de células escamosas, juega un papel importante en la proliferación y la quimiorresistencia. Los principales objetivos fueron estudiar el efecto inhibidor de ß-lapachone (ARQ761 en forma clínica) en HNSCC y estudiar el efecto combinatorio de 5-FU y ß-lap en la mejora de la eficacia terapéutica en HNSCC. Se prepararon nanopartículas de sílice mesoporosas ensambladas en bicapas lipídicas cargadas con 5-FU / ß-lap y se estudiaron sus propiedades fisicoquímicas y biológicas. ß-lap mostró una inhibición dependiente de la concentración de la actividad de la enzima NQO1 en las células Cal33. En particular, se observó un efecto inhibidor significativo a una dosis de 20 a 50 μg / ml de ß-lap. La combinación de 5-FU + ß-lap resultó en una menor viabilidad celular; más notablemente, las nanopartículas de sílice mesoporosas cargadas con 5-FU / ß-lap (FNQ-MSN) exhibieron una viabilidad celular significativamente menor en comparación con la de cualquiera de las combinaciones físicas o de fármaco individual. ß-lap resultó en una disminución en la banda de proteína de NQO1 en comparación con el control; sin embargo, la disminución más notable en el nivel de NQO1 se observó en el grupo de células tratadas con FNQ-MSN. FNQ-MSN resultó en más del 60% de apoptosis celular (apoptosis temprana y tardía) y fragmentación nuclear predominante de las células cancerosas, lo que indica el efecto anticanceroso superior de un régimen de combinación basado en portadores. Se observó una disminución notable en el volumen del tumor con la mezcla física de 5-FU + ß-lap; sin embargo, el tratamiento combinado de 5-FU y ß-lap (FNQ-MSN) basados en portadores retrasó significativamente el crecimiento del tumor y prolongó la supervivencia de los ratones con xenoinjerto que portaban tumores. Estos hallazgos sugieren el potencial del inhibidor de NQO1 para mejorar el potencial quimioterapéutico del 5-FU en el tratamiento de HNSCC.

Introducción

Los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) son una de las formas más mortales de cáncer y el 90% de su origen es de células escamosas [1]. El HNSCC es de naturaleza altamente angiogénica y su vasculatura expresa varias citocinas, incluidos factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que están relacionados con una mayor metástasis y una supervivencia deficiente [2]. La incidencia de HNSCC en China ocupa el sexto lugar entre las muertes relacionadas con el cáncer, con aproximadamente 250.000 nuevos casos registrados en 2015 y 77.500 casos de muerte. La tasa de supervivencia global a 5 años de HNSCC es muy baja debido a factores que incluyen naturaleza agresiva, recaída temprana, metástasis alta y alta tasa de mortalidad debido a un mal pronóstico [3]. La principal opción de tratamiento en el HNSCC es un procedimiento quirúrgico seguido de radioterapia o quimioterapia. Para ser específicos, la quimioterapia, si se usa eficazmente en las primeras etapas o en las etapas posquirúrgicas, contrarrestaría el crecimiento tumoral [4, 5]. El uso eficaz de la quimioterapia erradicará las células cancerosas dentro de los tejidos tumorales e inhibirá la recaída del tumor. Sin embargo, la quimioterapia a largo plazo basada en un solo agente a menudo da como resultado la resistencia al fármaco y una eficacia terapéutica reducida [6]. Por lo tanto, es necesario emplear estrategias innovadoras para mejorar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con HNSCC.

Varios agentes anticancerosos utilizados en el tratamiento de HNSCC incluyen cisplatino, 5-fluorouracilo (5-FU), paclitaxel o docetaxel. Entre todos, el 5-fluorouracilo (5-FU) se emplea como terapia de primera línea en el HNSCC y otros tratamientos del carcinoma de células escamosas [7]. El 5-FU es un análogo de pirimidina que actúa inhibiendo irreversiblemente la timidilato sintasa dentro de las células cancerosas y, por lo tanto, suprime la replicación del ADN dando como resultado la muerte celular [8]. Al igual que con todos los medicamentos contra el cáncer, el 5-FU no deja de tener efectos adversos en la circulación sistémica y causa toxicidad en los tejidos normales, mientras que se informa que la combinación de 5-FU con un agente secundario podría potencialmente reducir los efectos secundarios y mejorar la eficacia terapéutica global en el tratamiento del cáncer [9].

NAD (P) H:quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) es una flavoproteína que está elevada en los tejidos tumorales en un rango de 100 a 200 veces en comparación con la de los tejidos normales [10]. La oxidorreductasa de dos electrones es una enzima desintoxicante de fase II inducible capaz de desintoxicar quinonas mediante la formación de hidroquinonas estables [11]. Se ha demostrado que NQO1 se expresa en un nivel basal bajo en tejidos humanos normales donde protege a las células contra el ciclo redox y el estrés oxidativo y estabiliza el supresor de p53. NQO1 se sobreexpresa constitutivamente en varios cánceres, incluidos los carcinomas de mama, páncreas y de células escamosas [12]. La sobreexpresión de NQO1 promueve la progresión de la carga del cáncer y hace que las células cancerosas sean más resistentes a fármacos quimioterapéuticos como el 5-FU o cisplatino (inductores del estrés oxidativo), lo que convierte a NQO1 en un potencial oncotomejo para mejorar la eficacia terapéutica [13]. Se ha informado de que la eliminación de NQO1 por el ARNip aumentó el efecto citotóxico de múltiples fármacos como la gemcitabina o la doxorrubicina [14]. Además, se informan varios inhibidores de NQO1 sintéticos y naturales como cumarinas o curcuminas o ES936 [15,16,17]. En este estudio, hemos empleado ß-lapachone (ß-lap, 3,4-Dihidro-2,2-dimetil-2H-nafto [1,2-b] piran-5,6-diona) como inhibidor de NQO1 [ 18]. ß-lap actúa a través de un mecanismo dependiente de NQO1 y crea una cantidad significativa de especies reactivas de oxígeno (ROS) que dañarán las cadenas de ADN y causarán la muerte de las células cancerosas [19].

El empleo de nanopartículas para la administración sistémica de moléculas pequeñas se convierte en un enfoque prometedor en el tratamiento del cáncer [20]. Las nanopartículas cargadas de fármaco requieren un régimen de dosificación menor y se ha demostrado que mejoran la eficacia contra el cáncer y reducen relativamente los efectos adversos. Entre todos los portadores, la nanopartícula de sílice mesoporosa (MSN) tiene un potencial significativo para entregar eficazmente la carga útil a los tejidos tumorales [21, 22]. Los poros de tamaño micrométrico permiten la carga estable de los fármacos y previenen su liberación en la circulación sistémica y permiten la acumulación preferencial en los tejidos cancerosos con fugas mediante el efecto de permeación y retención mejoradas (EPR) [23].

En general, el objetivo principal del presente estudio fue combinar los beneficios terapéuticos del 5-FU y el inhibidor de NQO1 para mejorar el efecto anticancerígeno en HNSCC. El efecto anticanceroso in vitro se analizó utilizando varias técnicas como la viabilidad celular, el análisis de transferencia Western, el ensayo de apoptosis basado en citómetro de flujo / Hoechst y el ensayo de vivo / muerto. Se realizaron estudios in vivo en el modelo de xenoinjerto portador de células tumorales Cal33.

Conclusión

En resumen, hemos formulado con éxito nanopartículas de sílice mesoporosas recubiertas de bicapa lipídica cargada con 5-FU + ß-solape. Hemos demostrado que (i) el efecto antitumoral de ß-lap de una manera dependiente de la concentración en las células tumorales HNSCC, (ii) la combinación de 5-FU + ß-lap da como resultado una inhibición significativa de la proteína NQO1 y la proteína Bcl-2, ( iii) FNQ-MSN basado en combinación demostró una reducción significativa en la carga tumoral en el xenoinjerto de HNSCC. Estos datos apuntan inequívocamente al hecho de que una dosis subletal del inhibidor de NQO1 (ß-lap) podría mejorar la eficacia terapéutica del 5-FU en los tumores de HNSCC y podría extenderse al tratamiento clínico de otras neoplasias malignas.

Materiales y métodos

Preparación de nanopartículas de sílice mesoporosa bicapa lipídica cargada con 5-FU / ß

El MSN cargado con el fármaco se preparó disolviendo bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (210 mg) en 180 ml de agua y se hirvió a 80 ° C, seguido de 5-FU y ß-lap se agregaron 20% p / p de nanopartículas totales y luego se añadió fluoruro de amonio (NH4F) (30 mg) y se agitó bien durante 60 min. A continuación, se añadieron 1,6 ml de ortosilicato de tetraetilo (TEOS) gota a gota durante 30 min y se agitó continuamente durante 3 h. Se formaron coloides blancos semitransparentes que se recogieron después de centrifugar (15 min) a 10000 rpm a 24 ± 1 ° C. Los MSN se resuspendieron en agua ultrapura y el ciclo de centrifugación se repitió 2 veces. Por separado, se preparó una membrana de película delgada usando DSPE-PEG2000 (2% del peso total de MSN) y se hidrató con agua suspendida con MSN cargado con fármaco. La mezcla se sonicó inmediatamente con sonda durante 5 min a 50 W a temperatura ambiente (25ºC). El MSN con soporte de bicapa lipídica PEGilada se lavó finalmente dos veces y se resuspendió en agua ultrapura.

Tamaño de partícula, análisis de potencial zeta y análisis de morfología

El diámetro de partícula, el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta se evaluaron utilizando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Las partículas se analizaron utilizando un mecanismo de dispersión dinámica de luz (DLS) y las dispersiones de partículas se diluyeron bien antes del experimento. Todos los experimentos se realizaron por triplicado a temperatura ambiente. La morfología de las nanopartículas se determinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) utilizando CM 200 UT, Philips, MA, EE. UU.) Operado a 100 kV. Brevemente, las dispersiones de partículas se diluyeron, se colocó una gota en una rejilla TEM de malla 300 y se dejó reposar durante 10 min. Las partículas se tiñeron por contraste con ácido fosfotúngstico (PTA) al 2% como tinción negativa, se secaron al aire y se observaron bajo un microscopio TEM.

Carga de medicamentos

Se realizó un análisis de carga de fármaco de dos formas calculando el fármaco descargado o no unido en el sobrenadante y el fármaco cargado en la nanopartícula. La eficacia de carga del fármaco se realizó mediante el método HPLC. El HPLC estaba equipado con una bomba Shimadzu LC-20 AD PLC y un detector de PDA SPD-M20A y el software de análisis Shimadzu LC que contenía una columna C18 de fase inversa (Phenomenex C18, 150 4,6 mm, 5 µm). La fase móvil del 5-FU consiste en una mezcla de acetonitrilo y agua (10:90, v / v) y se bombea a una velocidad de 1 ml / min. La longitud de onda de detección se estableció en 265 nm para 5-FU. La fase móvil para ß-lap consiste en acetonitrilo / agua (31:69, v / v) y una longitud de onda de detección establecida en 254 nm a 35 ° C. La capacidad de carga (LC) y la eficiencia de carga (LE) de 5-FU / ß-lap se calcularon utilizando la fórmula respectiva.

$$ \ mathrm {LE} \ \ left (\% \ right) ={W} _ {t \ mathrm {otal} \ 5- \ mathrm {FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm {lap}} - {W} _ {\ mathrm {gratis} \ 5- \ mathrm {FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm {lap}} / {W} _ {\ mathrm {total} \ 5- \ mathrm { FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm {lap}} \ times 100 $$$$ \ mathrm {LC} \ \ left (\% \ right) ={W} _ {\ mathrm {total} \ 5 - \ mathrm {FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm {lap}} - {W} _ {\ mathrm {gratis} \ 5- \ mathrm {FU} + \ mathrm {\ ss} - \ mathrm { vuelta}} / {W} _ {\ mathrm {total} \ \ mathrm {NP} \ \ mathrm {masa}} \ veces 100 $$

Estudio de liberación de fármacos

La liberación de 5-FU y ß-lap se evaluó en PBS (pH 7,4) y ABS (pH 5,0) a 37 ° C utilizando el método de diálisis. Brevemente, se cargó 1 mg equivalente de cada nanopartícula cargada con fármaco en una membrana de diálisis en 1 ml de tampón respectivo y se sellaron los extremos. La membrana de diálisis sellada se colocó en 25 ml de los respectivos tampones ABS y PBS y se colocó en un baño de agua con agitación a 37ºC. Las muestras se recogieron en un intervalo de tiempo predeterminado y se reemplazaron con un volumen igual de tampón nuevo. La cantidad de fármaco liberada en el tampón respectivo se evaluó mediante el método de HPLC como se describe en la sección anterior.

Ensayo de actividad de cultivo celular y NAD (P) H:quinona oxidorreductasa 1 (NQO1)

La célula Cal33 HNSCC se cultivó en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS y 1% de mezcla de antibióticos. Las células se mantuvieron en condiciones ambientales en una incubadora. Para el ensayo de actividad de NQO1, se sembraron células Cal33 en una placa de 96 pocillos a una densidad de siembra de 8 × 10 ³ células por pocillo y se incuban durante la noche. Las células se trataron con diferentes concentraciones de ß-lap y se incubaron durante 24 h. Se utilizó digitonina al 0,8% (50 μl de EDTA 2 nM) para lisar las células y el ensayo se realizó con menadiol y MTT (bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) como la reacción y la actividad de acoplamiento del sustrato se midieron a 620 nm. El ensayo se realizó por triplicado.

Ensayo de viabilidad celular in vitro

El ensayo de viabilidad celular de ß-lap en concentración creciente y el ensayo de viabilidad celular de régimen individual y combinado se probaron mediante un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4 -sulfofenil) -2H-tetrazolio (MTS) ensayo. Brevemente, las células Cal33 se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de siembra de 1 × 10 ⁴ células por pocillo y se incuban durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con una concentración creciente de ß-lap, por separado; las células se trataron con un régimen individual y combinado de 5-FU y ß-lap a una concentración de base de 5, 10 y 20 μg / ml y se incubaron durante 24 h. Las células se lavaron dos veces y se trataron con una solución de MTS según las pautas del fabricante. Se calculó la viabilidad celular con respecto a las células no tratadas y se utilizó un lector de microplacas para absorbancia a 460 nm.

Análisis de Western Blot

Las células sembradas en una placa de 6 pocillos se trataron con una concentración creciente de ß-lap, por separado; las células se trataron con un régimen individual (5-FU o ß-lap) y combinatorio de 5-FU y ß-lap (FNQ-MSN) y se incubaron durante 24 h. Las células se recogieron, se lisaron (tampón M-per), se centrifugaron y se recogió el sobrenadante que contenía la proteína. La concentración de proteína en el lisado celular se evaluó utilizando el método del ácido bicinconínico (BCA). Se utilizó un 10% de gel de poliacrilamida Bis-Tris para separar las proteínas y se transfirió inmediatamente a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se bloqueó usando leche desnatada al 5% preparada en tampón de solución salina tamponada con n Tris (TBS) que contenía Tween 20 (TBST, pH 7,2). Los anticuerpos primarios de NQO1 policlonal de conejo (1:1000), Bcl-2 monoclonal de ratón (1:1000) y GAPDH monoclonal de ratón (1:1000) se incubaron en una membrana durante la noche a 4ºC. La membrana se lavó con TBST y luego se incubó con anticuerpos secundarios (IgG anti-ratón o anti-conejo) a una dilución de diluciones 1:10000. La membrana se lavó nuevamente con TBST y las transferencias se expusieron a una solución de sustrato ECL y se evaluaron las densidades de las bandas de proteína utilizando un revelador fotográfico.

Apoptosis y ensayo de Hoechst

Se sembraron células Cal33 en una placa de 6 pocillos a una densidad de siembra de 2 × 10 ⁵ células por pocillo y se incuban durante la noche. A continuación, las células se trataron con un régimen individual (5-FU o ß-lap) y combinatorio de 5-FU y ß-lap (FNQ-MSN) y se incubaron durante 24 h. Las células se recolectaron, lavaron, centrifugaron y sedimentaron. Las células se trataron con 2,5 µl de anexina V y 2,5 µl de PI y se incubaron durante 15 min en condiciones de oscuridad. A continuación, las células se prepararon hasta 1 ml y se evaluaron usando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, BD, FACSverse). Se analizaron un total de 10.000 células. Se siguió un procedimiento similar para la siembra de células y el tratamiento con fármacos y luego se tiñó con colorante Hoechst 33342 (10 μg / ml) y se incubó durante 10 min. Las células se lavaron y fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% y se lavaron de nuevo. La morfología celular se observó bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon A1, Japón).

Eficacia antitumoral de FNQ-MSN en el modelo de tumor de xenoinjerto de HNSCC

Se adquirieron ratones BALB / c machos de dieciocho a veintidós gramos con un promedio de 4-5 semanas de edad en el Centro de Instalaciones para Animales Internos de la Universidad de Industria Ligera de Zhengzhou, Henan. Los animales se mantuvieron en una habitación con aire acondicionado con un ciclo de luz oscura de 12 horas y se les dio acceso libre a alimentos y agua. Todos los protocolos animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Industria Ligera de Zhengzhou, Henan. Para establecer un modelo de xenoinjerto, 1 × 10 ⁷ Se inocularon células Cal33 en 150 µl de medio de cultivo en la cadera derecha del ratón por vía subcutánea. Cuando el tamaño medio del tumor alcanza los 80-100 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en 5 grupos para el control, 5-FU, ß-lap, 5-FU + ß-lap y FNQ-MSN, respectivamente, con 8 ratones en cada grupo. . El 5-FU se administró a una dosis fija de 5 mg / kg y ß-lap a una dosis fija de 25 mg / kg y se administró 3 veces con un intervalo de 3 días por cada inyección en la vena de la cola. El peso del ratón y el volumen del tumor se controlaron regularmente durante 18 días. El volumen del tumor se calculó mediante la fórmula

$$ V \ \ left ({\ mathrm {mm}} ^ 3 \ right) ={\ mathrm {Ancho}} ^ 2 \ \ left ({\ mathrm {mm}} ^ 2 \ right) \ times \ mathrm { Longitud} \ \ left (\ mathrm {mm} \ right) / 2 $$

El presente estudio no observó ninguna muerte de ratón debido a la carga de células tumorales y todos los animales fueron sacrificados con CO ₂ y luego sacrificado por dislocación cervical hacia el final del estudio.

Análisis estadístico

Se compararon varios grupos mediante el análisis de varianza bidireccional (ANOVA). Nivel de significancia de p <0.05 se consideró significativo y todos los datos se presentan como una media ± desviación estándar a menos que se mencione específicamente en los experimentos respectivos.

Resultado y discusión

Preparación de nanopartículas de sílice mesoporosa con soporte de bicapa lipídica cargada con 5-FU / ß-lap

En este estudio, hemos personalizado una nanopartícula de sílice mesoporosa estabilizada por bicapa lipídica PEGilada. El MSN cargado con 5-FU / ß se preparó mediante el método de sonicación en emulsión, y luego se introdujo MSN cargado con fármaco en el matraz que contenía una película delgada de lípidos que consistía en DSPE-PEG2000. La mezcla se sonicó y se obtuvo el MSN recubierto de lípidos que contenía 5-FU / ß-lap (FNQ-MSN) (Fig. 1a). Las eficiencias de carga (LE) de 5-FU y ß-lap fueron 91,5 ± 1,65% y 92,9 ± 1,24%, respectivamente. El FNQ-MSN exhibió un 8,1 ± 1,12% en peso de 5-FU y un 7,6 ± 0,95% en peso de ß-lap, lo que indica la alta capacidad de carga (LC) del portador de MSN. La presencia de bicapa lipídica evitará su liberación no deseada en la circulación sistémica y, por lo tanto, evita la toxicidad. El tamaño de partícula promedio de MSN cargado con fármaco fue 92.1 ± 0.85 nm (PDI ~ 0.089) mientras que el ensamblaje de la bicapa lipídica en la superficie de MSN (FNQ-MSN) aumentó el tamaño de partícula promedio a 128.4 ± 1.24 nm (PDI ~ 0.115) lo que indica una presencia sólida de materiales lipídicos en la superficie de MSN (Fig. 1b). El potencial zeta cambió de - 18,2 ± 1,22 a - 26,4 ± mV. El pequeño tamaño de partícula de FNQ-MSN permitirá la acumulación preferencial de portador cargado con fármaco en los tejidos tumorales con fugas en virtud del efecto EPR. Además, la superficie PEGilada conferirá una excelente estabilidad y un tiempo de circulación sanguíneo prolongado que aumentará aún más las posibilidades de FNQ-MSN en los tejidos tumorales. La imagen de TEM mostró una semejanza morfológica con la del liposoma y presentó una forma esférica perfecta uniformemente distribuida en la rejilla. La imagen TEM mostró claramente un núcleo exterior grisáceo posterior y más oscuro que indica la presencia de ensamblaje de lípidos en la superficie del MSN (Fig. 1c). El tamaño observado de TEM corrobora con el tamaño de partícula DLS de un zetasizador. Los MSN poseen canales bien ordenados para la distribución homogénea de moléculas de fármacos. La propiedad superficial de los poros es uno de los factores importantes en la carga estable de las moléculas pequeñas. Las diversas fuerzas físicas involucradas en la interacción huésped-huésped incluyen principalmente las fuerzas hidrófobas y las fuerzas de interacción de van der Waals. La mayor capacidad de carga de fármaco proporcionará una mayor concentración intracelular y una mayor eficacia de destrucción en los sitios del tumor. El FNQ-MSN exhibió una excelente estabilidad en el medio PBS y el tamaño de partícula permaneció sin cambios durante todo el período de estudio hasta 30 días. Esta estabilidad mejorada del sistema portador y la alta capacidad de carga del sistema portador mejorarán la biodistribución y la eficiencia en el tratamiento del tumor.

Liberación de fármacos in vitro

La liberación de fármaco in vitro de 5-FU y ß-lap de FNQ-MSN se estudió en PBS y ABS (Fig. 2). Como se muestra, se observaron dos tendencias de liberación diferentes en pH 7,4 y pH 5,0. Por ejemplo, el 25% de 5-FU se libera en 24 h a pH 7,4 en comparación con ~ 40% de liberación de fármaco a pH 5,0 en 24 h. De manera similar, se liberó 20% y 30% de ß-lap a pH 7,4 y pH 5,0, respectivamente. La cinética de liberación fue idéntica a lo largo del período de estudio con 50% de 5-FU liberado en tampón alcalino y 80% de liberación de fármaco a pH 5,0 después de 72 h de período de estudio. Una liberación de fármaco sensible al pH en condiciones ácidas es ventajosa para el tratamiento del cáncer. No se observó ningún fenómeno de liberación por ráfaga en ambas condiciones de pH atribuido principalmente a la presencia de la capa de DSPE-PEG que controló la liberación del fármaco del FNQ-MSN durante todo el período de estudio. Se observó una diferencia significativa en la liberación de fármaco entre las condiciones de pH 7,4 y pH 5,0. En condiciones de pH 7,4, PEG- b -DSPE exhibe una propiedad de capa de gran sigilo evitando así la liberación del compuesto encapsulado. El presente resultado mostró que la liberación del fármaco se aceleró a pH 5,0, lo que indica el desmontaje de la cubierta protectora alrededor de la superficie del MSN. La velocidad de liberación del fármaco sensible al pH, que asegura la máxima liberación del fármaco dentro de las células cancerosas, puede mejorar la eficacia antitumoral y reducir la toxicidad no deseada en los tejidos normales. Es posible que en presencia de un elemento sensible al pH, FNQ-MSN pueda dar como resultado el desprendimiento de la bicapa lipídica en el MSN, lo que resultará en una mayor liberación en las condiciones de pH más bajo.

Sensibilidad de NQO1 a ß-lap

Como la regulación al alza de NQO1 en muchas células cancerosas, incluido el HNSCC, se asocia con un mal pronóstico y un resultado terapéutico deficiente, los fármacos dirigidos a NQO1 podrían ser una estrategia potencial para el tratamiento del cáncer [24]. NQO1 se sobreexpresa en un nivel que varía de 100 a 200 veces en el carcinoma de células escamosas en comparación con el asociado con tejidos normales. Por lo tanto, se estudió la influencia de ß-lap sobre la actividad de la enzima NQO1 en células Cal33. Como se muestra, ß-lap mostró una inhibición dependiente de la concentración de la actividad de la enzima NQO1 en las células Cal33 (Fig. 3a). En particular, se observó un efecto inhibidor significativo a una dosis de 20 a 50 μg / ml de ß-lap. Además, el potencial inhibidor de ß-lap sobre la proteína NQO1 se estudió más a fondo mediante análisis de transferencia de Western (Fig. 3b). Los resultados revelaron claramente la disminución significativa de la proteína NQO1 en las células cancerosas con un aumento en la concentración de ß-lap. Aproximadamente, se observó una inhibición de NQO1 del 80% a 100 μg / ml de ß-lap. El fármaco bioactivable NQO1, como ß-lap, es metabolizado por NQO1 y forma un compuesto de hidroquinona inestable que se convierte inmediatamente en el componente original dejando 2 oxidaciones de un electrón y consume 2 O ²⁻ . Esto creará un ciclo redox inútil en el que 1 molécula de ß-lap generará 130 moles de superóxido a costa de consumir 60-70 moles de NAD (P) H6. Los radicales superóxido (O2.−) así formados se convertirán en peróxido de hidrógeno (H2O2−) y causarán apoptosis celular y muerte celular [25].

Efecto anticáncer in vitro de FNQ-MSN en células HNSCC

El efecto anticanceroso in vitro de ß-lap en células Cal33 se estudió mediante un ensayo MTT. Los resultados revelaron que ß-lap exhibió una disminución típica dependiente de la concentración en la viabilidad celular (Fig. 4a). En particular, se observó una disminución significativa en la viabilidad celular a una concentración de 50 μg / ml. Para experimentos adicionales, se seleccionaron 20 μg / ml (por debajo del valor IC50 de ß-lap). A continuación, se estudió el efecto de potenciación de ß-lap sobre 5-FU a 3 concentraciones diferentes (5, 10 y 20 μg / ml). Como se muestra, la combinación de 5-FU + ß-lap resultó en una menor viabilidad celular; más notablemente, FNQ-MSN exhibió una viabilidad celular significativamente menor en comparación con la de cualquiera de los fármacos individuales o combinaciones físicas (Fig. 4b). Por ejemplo, 5-FU y ß-lap mostraron una viabilidad celular de 35,7% y 70,2%, mientras que 5-FU + ß-lap mostraron 26,5% y FNQ-MSN mostró 13,1%, respectivamente. Los resultados mostraron claramente que el efecto citotóxico del 5-FU aumentó significativamente cuando se combinó con ß-lap. Vale la pena señalar que FNQ-MSN fue más eficaz en comparación con el de 5-FU + ß-lap atribuido a la mejor internalización y liberación controlada de la terapéutica cargada del sistema portador. Los resultados revelan claramente el efecto inhibidor de ß-lap sobre la actividad enzimática de NQO1 y los niveles de proteína y potenciaron el efecto anticanceroso del 5-FU y dan como resultado un mejor resultado terapéutico en el tratamiento de HNSCC.

Función de FNQ-MSN en las vías de señalización:análisis de transferencia Western

El mecanismo del efecto citotóxico mediado por ß-lap se exploró más a fondo mediante análisis de transferencia de Western. Como se muestra, ß-lap resultó en una disminución en la banda de proteína de NQO1 en comparación con el control; sin embargo, la disminución más notable en el nivel de NQO1 se observó en el grupo de células tratadas con FNQ-MSN (Fig. 4c). La mejora inducida por ß-lap de la quimiosensibilidad de Cal33 mediante la mejora de la apoptosis celular se evaluó a través del nivel de proteína Bcl-2. La familia Bcl-2 juega un papel importante en la regulación de la homeostasis celular y controla la proliferación y muerte de las células cancerosas. El proceso de disminución de Bcl-2 y aumento de Bax da como resultado la liberación del citocromo C en el citosol que iniciará toda la cascada de caspasas dando como resultado la muerte celular [26]. Los resultados destacaron claramente que la combinación de 5-FU y ß-lap (FNQ-MSN) redujo significativamente el Bcl-2, lo que indica el efecto anticancerígeno mejorado en las células cancerosas Cal33.

Análisis de apoptosis de HNSCC

Después del análisis de viabilidad celular, se evaluó el efecto de apoptosis del fármaco individual y combinado sobre las células Cal33 mediante un citómetro de flujo después de la tinción con anexina V / PI (Fig. 5). El efecto de apoptosis del 5-FU individual (10 μg / ml) o ß-lap (30 μg / ml) no dio como resultado una apoptosis apreciable de las células cancerosas; sin embargo, 5-FU + ß-lap dio como resultado un aumento espectacular en la proporción de apoptosis de las células cancerosas. Es importante destacar que FNQ-MSN resultó en más del 60% de la apoptosis celular (apoptosis temprana y tardía), lo que significa el efecto terapéutico superior del régimen de combinación basado en portadores. El efecto de la apoptosis se confirmó además mediante la tinción Hoechst 33342. Como se muestra, las células tratadas con FNQ-MSN dan como resultado una mayor cantidad de células que experimentan apoptosis, condensación nuclear y características de fragmentación en comparación con las de 5-FU o ß-lap solo (Fig. 6). Durante el proceso de apoptosis, las células se encogen sin dañarse en la membrana celular externa y da como resultado la condensación de cromatina con una mayor formación de cuerpos apoptóticos.

Ensayo en vivo / muerto

El efecto anticanceroso del fármaco individual y combinado se evaluó adicionalmente mediante el ensayo Vivo / Muerto. Las células tratadas se sometieron a tinción con Calceína AM y bromuro de etidio como marcador respectivo de células vivas y muertas (Fig. 7). Como se muestra, las células no tratadas se tiñen con un 100% de fluorescencia verde. Los fármacos individuales, 5-FU (10 μg / ml) o ß-lap (30 μg / ml) mostraron células teñidas con fluorescencia roja leve; sin embargo, las células predominantes exhibieron fluorescencia verde que indica una muerte celular limitada. Se observó una muerte celular notable en las células cancerosas tratadas con FNQ-MSN, como se muestra por la fluorescencia roja predominante y menos células teñidas con fluorescencia verde. El mayor efecto anticanceroso de FNQ-MSN se atribuyó a la actividad sinérgica del 5-FU y ß-lap en las células cancerosas y a la capacidad de ß-lap para aumentar la quimiosensibilidad del 5-FU.

Eficacia antitumoral in vivo de FNQ-MSN contra el modelo de xenoinjerto de HNSCC

Para evaluar más a fondo la eficacia del régimen combinado en un modelo animal, se preparó un xenoinjerto de HNSCC y se administró con 5 mg / kg de 5-FU y 10 mg / kg de ß-lap, respectivamente. El grado farmacéutico de ß-lap es ARQ761, que actualmente se encuentra en un ensayo clínico de fase I para el tratamiento de neoplasias metastásicas. ß-lap ha establecido el límite para la dosis máxima tolerable en humanos según los estudios preclínicos [27]. Teniendo esto en cuenta, hemos seleccionado de forma óptima una dosis de 10 mg / kg de ß-lap para los estudios in vivo. Como se muestra, no se observó una disminución significativa en el volumen del tumor con 5-FU y ß-lap administrados individualmente en comparación con el control no tratado (Fig. 8a). Se observó una disminución notable en el volumen del tumor con una mezcla física de 5-FU + ß-lap; sin embargo, el tratamiento combinado de 5-FU y ß-lap (FNQ-MSN) basados en portadores retrasó significativamente el crecimiento del tumor y prolongó la supervivencia de los ratones con xenoinjerto que portaban tumores. El gráfico de volumen tumoral de FNQ-MSN podría dividirse en dos partes; Se observó un crecimiento insignificante en el volumen del tumor hasta el día 9, mientras que el tumor aumentó significativamente después del día 9 hasta el día 18; sin embargo, el volumen total del tumor fue mucho menor en comparación con el del control u otros grupos. La preocupación por la toxicidad del régimen individual y combinado se evaluó en términos de peso corporal (Fig. 8b). Como se muestra, la mezcla física de 5-FU + ß-lap resultó en una toxicidad severa representada por más del 10% de pérdida de peso corporal, mientras que 5-FU resultó en un 5% del peso corporal. Como era de esperar, FNQ-MSN no dio como resultado ninguna pérdida de peso corporal, lo que indica la ventaja única del sistema portador basado en lípidos-MSN. El efecto antitumoral mejorado de FNQ-MSN se atribuyó al efecto inhibidor de ß-lap hacia la enzima y proteína NQO1 que a su vez aumentó la quimiosensibilidad del 5-FU y resultó en un efecto anticancerígeno sinérgico en los tumores humanos Cal33, segundo, bicapa lipídica –El MSN recubierto protegía el fármaco durante la circulación sistémica y podría liberarlo de manera controlada en el tejido tumoral, en tercer lugar, la PEGilación del nanoportador podría prolongar el tiempo de circulación sanguínea permitiendo la acumulación preferencial en los tejidos tumorales debido al efecto EPR [28, 29 ]. Los MSN PEGilados quedaron atrapados principalmente en RES del hígado, bazo y pulmón, lo que representa más del 80% de la dosis administrada. La modificación con PEG de MSN obviamente disminuyó la tasa de eliminación de MSN en los órganos, lo que demuestra que las NP PEGiladas eran más difíciles de eliminar de los órganos RES independientemente de la forma de las partículas [30, 31]. En general, el estudio in vivo sobre el modelo HNSCC ofrece una "prueba de concepto" de que la combinación eficaz de 5-FU + ß-lap en un nanoportador estable podría mejorar la eficacia terapéutica en el tumor al tiempo que alivia el efecto tóxico asociado.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

Abreviaturas

5-FU:: 5-fluorouracilo
EPR:: Efecto de penetración y retención mejorado
FNQ-MSN:: Nanopartículas de sílice mesoporosas cargadas con 5-FU / ß-solape
HNSCC:: Carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello
MSN:: Nanopartícula de sílice mesoporosa
NQO1:: NAD (P) H:quinona oxidorreductasa 1
ß-lap:: ß-lapachone

Dicroísmo circular sintonizable gigante de matrices nanocrescentes de metales quirales extrínsecos de área grande ARTÍCULO RETRACTADO:Estudio comparativo de la toxicidad de nanopartículas y nanopartículas de ferrita de cobalto recubiertas de polietilenglicol

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