Nanogeles de gelatina/sílice responsivos a redox funcionalizados con aptámero AS1411 para administración dirigida de siRNA

Resumen

La interferencia de RNA (RNAi) ofrece especificidad inigualable para silenciamiento génico, sin embargo, la estabilidad de siRNA y administración precisa a tejidos siguen siendo factores limitantes. Diseñamos un sistema dual-responsivo conjugando nanogeles basados en gelatina (GS) con el aptámero AS1411 dirigido a nucleolina y siRNA sustituido con desoxinucleótidos a través de un enlace disulfuro. Este diseño permite acoplamiento transitorio de siRNA y desencadena su liberación en microambiente tumoral rico en glutatión. En células A549 positivas para nucleolina, los nanogeles Apt-GS/siRNA se desensamblan tras exposición intracelular a GSH, entregando eficientemente siRNA al citosol y logrando potente silenciamiento de luciferasa. Ensayos de citotoxicidad confirmaron biocompatibilidad a concentraciones terapéuticamente relevantes. Estos nanogeles tumor-dirigidos, responsivos a redox, representan una plataforma prometedora para terapia contra cáncer basada en siRNA.

Introducción

RNAi aprovecha silenciamiento génico secuencia-específico, posicionándolo como candidato líder para tratar trastornos genéticos, cánceres y enfermedades infecciosas debido a su precisión y baja toxicidad. Comparado con oligonucleótidos antisentido, pequeños RNAs interferentes (siRNAs) muestran resistencia a nucleasas mejorada. Modificaciones químicas —como sustituir ribonucleótidos con desoxinucleótidos— han mostrado incrementar estabilidad de siRNA manteniendo ~40 % de actividad RNAi. A pesar de estos avances, administración eficiente y tejido-específica sigue siendo un desafío formidable.

Portadores nanopartículas pueden proteger siRNA de degradación y facilitar administración dirigida. Nucleolina, sobreexpresada en superficie de muchas células cancerosas proliferativas, es blanco atractivo para captación tumor-específica. El aptámero DNA de cuadruplex G AS1411 (AGRO100) une nucleolina con alta afinidad y ha entrado en ensayos clínicos Fase II como agente anticancerígeno. Estudios previos han conjugado exitosamente AS1411 a diversos nanomateriales, logrando internalización selectiva en células tumorales. Gelatina, una proteína biodegradable, se ha empleado para encapsulación de siRNA debido a su excelente biocompatibilidad y propiedades de gelificación. Nuestro grupo ha desarrollado previamente nanogeles de gelatina entrecruzados con siloxano (GS NGs) con tamaño y carga superficial controlados, demostrando transfección eficiente in vitro e in vivo.

Superar barreras intracelulares —especialmente escape endosomal y liberación de siRNA— es crítico. Enlaces responsivos a estímulos, como enlaces disulfuro que se escinden en ambiente de alto glutatión (GSH) de células tumorales, han atraído interés significativo. Portadores entrecruzados con disulfuro pueden desencadenar liberación explosiva de cargas terapéuticas específicamente dentro de células malignas.

Aquí presentamos un sistema de nanogel híbrido que combina GS NGs, direccionamiento con aptámero AS1411 y enlace disulfuro para liberación de siRNA gatillada por redox. Evaluamos su capacidad para mejorar captación celular, lograr silenciamiento génico tumor-específico y mantener baja citotoxicidad.

Métodos

Materiales

Gelatina (Bloom 240–270, pH 4.5–5.5) se obtuvo de BBI Company Inc. (EE. UU.). SPDP, GPSM y APTMS se compraron de Sigma‑Aldrich (EE. UU.). MTT, DMEM, FBS, penicilina y estreptomicina se obtuvieron de Hyclone (EE. UU.). AS1411, 5′‑FAM‑AS1411 y control negativo TDO fueron sintetizados por Sangon Biotech (China). Luc-siRNA sustituido con desoxinucleótidos (hebra sense: 5′‑SH‑(CH2)6‑CTTACGCTGAGTACTTCGATT‑3′; hebra antisense: 3′‑TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU‑5′; antisense marcado con FAM) fue purificado por HPLC por Gene Pharma (China). Lipofectamine 2000, plásmido luciferasa pGL3 y sistema de ensayo luciferasa fueron de Promega (EE. UU.). Células de adenocarcinoma pulmonar A549 y fibroblastos NIH 3T3 fueron provistas por Centro de Ingeniería Biomédica de Universidad de Xiamen (China). Todos los reactivos fueron grado analítico; vidrio fue limpiado a fondo y enjuagado con agua desionizada.

Secuencias DNA usadas:

• Aptámero AS1411: 5′‑GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT‑3′
• Control TDO: 5′‑CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTT‑3′

Preparación y Caracterización de Complejos Apt‑GS/siRNA

Nanogeles GS se sintetizaron vía proceso sol-gel: GPSM (0.2 g) se añadió a 20 mL de 0.75 % gelatina en HCl (pH 3) a 60 °C por 30 min, seguido por APTMS (0.08 g) y incubación 24 h. Los NGs GS resultantes se purificaron por centrifugación (14 000 rpm, 25 °C, 12 min) tres veces. Luego, NGs GS (0.5 mL, 5 g L⁻¹ PBS) reaccionaron con SPDP (25 µL, 20 mM DMSO) por 60 min a temperatura ambiente, luego incubaron con AS1411 tioilado (1 mg mL⁻¹) por 12 h. Los nanogeles Apt-GS se recuperaron por centrifugación y lavaron con agua desionizada tres veces. La suspensión de NGs Apt-GS activados con SPDP (80 mL, 5 mg mL⁻¹) se mezcló con hebra sense siRNA overnight a 4 °C. Tras purificación, la hebra antisense se anealó calentando a 94 °C por 5 min y enfriando a 47 °C por 20 min, formando complejos Apt‑GS/siRNA.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM, Hitachi S‑4300) reveló partículas esféricas. Dispersión dinámica de luz (Malvern Zetasizer) midió diámetros hidrodinámicos y potenciales zeta. Eficiencia de conjugación se cuantificó por fluorescencia de DNA marcado con FAM y ensayo ninhidrina para grupos amino superficiales (≈0.642 mmol g⁻¹).

Análisis por Electroforesis en Gel

Electroforesis se realizó a 100 V por 20–30 min en agarosa 2 % en buffer TBE. Imágenes se capturaron con sistema de documentación de gel. Para estudios de liberación, complejos GS/siRNA y Apt‑GS/siRNA se incubaron con 10 mM GSH (PBS) por 2 h previo a carga.

Citotoxicidad In Vitro

Ensayos MTT se condujeron en células A549 (1 × 10⁴ células/pozo) en placas de 96 pozos. Tras 24 h para alcanzar 70 % confluencia, células se trataron con nanogeles (100–600 µg mL⁻¹) en DMEM libre de suero por 24 h, seguido por 4 h incubación con MTT (5 mg mL⁻¹). Se añadió DMSO y absorbancia se leyó a 490 nm. Experimentos se triplicaron; viabilidad (%) se calculó relativo a controles sin tratar.

Internalización Celular

Células A549 y 3T3 se incubaron con 25 µL Apt‑GS o TDO‑GS marcados con FAM (2 mg mL⁻¹) por 10 h en medio libre de suero a 37 °C. Células se fijaron con 4 % paraformaldehído e imaginaron por microscopía confocal de barrido láser (CLSM). Para citometría de flujo, células se trataron con nanogeles marcados FAM (2 mg mL⁻¹) por 0.5–16 h, luego lavaron, resuspendieron en PBS en hielo y analizaron en citómetro de flujo EPICS XL. Inhibición de captación se evaluó pre-incubando células con AS1411 libre (0.5, 5, 50 µM) por 8 h antes de añadir nanogeles.

Silenciamiento Génico

Células A549 (2 × 10⁵ células/pozo) y NIH 3T3 (4 × 10⁵ células/pozo) se transfectaron con complejos Apt‑GS/siRNA (80 µg mL⁻¹) por 8 h. Tres regímenes de tratamiento se evaluaron: (a) Apt‑GS/siRNA solo; (b) Apt‑GS/siRNA seguido de liposoma (A‑GS/si→Lip); (c) Apt‑GS/siRNA y liposoma concurrentes (A‑GS/si+Lip). Tras 40 h adicionales, actividad luciferasa se midió con sistema de ensayo luciferasa. Datos se presentaron como media ± SEM (triplicado).

Resultados y Discusiones

Síntesis y Caracterización de Complejos GS‑AS1411/siRNA

Imágenes TEM (Fig. 1) confirmaron que tanto GS blancos como nanogeles Apt‑GS formaron partículas esféricas uniformes con diámetros de 170–200 nm. Imagen de fluorescencia demostró conjugación exitosa de AS1411 y siRNA. Cuantificación reveló ~0.65 µmol g⁻¹ de aptámero en GS. Tamaños hidrodinámicos aumentaron de 162.3 nm (GS) a 216.5 nm (Apt‑GS) y 234.9 nm (Apt‑GS/siRNA), reflejando funcionalización superficial. Potenciales zeta cambiaron de +40.1 mV (GS) a +33.9 mV (Apt‑GS) y –24.9 mV (Apt‑GS/siRNA), indicando reducción de carga superficial que se espera reduzca unión proteica no específica y citotoxicidad.

Carga y Liberación de siRNA

Electroforesis en gel mostró carga eficiente de siRNA en complejos Apt‑GS/siRNA, evidenciada por movilidad reducida (carriles 10–11). Tras incubación con 10 mM GSH, siRNA se liberó en 2 h (carriles 6–7), confirmando desensamblaje gatillado por redox. Capacidad de carga se estimó en 3:1 a 2:1 pmol siRNA por µg de nanogel. Atrapamiento físico (mezcla siRNA libre con GS) mostró retención más débil, subrayando ventaja de unión covalente.

Citotoxicidad y Direccionamiento a Nucleolina

Ensayos MTT (Fig. 4) revelaron >80 % viabilidad para GS, Apt‑GS y Apt‑GS/siRNA en 100–600 µg mL⁻¹, demostrando excelente biocompatibilidad. Ligeramente reducida viabilidad con Apt‑GS se atribuyó a inhibición NF-κB inducida por AS1411 y disrupción orgánulos. Microscopía de fluorescencia y citometría de flujo (Figs. 5 y 6) confirmaron captación selectiva: Apt‑GS mostró 96 % internalización en células A549 versus 52 % en fibroblastos 3T3. Competencia con AS1411 libre redujo captación en 50 % (fluorescencia) y 30 % (porcentaje de células positivas), confirmando endocitosis mediada por nucleolina.

Interferencia de RNA

Ensayos de silenciamiento de luciferasa (Fig. 7a) demostraron reducción 4.6-veces en células A549 con Apt‑GS/siRNA, comparado a solo 6 % en células NIH 3T3, resaltando especificidad tumoral. Adición de liposomas (A‑GS/si→Lip) no mejoró significativamente silenciamiento (30.4 %) relativo a Apt‑GS/siRNA solo, mientras tratamiento concurrente con liposoma (A‑GS/si+Lip) aumentó silenciamiento a 41.6 %. El mayor silenciamiento (≈ 2.7-veces sobre 3T3) se logró a 80 µg mL⁻¹, con eficiencia disminuida a 120 µg mL⁻¹ probablemente por citotoxicidad aumentada.

Conclusiones

Hemos diseñado una plataforma de nanogel nucleolina-dirigida, responsiva a redox, que protege siRNA modificado con desoxinucleótidos y lo libera específicamente en citosol tumoral rico en GSH. Los nanogeles Apt‑GS/siRNA ~200 nm, cargados positivamente, logran potente silenciamiento génico tumor-selectivo (~5-veces mejora en células A549) manteniendo baja citotoxicidad. Estos hallazgos validan la estrategia de combinar química de enlace disulfuro con direccionamiento por aptámero para administración eficiente de siRNA y representan un paso prometedor hacia terapéuticos RNAi clínicos.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Los conjuntos de datos que apoyan las conclusiones de este artículo están incluidos dentro del artículo.

Abreviaturas

APTMS

3‑Aminopropil-trimetoxisilano

DMEM

Medio modificado de Dulbecco Eagle

DMSO

Dimetil sulfoxido

FAM

Fluoresceína amidita

GE

Electroforesis en gel

GPSM

3‑Glicidiloxipropil-trimetoxisilano

GS NGs

Nanogeles de gelatina entrecruzados con siloxano

MTT

3-(4,5‑Dimetiltiazol‑2‑il)-2,5‑difeniltetrazolio bromuro

RNAi

Interferencia de RNA

siRNAs

Pequeños RNAs interferentes

SPDP

N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato

TDO

Oligonucleótido DNA negativo