Nanogeles de aptámeros de sílice / gelatina sensibles a redox para la entrega de ARNip dirigida

Resumen

La interferencia de ARN (ARNi) tiene ventajas potenciales sobre otros enfoques de terapia génica debido a su alta especificidad y la capacidad de inhibir la expresión del gen diana. Sin embargo, la estabilidad y la entrega específica de tejido de ARNip siguen siendo los mayores obstáculos para la terapéutica de ARNi. Aquí, desarrollamos un sistema de este tipo mediante la conjugación de nanogeles a base de gelatina con el aptámero AS1411 dirigido a nucleolina y ARNip sustituido con desoxinucleótido juntos (Apt-GS / ARNip) a través de un enlazador disulfuro para lograr un acoplamiento transitorio de ARNip. Estos nanogeles de Apt-GS / ARNip demostraron una liberación favorable de ARNip en condiciones reductoras debido a la escisión por disulfuro. Además, este sistema inteligente podría liberar de forma electiva ARNip en el citosol en células positivas para nucleolina (A549) mediante un desensamblaje desencadenado por glutatión y, posteriormente, ARNi eficaz para luciferasa. Además, los nanogeles Apt-GS equipados con disulfuro mostraron una buena biocompatibilidad in vitro. En conjunto, estos nanogeles inteligentes con respuesta redox y dirigidos a tumores muestran un gran potencial para aprovechar la administración de ARNip funcionalizado y la terapia tumoral.

Introducción

La interferencia de ARN (ARNi) es un silenciamiento de genes de secuencia específica y también se está evaluando actualmente como un método muy prometedor en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades, incluidos trastornos genéticos, cánceres y enfermedades infecciosas, debido a su alta especificidad y baja toxicidad. [1]. Los ARN de interferencia pequeños (ARNip) con moléculas de ARN de doble hebra son más resistentes a la degradación de nucleasas que los oligonucleótidos antisentido y, por lo tanto, muestran ventajas sobre la terapia antisentido. La incorporación de nucleótidos químicamente modificados en ARNip se utilizó para aumentar o disminuir la eficacia y la duración de ARNi. Se ha demostrado que la sustitución de los ribonucleótidos de la hebra con sentido por desoxinucleótidos podría aumentar la estabilidad de la hebra con sentido y mantener ∼ 40% de eficacia de RNAi [2, 3]. Sin embargo, la entrega específica de tejido de ARNip sigue siendo un gran obstáculo para sus aplicaciones a pesar de las grandes potencias de eliminación de genes observadas en los estudios in vitro [4, 5].

La administración basada en nanopartículas tiene ventajas potenciales en la estabilización eficaz del ARNip y en modificaciones adicionales para la administración en un sitio específico [6, 7, 8]. La entrega productiva dirigida al sitio de ARNip puede mejorar la transfección y reducir los efectos fuera del objetivo, que son requeridos por la mayoría de las aplicaciones prácticas [9]. La nucleolina está asociada con diversos procesos biológicos y se expresa salvajemente en el núcleo y el citoplasma de varias células normales. Además, la nucleolina se expresa en gran medida en las membranas plasmáticas de las células cancerosas en proliferación activa en relación con sus contrapartes normales y, por lo tanto, se utiliza como un objetivo atractivo para tratamientos antineoplásicos. El aptámero AS1411 (también conocido como AGRO100), un aptámero de ADN del cuarteto G, puede unirse fuertemente a la nucleolina de la superficie celular y bloquear la vía antiapoptótica en las células cancerosas al combinarse con el modulador esencial del factor nuclear kB, que ha alcanzado los ensayos clínicos de fase II como el primer fármaco aptámero de ácido nucleico para el tratamiento del cáncer en seres humanos [10, 11]. Hasta el momento, AS1411 se ha conjugado con éxito con varias nanopartículas y las ha internalizado en las células cancerosas [12,13,14,15]. La gelatina se ha empleado para la encapsulación de ARNip debido a su excelente biocompatibilidad, biodegradabilidad y propiedades de gelificación [16, 17, 18]. Nuestro grupo ha explorado una serie de nanogeles de gelatina reticulados con siloxano (GS NG) con tamaño y carga superficial controlados, lo que demuestra la eficacia de transfección de GS NG in vitro e in vivo [19, 20].

Además de las barreras intracelulares, las barreras intracelulares después de la internalización, incluido el desensamblaje eficiente del ARNip y el escape endosómico, siguen siendo igualmente desafiantes. La conjugación de ARNip a un portador a través de enlaces lábiles o no lábiles es un método prometedor para superar este desafío de entrega. La liberación sensible a estímulos bajo pH ácido y potencial redox ha recibido gran interés. La reticulación de disulfuro muestra un gran potencial en una explosión de liberación de fármaco a través de enlaces escindidos en las células tumorales debido a un nivel más alto de glutatión (GSH) en el entorno extracelular [21, 22]. Se ha informado que los conjugados poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) / ARNip formados a través de un enlace disulfuro exhiben una encapsulación mejorada y eficiencia de entrega [23].

En este trabajo, se exploraron nanogeles híbridos basados en GS con funciones duales de respuesta redox de la conjugación de disulfuro y el direccionamiento tumoral específico del aptámero AS1411 como un portador de ARNip para la terapia del cáncer (Esquema 1). Nuestro objetivo es investigar si los GS NG funcionales de AS1411 mejorarían la internalización celular eficaz y lograrían el silenciamiento génico específico del tumor del gen modelo de luciferasa in vitro. Además, la seguridad de este sistema también se evaluó in vitro.

Se desarrolló un Apt-GS NG sensible a redox y dirigido a tumores para la entrega de ARNip con conjugación de disulfuro y aptámero AS1411

Métodos

Materiales

La gelatina (número de floración:240-270, pH 4,5-5,5) se compró a BBI Company Inc. (EE. UU.). N -succinimidil 3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), 3-glicidoxipropil-trimetoxisilano (GPSM) y 3-aminopropil-trimetoxisilano (APTMS) se adquirieron de Sigma-Aldrich Co. (EE.UU.). El bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazolil-2) -2, 5-difeniltetrazolio (MTT) se adquirió en Amresco Co. (EE.UU.). El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el suero fetal bovino, la penicilina y la estreptomicina se obtuvieron de Hyclone Co. (EE. UU.). El aptámero de AS1411, el AS1411 marcado con 5'-FAM y el ADN de control negativo (TDO) fueron sintetizados por Sangon Biotech Co. (China). Hebra sentido tiol del Luc-siRNA, 5′-SH- (CH ₂ ) ₆ -CTTACGCTGAGTACTTCGATT-3 '(desoxinucleótidos sustituyen a los ribonucleótidos) y la cadena antisentido, 3'-TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU-5', y la cadena antisentido marcada con FAM en el extremo 3 'se sintetizaron y purificaron con HPLC por Gene Pharma Co. ( China). La lipofectamina 2000, el plásmido de luciferasa pGL3 y el sistema de ensayo de luciferasa se adquirieron de Promega Co. (EE. UU.). Las células A549 de adenocarcinoma de pulmón humano maligno y los fibroblastos NIH 3T3 normales fueron utilizados y proporcionados por el Centro de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Xiamen (China). Todos los materiales utilizados fueron de calidad analítica y sin purificación adicional. La cristalería se limpió a fondo y se enjuagó con agua desionizada.

Las secuencias de ADN son las siguientes:

Aptamer AS1411:5′-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTTTT-3 ′, Control TDO:5′-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTTTTTTTTTTTPT>

Preparación y caracterización de complejos Apt-GS / siRNA

Los nanogeles de gelatina / sílice funcionalizados con amino (GS NG) se prepararon primero mediante un procedimiento de sol-gel, como se describió anteriormente [19]. Normalmente, se añadieron 0,2 g de GPSM a 20 ml de solución de gelatina al 0,75% en solución de HCl (pH =3) a 60 ° C bajo 30 min de agitación y posteriormente se añadieron 0,08 g de APTMS e incubaron durante otras 24 h. Las GS NG obtenidas se purificaron mediante centrifugación (14.000 rpm, 25ºC, 12 min) tres veces. En segundo lugar, se trataron GS NG (0,5 ml, 5 g / L en PBS) con 25 uL de SPDP (20 mM en DMSO) durante 60 min a temperatura ambiente, seguido de la adición de AS1411 tiolado (1 mg / ml) y agitando durante 12 h. Los nanogeles de Apt-GS se obtuvieron por centrifugación (14.000 rpm, 25 ° C, 12 min) y se purificaron con agua desionizada tres veces. En tercer lugar, la suspensión de Apt-GS NG activada por SPDP obtenida (80 ml, 5 mg / ml) se mezcló directamente con la hebra sentido de ARNip durante la noche a 4ºC. Después de la purificación por centrifugación, la hebra antisentido de ARNip se agregó y se incubó durante 5 min a 94 ° C, luego se templó durante 20 min a 47 ° C para formar complejos Apt-GS / ARNip.

Las morfologías de la superficie de los complejos AS1411-GS y AS1411-GS / ARNip se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Hitachi S-4300, Japón). El tamaño de partícula y los potenciales zeta de cada muestra se midieron mediante un detector de dispersión de luz dinámica Nano-ZS Zetasizer (Malvern Instruments, Reino Unido). Los diámetros de partículas efectivos se calcularon a partir de la función de autocorrelación utilizando el software Malvern Zetasizer asumiendo una distribución logarítmica normal. Las conjugaciones de GS y AS1411 o ARNip se determinaron recolectando y midiendo la concentración de ADN marcado con FAM no unido usando microscopía de fluorescencia F-7000 (Olympus-IX73, Japón). Grupo amino total (-NH ₂ ) los niveles en la superficie de nanogeles de GS se determinaron cuantitativamente usando la reacción colorimétrica de ninhidrina. La cantidad fue de aproximadamente 0,642 mmol / g.

Análisis de electroforesis en gel

La electroforesis en gel se realizó a 100 V durante 20 a 30 min utilizando gel de agarosa al 2% (p / v) en tampón TBE. Las imágenes se observaron mediante irradiación con un sistema de documentación en gel (Tanon GIS-2008, China). En el ensayo de encapsulación de Apt-GS / siRNA, los complejos de siRNA desnudo, GS / siRNA y Apt-GS / siRNA se cargaron en el gel sin ningún aditivo. En los ensayos de respuesta redox, el complejo GS / ARNip y Apt-GS / ARNip se incubaron con una solución de GSH 10 mM en PBS durante 2 h antes de la medición.

Citotoxicidad in vitro

La citotoxicidad contra células A549 de adenocarcinoma de pulmón humano se evaluó mediante ensayo MTT. Brevemente, celdas A549 (1 × 10 ⁴ células / pocillo) se sembraron en placas de cultivo de poliestireno de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h hasta el 70% de confluencia. Después de retirar el medio de cultivo, se agregaron a cada pocillo 100 μL de medio DMEM sin suero que contenía nanogeles (100-600 mg / mL). Las células tratadas con medio solo sirvieron como grupo de control negativo. Después de 24 h de co-incubación, se agregaron 100 μL de medio fresco con 20 μL de solución de MTT (5 mg / mL en tampón PBS) y se cultivaron durante otras 4 h. Luego, se eliminó la solución de MTT y se agregaron 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Después de oscilar durante 30 min en la oscuridad, se midió la absorbancia de cada pocillo mediante un lector de microplacas (TECAN DNA export, Swiss) a la longitud de onda de 490 nm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. La viabilidad celular relativa (%) se expresó como un porcentaje en relación con las células de control no tratadas.

Internalización de celda

Las células se cultivan conjuntamente con 25 μl de nanogeles de Apt-GS y TDO-GS marcados con FAM (2 mg / ml) durante 10 h en medio sin suero a 37 ° C. Después de lavar tres veces con PBS, las células se fijaron con paraformaldehído (4% en PBS) durante 30 min y luego se observaron con microscopio de barrido láser confocal (Leica, Alemania). Para cuantificar la captación celular, las células se trataron con 25 μl de AS1411-GS y TDO-GS marcados con FAM (2 mg / ml) durante un período (0,5-16 h) en medio sin suero a 37 ° C. Para evaluar el papel de la nucleolina en la captación celular de los NG Apt-GS, la mezcla de los NG Apt-GS preparados y los aptámeros AS1411 libres de concentraciones variadas (0,5, 5 y 50 μM) se incubó con las células A549 durante 8 h. Luego, las células se resuspendieron en PBS helado y las células fluorescentes con nanogeles marcados con FAM se contaron a partir de 10.000 células utilizando un citómetro de flujo EPICS XL (Beckman Coulter, EE. UU.). El análisis de datos se realizó con el software de citómetro de flujo EPICS XL, y se eligieron puertas analíticas como el 1% de las células de control que se encuentran dentro de la región positiva.

Silenciamiento de genes

La capacidad para silenciar genes se examinó utilizando la combinación de ARNip para luciferasa y las células que expresan luciferasa. Brevemente, A549 que expresa luciferasa (2 × 10 ⁵ células / pocillo) y fibroblastos NIH 3 T3 (4 × 10 ⁵ células / pocillo) se sembraron en una placa de 12 pocillos y se cultivaron durante la noche y luego se trataron con 100 μl de complejos de prueba (80 μg / ml) que contenían LUC-siRNA (o siRNA de control) durante 8 h. Las muestras se dividieron en tres grupos:(a) solo complejos Apt-GS / siRNA durante 8 h, (b) complejos Apt-GS / siRNA durante 8 h seguidos de liposomas durante 1 h más (denominados A-GS / si → Lip group) y (c) coincubación de complejos Apt-GS / siRNA y liposomas durante 8 h (A-GS / si + grupo Lip). Las células sin ningún tratamiento y las transfectadas con el plásmido de luciferasa pGL3 (Madison, WI, EE.UU.) fueron como controles. Después de 40 h adicionales de incubación, se investigó la eficacia de la eliminación de genes cuantificando la expresión de luciferasa en las células utilizando un sistema de ensayo de luciferasa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los datos se muestran como medias ± errores estándar de las medias.

Resultados y discusiones

Síntesis y caracterización de complejos GS-AS1411 / siRNA

Para construir el portador de ARNip dirigido al cáncer, se diseñó un nanogel de gelatina / sílice-AS1411 (Apt-GS) (Esquema 1) utilizando un método de sol-gel [19, 20]. La imagen típica de TEM (Fig. 1) reveló que GS y Apt-GS en blanco eran estructuras esféricas dispersas con diámetros promedio de 170-200 nm. Se usó ADN marcado con FAM para la síntesis para confirmar el acoplamiento de AS1411 y ARNip en GS NG. La cantidad de aptámero conjugado en GS fue de aproximadamente 0,65 µmol / g, cuantificado usando espectros de fluorescencia. Mientras tanto, se puede observar fácilmente una fluorescencia verde intensa en las imágenes de fluorescencia, lo que sugiere la integración del aptámero AS1411 y el ARNip. Como se muestra en la Fig.2, el tamaño hidrodinámico de los NG desnudos de GS, Apt-GS y Apt-GS / ARNip (162,3 nm, 216,5 nm y 234,9 nm, respectivamente) aumentó gradualmente junto con el procedimiento de funcionalización debido a un aumento en el capa funcional superficial. Por otro lado, el potencial zeta de Apt-GS fue menos positivo (33,9 ± 0,5 mV) que el de los GS NG desnudos (40,1 ± 0,5 mV) debido al efecto de enmascaramiento de los aptámeros de ADN negativos en la superficie. Después de una conjugación adicional con ARNip en la superficie, el potencial zeta de los NG de Apt-GS / ARNip todavía cambia negativamente a 24,9 mV debido a los grupos fosfato negativos libres en exceso del ARNip. Este resultado sugirió una toxicidad biológica reducida porque las fuertes cargas positivas podrían interferir con las proteínas cargadas negativamente en la sangre y alterar la membrana celular [24].

Imágenes de Apt-GS ( a , c ) y nanogeles Apt-GS / siRNA ( b , d ). un , b Imágenes TEM. Las barras de escala representan 0,5 μm. c , d Imágenes fluorescentes. Las barras de escala representan 5 μm

Tamaño hidrodinámico y potenciales zeta de nanogeles GS, Apt-GS y Apt-GS / siRNA

Carga y liberación de ARNip

Un ARNi con éxito solo puede ocurrir cuando el ARNip se administra y se libera rápidamente de su portador al citoplasma [25]. Las células tumorales tienen una concentración de GSH de 7 a 10 veces mayor que la de las células normales [26, 27]. En este estudio, el ARNip se conjugó con Apt-GS NG activos a través de la reacción de reticulación de disulfuro. La electroforesis en gel (GE) se llevó a cabo para evaluar la capacidad de carga y liberación de ARNip de los complejos Apt-GS / ARNip. Como era de esperar, mientras que el pDNA libre (Fig. 3, carriles 1-5) se movió a su posición habitual, los complejos Apt-GS / siRNA exhibieron la movilidad disminuida en un ensayo de cambio de electromovilidad (Fig. 3, carriles 10-11) demostrando la buena carga de ARNip. Para imitar la condición intracelular, se trató 10 mM de GSH con complejos durante 2 h para reducir los NG de Apt-GS / ARNip. Como se muestra en la Fig. 3, carril 6-7, se observaron moléculas de ARNip en el gel de poliacrilamida después del tratamiento de GSH, lo que indica que los NG de Apt-GS / ARNip podrían liberar de manera reversible moléculas de ARNip funcionales mediante escisión con disulfuro en presencia de glutatión. Además, la cantidad de ARNip en las nanopartículas se analizó comparando la cantidad total de ARNsi y ARNsi de control en electroforesis en gel de poliacrilamida al 2%. Las moléculas de ARNip encapsuladas de Apt-GS en una proporción de 3:1∼2:1 pmol por microgramo. También se observa que la mezcla de ARNip y Apt-GS mostró una retención más débil debido al atrapamiento físico del ARNsi negativo (Fig. 3, carril 8).

Análisis AGE de la unión reversible de ARNip a nanogeles de Apt-GS. Carriles 1 a 5:ARNip libre con cantidades de 50, 40, 30, 20 y 10 pmol. Carriles 6 y 7:GS / ARNip y Apt-GS / ARNip con GSH 10 mM a las 2 h. Carril 8:la mezcla de ARNip libre y Apt-GS NG. Carriles 10 y 11:complejos GS / siRNA y Apt-GS / siRNA sin GSH 10 mM como controles

Citotoxicidad y focalización de nucleolina

La evaluación de la citotoxicidad in vitro se investigó mediante un ensayo MTT en células A549. El ensayo MTT se utiliza para evaluar la citotoxicidad de nanogeles preparados. Se seleccionó como indicador el ARNip de luciferasa no tóxico, que no tiene ningún efecto de destrucción sobre las células tumorales [28, 29]. Por tanto, la viabilidad celular representó la biocompatibilidad del portador. Como se muestra en la Figura 4, la proliferación celular no se vio afectada notablemente por GS, Apt-Apt y Apt-Apt / siRNA a las concentraciones de grupos de 100-600 μg / mL (viabilidad celular> 80%) y la citotoxicidad apareció dosis -dependiente. En comparación con los GS NG desnudos, los nanogeles modificados con AS1411 tenían una ligera disminución en la viabilidad celular debido a la inhibición de la señalización de NF-κB [27, 30] y la destrucción de las membranas de orgánulos [16]. La biocompatibilidad benigna de los nanogeles Apt-GS los hace adecuados como portadores de ARNip in vivo.

Viabilidad celular de las células A549 con nanogeles de GS, Apt-GS y Apt-GS / ARNip de diversas concentraciones determinadas por ensayo MTT

Para evaluar el direccionamiento de Apt-GS en células tumorales in vitro, incubamos células A549 y fibroblastos 3T3 con las mismas cantidades de Apt-GS marcado con FAM o TDO-GS de control (GS decorado con un oligonucleótido de control). Se pudieron observar niveles bajos de fluorescencia en células 3T3 o cuando las células se trataron con TDO-GS de control (Fig. 5b, c). Por el contrario, la fluorescencia verde emitida por el aptámero AS1411 aumentó notablemente en las células cancerosas A549 (figura 5a), lo que sugiere que Apt-GS se acumuló específicamente en las células tumorales debido a la introducción de los aptámeros AS1411 dirigidos a nucleolina. En el análisis cuantitativo por citometría de flujo (Fig. 6), Apt-GS NG exhibieron intensidades de fluorescencia dependientes del tiempo en ambos tipos de células. De 0,5 a 16 h, la intensidad de fluorescencia de internalización de Apt-GS en células A549 y células 3T3 mejoró 13 y 2 veces, respectivamente. En cuanto a la proporción de células que contienen NG, aumentó rápidamente en los primeros 30 min y aparentemente la máxima saturación posible a las 8 h en A549.96% de las células A549 se habían adherido o tomado los nanogeles dentro de las 16 h, mientras que solo el 52% de las células 3T3 fue observado. Para evaluar el papel de la nucleolina en la captación celular de nanogeles, la mezcla de los aptámeros Apt-GS NG preparados y los aptámeros AS1411 libres de concentraciones variadas (0,5, 5 y 50 μM) se incubó con células A549 durante 8 h. La intensidad de la fluorescencia y los porcentajes de células que contienen nanogeles disminuyeron en un 50% y un 30%, respectivamente, cuando se utilizó el aptámero AS1411 libre para competir con los NG Apt-GS por la nucleolina expresada en la membrana celular, lo que sugiere una endocitosis mediada por receptores inducida por nucleolina ( Figura 6c). Estos datos demostraron que los Apt-GS NG exhibieron una mayor acumulación en las células cancerosas A549 a través de la internalización mediada por nucleolina.

un - c Captación celular de FAM-siRNA entregado por nanogeles Apt-GS y TDO-GS. Las imágenes se tomaron con CLSM. Señal verde:FAM. La barra de escala es de 10 μm

Análisis de citometría de flujo (FCMS) de la captación celular de nanogeles Apt-GS y TDO-GS marcados con FAM en diferentes tipos de células. Insertar:perfiles FACS, a , b la curva roja, verde, azul, violeta, aguamarina y amarilla presenta el tiempo de incubación de 0,5 a 16 h; c curva roja, verde, azul y violeta significan la concentración de AS1411 de 0 a 16 μM

Interferencia de ARN

Se ha informado de que la incorporación de desoxinucleótidos en ARNip puede aumentar la estabilidad de la hebra sentido y mantener ∼ 40% de eficacia de ARNi [2, 3]. Para evaluar la eficacia de eliminación de los portadores de ARNip de prueba, empleamos un sistema de gen informador de luciferasa reemplazado por ribonucleótidos en ambas células. La eficacia de eliminación de genes (KD) del ARNip se evaluó mediante la actividad de luciferasa después de 48 h. Como se muestra en la Fig. 7a, el Apt-GS / siRNA mejora la eficiencia de eliminación de genes de 4,6 veces de las células A549 en comparación con el 6% de las células 3T3 normales, mostrando una buena selectividad celular. Esto sugirió que la modificación del aptámero AS1411 mejoró la eficiencia de la transfección al generar un efecto de direccionamiento. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos ayudan a la entrega de la carga y al escape de los lisosomas [31]. Además, la posterior adición de liposomas (A / si-GS → grupo Lip) no ayudó a mejorar la actividad de silenciamiento de genes mediada por ARNip (30,4%) a pesar de la alteración del endosoma, lo que infiere la liberación de ARNip en el entorno intracelular de glutatión (GSH) por división de disulfuro. . Además, la cotransfección de liposomas y Apt-GS / siRNA (A / si-GS + grupo Lip) mejoró ligeramente la eficiencia de eliminación de la expresión de luciferasa (41,6%) en A549 a través del escape del lisosoma con ayuda de liposomas, en correspondencia con informes anteriores [27 , 30]. Sin embargo, las células A549 tenían actividades de silenciamiento génico de 2,7 y 1,4 veces para el grupo A / si-GS → Lip y para A / si-GS + Lip, respectivamente, en comparación con las células 3T3, lo que infiere una disminución de la selectividad celular.

Efecto silenciador in vitro del ARNip anti-luciferasa formulado en nanogeles Apt-GS con diferentes tratamientos ( a ) y concentración de complejos Apt-GS / ARNip (A-GS / si) en el silenciamiento génico ( b )

A continuación, examinamos el efecto de concentración de nanogeles en el ARNi. Como se muestra en la Fig. 7b, la eficiencia de interferencia génica alcanzó el máximo a la concentración de complejo de 80 μg / ml. La disminución de la eficacia de KD a una concentración de 120 μg / ml puede deberse a una mayor citotoxicidad del aptámero. También se observa que la adición de un liposoma, agente de escape del endosoma, puede aumentar la eficacia de la interferencia del ARN a concentraciones bajas de nanogeles de Apt-GS / ARNip (40 μg / ml y 80 μg / ml), pero no condujo a una reducción en concentraciones altas (120 μg / ml). Por lo tanto, se cree que Apt-GS puede administrar con éxito ARNip a las células tumorales y, posteriormente, producir ARNi específico.

Conclusiones

La estabilidad y la entrega específica de tejido de ARNip siguen siendo los mayores obstáculos para la terapéutica de ARNi. Aquí, el ARNip sustituido con desoxinucleótido se usa para mejorar la estabilidad del ARNip, y el núcleo de GS se revistió adicionalmente con aptámero AS1411 para el direccionamiento tumoral y enlazador de disulfuro para la entrega de ARNip sensible a redox. El vehículo tiene una estructura esférica con un tamaño de aproximadamente 200 nm y posee cargas positivas en la superficie. Estos nanogeles de Apt-GS / ARNip tal como se prepararon podrían proteger la carga y exhibieron una liberación acelerada de ARNip bajo la adición de DTT mediante escisión de disulfuro. Además, con el aptámero de orientación AS1411, los nuevos nanogeles Apt-GS Apt-GS podrían entregar y liberar de manera efectiva más carga al citoplasma, lo que conduce a una mejora significativa (~ 5 veces in vitro de mejora en la actividad de silencio en células A549 que sobreexpresan nucleolina). En general, estos hallazgos sugieren que la administración de ARNip sustituido con desoxinucleótido es una estrategia innovadora y estos nanogeles inteligentes con respuesta redox y dirigidos a tumores son muy prometedores para la administración de ARNip y la terapia tumoral.

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen dentro del artículo.

Abreviaturas

APTMS:: 3-aminopropil-trimetoxisilano
DMEM:: Medio Eagle modificado de Dulbecco
DMSO:: Dimetilsulfóxido
FAM:: Amidita de fluoresceína
GE:: Electroforesis en gel
GPSM:: 3-glicidoxipropil-trimetoxisilano
GS NG:: Nanogeles de gelatina reticulados con siloxano
MTT:: Bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazolil-2) -2,5-difeniltetrazolio
ARNi:: Interferencia de ARN
ARNip:: Pequeños ARN interferentes
SPDP:: N -succinimidil 3- (2-piridilditio) -propionato
TDO:: Oligonucleótido de ADN negativo

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