Entrega dirigida de siRNA al cáncer de ovario usando nanocomplejos de óxido de grafeno/PEI funcionalizados con folato

Resumen

La terapia génica emerge como un método válido para el tratamiento del cáncer de ovario, incluyendo el ARN de interferencia pequeño (siRNA). Aunque es muy potente, pocos sistemas de entrega génica eficientes y dirigidos han obstaculizado seriamente el desarrollo de la terapia génica. En este estudio, sintetizamos un nuevo vector génico PEG-GO-PEI-FA mediante la funcionalización del óxido de grafeno (GO), en el cual el ácido fólico (FA) puede unirse específicamente al receptor de folato (FR), sobreexpresado en el cáncer de ovario. Las caracterizaciones de los nanocomplejos se evaluaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS), microscopía de fuerza atómica (AFM) y espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). La capacidad de condensación del siRNA y la estabilidad se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa. La eficiencia de captación celular y la capacidad de escape lisosomal en células de cáncer de ovario se investigaron mediante microscopía confocal de barrido láser. Además, la bioseguridad celular del sistema y la tolerancia inhibitoria del siRNA se evaluaron mediante ensayo CCK-8. El tamaño de los nanocomplejos PEG-GO-PEI-FA fue de 216,1 ± 2,457 nm, exhibiendo citotoxicidad leve en células de cáncer de ovario. Con alta eficiencia de captación, PEG-GO-PEI-FA puede escapar del lisosoma rápidamente y liberar el gen. Además, PEG-GO-PEI-FA/siRNA puede inhibir eficazmente el crecimiento de células de cáncer de ovario. En conjunto, PEG-GO-PEI-FA/siRNA puede ofrecer una estrategia prometedora para la entrega de siRNA en el tratamiento de carcinoma ovárico FR-positivo o tumores similares.

Introducción

El cáncer de ovario es la principal causa ginecológica de muerte en el mundo y generalmente se asocia con malos resultados clínicos debido a las dificultades del diagnóstico y terapia tempranos. Desafortunadamente, los agentes quimioterapéuticos convencionales exhiben limitaciones inherentes como distribución inespecífica, baja biodisponibilidad, rápida eliminación sanguínea y pobre solubilidad en entornos fisiológicos. En las últimas décadas, la terapia génica se ha investigado como un enfoque potencial para el tratamiento de diversos trastornos genéticos, incluyendo cánceres. Sin embargo, la falta de un vector de entrega génica seguro, altamente eficiente y selectivo ha obstaculizado su avance hacia la utilidad clínica. Actualmente, existen dos categorías de vectores génicos: virales y no virales. Aunque los vectores virales han mostrado alta eficiencia de transfección, varios inconvenientes limitan su aplicación clínica, como reacciones inflamatorias inmunes severas y el riesgo de recombinación con virus de tipo salvaje. En contraste, los vectores no virales tienen una amplia capacidad de entrega, baja inmunogenicidad y flexibilidad estructural, lo que los convierte en excelentes alternativas a los vectores virales. Con el rápido desarrollo de la nanotecnología, muchas nanopartículas se han explorado para su uso potencial como vectores de entrega génica. Aquí, este trabajo diseñó un nuevo vector no viral PEG-GO-PEI-FA que puede entregarse eficientemente a tejidos tumorales.

El óxido de grafeno (GO) es un derivado del grafito que se produce mediante oxidación en múltiples pasos, ultrasonido y purificación del grafito. La superficie del GO contiene grupos epóxido, hidroxilo y carboxilo. Los grupos funcionales oxigenados en su superficie dan al GO una excelente biocompatibilidad que le permite formar una suspensión estable en agua y disolventes orgánicos, facilitando modificaciones químicas y funcionalización. Por tanto, el GO se ha utilizado ampliamente para terapia fototérmica del cáncer, entrega de fármacos y genes, y biosensores. El polietilenglicol (PEG) es un material seguro, no tóxico y biodegradable; ha sido aprobado por la FDA de EE. UU. como portador de fármacos hidrofílico. La funcionalización del GO con PEG puede mejorar la estabilidad en condiciones fisiológicas, extender el tiempo de ciclo del nanomaterial GO en el cuerpo y mejorar la farmacocinética del nanomaterial GO para una mejor orientación tumoral. La polietilenimina (PEI) se ha convertido en un estándar de oro de vectores no virales debido a su alta eficiencia de transfección en diversas líneas celulares. Sin embargo, la PEI muestra citotoxicidad severa y pobre biocompatibilidad, limitando sus aplicaciones clínicas. En este estudio, observamos una disminución significativa de la citotoxicidad cuando la PEI se injertó en la superficie del GO. El receptor de folato se sobreexpresa en la superficie de diversas células cancerosas, especialmente en células de cáncer de ovario tanto antes como después de la quimioterapia. Para la entrega génica dirigida, moléculas de ácido fólico se unieron covalentemente al GO para dirigirse a los receptores de folato.

En general, el objetivo principal del presente estudio fue explorar un nuevo sistema de entrega génica basado en GO dirigido para aumentar la utilidad de la terapia génica basada en siRNA para el cáncer de ovario. El PEG-GO-PEI-FA cargado positivamente obtenido pudo cargarse con siRNA para la entrega génica. Su síntesis exitosa, caracterización, internalización celular efectiva y efecto anticancerígeno in vitro se analizaron mediante diversas técnicas. Además, la seguridad de este sistema también se evaluó in vitro.

Materiales y Métodos

Materiales

El óxido de grafeno se obtuvo de Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, China). Ácido fólico (FA), N-hidroxisuccinimida (NHS) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) se adquirieron de Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, China). PEI ramificado 25K, PEG (PM = 2000), agarosa y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida (EDC·HCL) se compraron en Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Solución fosfato tamponada (PBS), salina fosfato tamponada de Dulbecco (DPBS) y todos los demás reactivos se adquirieron de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Todos los demás reactivos eran de grado analítico. Medio RPMI-1640 (Gibco), suero fetal bovino (FBS) (Gibco), tripsina (Gibco) y tampón TAE 20× se compraron en Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China). Kit de conteo celular 8 (CCK-8) se adquirió en Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China). LysoTracker Red, paraformaldehído al 4 %, 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y reactivos de transfección Lipofectamine 2000 se compraron en Invitrogen Co. Ltd. (China). Sonda de fluorescencia Dil (número de catálogo: C1036) se adquirió en Beyotime Co. Ltd. ARN de interferencia pequeño anti-PLK1 (PLK1-homo-581) (siRNA) fue sintetizado por Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Preparación de PEG-GO-PEI-FA

La síntesis de PEG-GO-PEI-FA sigue la estrategia mostrada en la Figura S2 (A). Primero, 10 mL de suspensión acuosa de GO (1000 μg/mL) se sonicaron continuamente en baño a 50 W durante 2 h. Luego, se añadieron 1 mL de EDC·HCL (5000 μg/mL) y NHS (5000 μg/mL) y se sonicaron intermitentemente durante 30 min a 100 W, seguido de la adición de PEG (10 mg) sonicado durante 30 min y agitado en agitador magnético durante 6 h a 0 °C. Para eliminar reactivos no reaccionados y obtener la solución GO-PEG, la mezcla se dializó durante 24 h en agua destilada con una membrana de diálisis (PMCO, 3500 Da). Luego, la solución GO-PEG se sonicó durante 30 min, se añadieron 1 mL de EDC·HCL (5000 μg/mL) y NHS (5000 μg/mL) y se sonicó durante 30 min nuevamente, seguido de la adición de PEI 25K (5000 μg/mL) 2 mL. La mezcla se sonicó durante 30 min y se agitó durante 6 h a 0 °C. Posteriormente, para obtener PEG-GO-PEI, la mezcla se dializó durante 24 h en agua destilada con una membrana de diálisis (PMCO, 3500 Da) nuevamente. La solución PEG-GO-PEI se sonicó durante 60 min, se añadieron 1 mL de EDC·HCL (5000 μg/mL) y NHS (5000 μg/mL) y se sonicó durante 30 min nuevamente, seguido de la adición de 10 mg FA a la solución. La solución se sonicó durante 30 min y se agitó durante 12 h a 0 °C y se dializó durante 48 h para obtener PEG-GO-PEI-FA según el procedimiento anterior. La solución de nanocomplejos se secó por liofilización al vacío (Biosafer-10D).

Caracterización

El potencial zeta superficial y el tamaño de partícula promedio de los nanocomplejos en solución acuosa se midieron mediante dispersión dinámica de luz (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, Reino Unido). Las morfologías de los nanocomplejos se observaron usando microscopio de fuerza atómica en atmósfera (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Alemania). Los espectros de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) se adquirieron mediante espectrógrafo FTIR Thermo Nicolet 6700, usando pastilla de KBr en el rango de 400–4000 cm⁻¹. Los espectros de absorción UV-Vis de los nanocomplejos se midieron mediante espectrofotómetro UV-Vis (UV, EV300, EE. UU.). El Raman de los nanocomplejos se midió mediante microscopio Raman dispersivo (Senterra R200-L, Alemania) con longitud de onda de excitación a 532 nm.

Ensayo de Bioseguridad In Vitro

Las células SKOV3 (células humanas de cáncer de ovario) se adquirieron de Keygen (China). Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640, suplementado con 10 % FBS, 100 U/mL penicilina, 100 g/mL estreptomicina, y cultivadas a 37 °C en atmósfera humificada con 5 % CO₂. En este estudio, la citotoxicidad de los materiales se analizó en células SKOV3 mediante ensayo CCK-8. Brevemente, las células se sembraron en placa de 96 pozos a una densidad de 6 × 10³ células/pozo en 100 μL de medio 1640 con 10 % FBS e incubadas a 37 °C durante 12 h en atmósfera humificada con 5 % CO₂. Luego, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA se añadieron a concentraciones finales de 10 a 1000 μg/mL e incubaron con las células durante 12 h adicionales. Por otro lado, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA se incubaron con diferentes tiempos de 4 a 24 h a concentraciones de 100 μg/mL. Posteriormente, se añadieron 10 μL de CCK-8 a cada pozo e incubaron durante 3 h adicionales a 37 °C. Después, la absorbancia a 450 nm se midió en un lector de microplacas. Cada experimento de grupo se repitió tres veces. La viabilidad celular relativa (%) respecto a células control cultivadas en medio se calculó como (absorbancia de muestra − absorbancia de blanco)/(absorbancia de control − absorbancia de blanco) × 100 %.

Ensayo de Retardación en Gel de Agarosa

La solución tampón TAE 20× se diluyó con agua tratada con DEPC para hacer solución de agarosa al 1 %. Luego, la solución se calentó 5 min en horno de microondas para disolver completamente la agarosa. Cuando la temperatura de la solución de agarosa bajó a 55 °C, se añadió solución de bromuro de etidio (EB, 0,5 μg/mL) en proporción de volumen 10.000:1 y se mezcló uniformemente; posteriormente, la solución de agarosa se enfrió para formar gel de agarosa. La mezcla de PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA y siRNA en diferentes proporciones de peso se añadieron al pozo. El gel corrió a 110 V y 40 mA durante unos 60 min, y luego se observó y analizó mediante imagenador ultravioleta.

Estudios de Captación Celular de PEG-GO-PEI-FA

Para investigar la captación celular, los nanocomplejos se marcaron con FITC según método descrito previamente con una pequeña modificación. Brevemente, la solución de nanocomplejos (aproximadamente 1 mg/mL, 2,0 mL) se mezcló con 0,2 mL de FITC (26 mM) disuelto en DMSO y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Las mezclas resultantes se dializaron a través de membrana de 5000 PMCO para eliminar FITC no marcado y luego se liofilizaron. Las células se sembraron en placa de 6 pozos (con cubreobjetos) a una densidad de 2 × 10⁵ células/pozo en 2 mL de medio 1640 con 10 % FBS e incubadas a 37 °C durante 12 h en incubadora de cultivo celular. Luego, el medio en cada pozo se reemplazó con medio 1640 sin suero. Posteriormente, las células se trataron con diferentes nanocomplejos/FITC. Las células tratadas sin nanocomplejos son el grupo control, y las células tratadas con PEI 25K son el grupo control paralelo. Tras incubación durante 4 h a 37 °C en atmósfera humificada con 5 % CO₂, se retiró el líquido de la placa de cultivo, las células se lavaron dos veces con DPBS frío (pH = 7,4), luego se añadieron 20 μL de DAPI y 5 μL de Dil (tinte de membrana citoplasmática) a cada pozo e incubaron 20 min a 37 °C en oscuridad. Posteriormente, se retiraron el DAPI y Dil del medio de cultivo y se lavaron dos veces con DPBS frío (pH = 7,4), y los cubreobjetos de células se retiraron y fijaron en portaobjetos con medio de montaje Permount TM. Finalmente, la señal de fluorescencia de los portaobjetos de células se observó mediante Microscopía Confocal de Barrido Láser (CLSM) y se analizó la captación celular de nanocomplejos.

Escape Endosomal y Penetración al Núcleo

Para visualizar la distribución celular, escape endosomal y penetración de nanocomplejos, las células SKOV3 se sembraron en placa de 12 pozos (con cubreobjetos) a una densidad de 1 × 10⁵ células/pozo en 2 mL de medio 1640 con 10 % FBS e incubaron durante 12 h (37 °C, 5 % CO₂). Luego, el medio en cada pozo se reemplazó con 1 mL/pozo de medio 1640 sin suero. Posteriormente, los diferentes nanocomplejos (100 μg/mL) marcados con FITC se añadieron en placa de 12 pozos para 1 mL/pozo. Tras 6 h, se retiró el líquido, las células se lavaron dos veces con DPBS frío (pH = 7,4), y la placa de 12 pozos se añadió LysoTracker Red (5 μg/mL) para 50 μL/pozo. Tras incubación durante 15 min a 37 °C en atmósfera humificada con 5 % CO₂, se retiró el líquido de la placa de 12 pozos, las células se lavaron dos veces con DPBS frío (pH = 7,4), luego se añadieron 20 μL de DAPI a cada pozo e incubaron 20 min a 4 °C en oscuridad. A continuación, se retiró el líquido de DAPI y se lavaron dos veces con DPBS frío (pH = 7,4). Después, se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min a temperatura ambiente, y los cubreobjetos se retiraron y fijaron en portaobjetos con medio de montaje Permount TM. La señal de fluorescencia de los portaobjetos se observó mediante microscopía confocal de barrido láser y se analizó el escape lisosomal y la penetración al núcleo de los nanocomplejos.

Análisis de Inhibición Citotóxica

Analizamos el efecto de inhibición celular de PEG-GO-PEI/siRNA y PEG-GO-PEI-FA/siRNA usando el ensayo CCK-8. Brevemente, las células se sembraron en placa de 96 pozos a una densidad de 6 × 10³ células/pozo en 100 μL de medio 1640 con 10 % FBS e incubaron a 37 °C durante 12 h en atmósfera humificada con 5 % CO₂. Luego, PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA se añadieron a concentraciones finales de 10 a 500 μg/mL e incubaron con las células durante 12 y 24 h adicionales. Luego, PEG-GO-PEI/siRNA y PEG-GO-PEI-FA/siRNA se incubaron con células de 4 a 48 h a una concentración de 100 μg/mL. El siRNA se transfirió con Lipofectamine 2000 y sin tratar como grupo control. Posteriormente, se añadieron 10 μL de CCK-8 a cada pozo e incubaron durante 3 h adicionales a 37 °C. La absorbancia se midió a 450 nm. Cada experimento de grupo se repitió tres veces. La tasa de inhibición (%) se calculó como 1 − (absorbancia de muestra − absorbancia de blanco)/(absorbancia de control − absorbancia de blanco) × 100 %.

Estadísticas

Cada prueba experimental se repitió tres veces, y los datos se analizaron usando software SPSS 17.0. Se usó prueba ANOVA de un sentido para análisis de múltiples grupos y prueba t de Student no pareada para análisis de dos grupos para comparación. Los datos se expresaron como media y desviación estándar (DE), y la significancia estadística se estableció en p < 0,05.

Resultados y Discusión

Síntesis de PEG-GO-PEI-FA

La expresión de FR se analizó primero en diferentes líneas de células cancerosas basándose en la base de datos Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; https://portals.broadinstitute.org/ccle) y diferentes tejidos de ovario basándose en la base de datos Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA2; https://gepia2.cancer-pku.cn). Los resultados fueron consistentes con investigaciones previas (Figura S1). Por tanto, elegimos FA como ligando de dirección para la entrega génica.

El óxido de grafeno ciertamente lleva muchos grupos que contienen oxígeno, incluyendo carboxilos en los bordes, hidroxilos y grupos epóxido en el plano basal producidos por el proceso de oxidación. Para obtener GO a nanoescala (NGO), el GO se fragmentó continuamente por sonicación en baño a 50 W durante 2 h y luego se siguió por enlace covalente de PEG/PEI/FA al GO usando química EDC/NHS, como se ilustra en la Figura S2(A). La Figura S2(B) mostró la ruta de tratamiento del PEG-GO-PEI-FA/siRNA. El análisis de la conjugación química se realizó mediante tecnología de espectros diferenciales FTIR para obtener los picos de absorción espectral. Como se muestra en la Fig. 1a, la existencia de OH (3425 cm⁻¹), C=O (1719 cm⁻¹) y C=H (1350 cm⁻¹) grupos funcionales se encontraron en GO e indicaron la existencia de hidroxilo y carboxilo en la superficie del GO. La banda de vibración de estiramiento CH (2885 cm⁻¹) se pudo encontrar cuando el PEG reaccionó con GO mediante enlaces covalentes estables; esto indicó que el PEG se había injertado al GO, y la eficiencia de conjugación de PEG fue de aproximadamente 6 %. Tras la reacción de PEI y FA con GO, se observó la banda de vibración de estiramiento NH (1590 cm⁻¹), C–N (1420 cm⁻¹), indicando que PEI y FA se habían injertado al GO por esterificación. Estos resultados demostraron que la conjugación PEG-GO-PEI-FA se había sintetizado exitosamente.

La Fig. 1b mostró los espectros de absorción UV-Vis de GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA. El GO tuvo un pico de absorción a 223 nm. El FA tuvo un pico de absorción a 275 nm. El GO-PEG mostró una curva suave, indicando que el PEG se había conjugado con GO y hizo la montaña de GO más suave. El PEG-GO-PEI tuvo un pico de absorción en 219 nm, ilustrando que la PEI se había injertado en la superficie del GO-PEG. El PEG-GO-PEI-FA tuvo un pico de absorción en 219 nm y 275 nm, revelando que el FA se había injertado al PEG-GO-PEI. Todos estos resultados demostraron aún más la síntesis exitosa de PEG-GO-PEI-FA.

Caracterización de PEG-GO-PEI-FA

Los datos de la Tabla 1 mostraron el tamaño de partícula y potencial zeta de los nanocomplejos. El tamaño de partícula de los nanocomplejos aumentó gradualmente a 218,4 nm mientras PEG, PEI y FA se injertaban progresivamente en la superficie del GO. El potencial zeta cambió de −16,5 a +17,5 mV cuando la PEI se conectó al GO, lo que facilitó la capacidad de adsorber ADN o ARN cargados negativamente mediante interacción electrostática y captación celular. Los potenciales zeta de PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA/siRNA fueron +14,7 mV y +14,5 mV, respectivamente. Los potenciales zeta revelaron que PEG-GO-PEI-FA o PEG-GO-PEI-FA/siRNA eran menores que PEG-GO-PEI debido a la carga negativa de FA y siRNA. Esto indicó que PEG-GO-PEI-FA/siRNA podría adsorberse a la superficie de las células por interacción de carga y ser utilizado por endocitosis mediada por receptores en la citomembrana.

La morfología superficial y el tamaño de partícula del nanotransportador también se midieron mediante AFM y DLS. Como se muestra en la Fig. 2a, el GO mostró una superficie lisa y estructura en lámina con un tamaño de partícula de 192,1 nm. Tras el injerto de PEG, PEI y FA en la superficie del GO, el tamaño de partícula de PEG-GO-PEI-FA aumentó a 216,1 nm, y se observaron muchas protuberancias en la superficie de PEG-GO-PEI-FA (Fig. 2b), sugiriendo que un gran número de decoraciones se inmovilizaron en las láminas de GO. Al mismo tiempo, la altura de PEG-GO-PEI-FA fue mayor que la de GO, lo cual se debe principalmente a la unión de PEG, PEI y FA en ambos planos de la lámina de GO.

La espectroscopía Raman es uno de los métodos más utilizados para medir la caracterización y propiedades estructurales de materiales de nanocarbono. Como se muestra en la Fig. 2c, el espectro Raman de GO mostró la banda de vibración a 1600 cm⁻¹ (banda G) y 1354 cm⁻¹ (banda D), y la relación de área ID/IG fue 1,0385, indicando que la parte de hibridación SP² del GO se había roto y formado hidroxilo y carboxilo. GO-PEG y PEG-GO-PEI mostraron la banda de vibración a 1595 cm⁻¹ (banda G) y 1352 cm⁻¹ (banda D), y las relaciones de área ID/IG fueron 0,7737 y 0,5238. La relación de área ID/IG se redujo gradualmente tras la reacción de PEG y PEI con el GO; esto indicó que el PEG y la PEI se habían injertado en la superficie del GO.

Análisis de Bioseguridad In Vitro de los Diferentes NGO Funcionales

El problema de bioseguridad de los vectores génicos no virales ha permanecido como un desafío significativo para las aplicaciones clínicas. Las altas cargas positivas no solo aportaron una excelente capacidad para condensar y proteger genes, sino que también provocaron citotoxicidad severa. Para probar la citotoxicidad de los nanocomplejos de siRNA libre, se realizó el ensayo CCK-8 con células SKOV3 que habían sido incubadas durante 4, 8, 12 y 24 h con nanocomplejos libres a diferentes concentraciones (de 10 a 1000 μg/mL). Como se muestra en la Figura S3, los nanocomplejos aún tenían alta viabilidad celular en cáncer de ovario a 1000 μg/mL y 24 h. La citotoxicidad de todos los nanocomplejos mostró un modo dependiente del tiempo y la concentración (viabilidad de células SKOV3: mayor o igual a 84,38 % para todos los nanocomplejos a 1000 μg/mL, y mayor o igual a 94,21 % para todos los nanocomplejos a 24 h con células SKOV3). Estos resultados sugirieron que los nanocomplejos mostraron citotoxicidad despreciable y podrían servir como vector génico biocompatible.

Análisis de Nanocomplejos Combinados con siRNA

La captación celular de moléculas de ARN libre suele ser difícil debido a las cargas negativas sustanciales que portan. La carga de biomoléculas cargadas negativamente por polímeros catiónicos se adopta ampliamente para resolver el problema. En este artículo, la carga de siRNA en el vector PEG-GO-PEI-FA se logró mezclando siRNA y PEG-GO-PEI-FA en solución acuosa. Como se muestra en la Tabla 1, el potencial zeta de PEG-GO-PEI-FA fue +14,7 mV, indicando que el siRNA puede adsorberse en la superficie de PEG-GO-PEI-FA por interacción electrostática. En este estudio, la capacidad de condensación génica de los nanocomplejos se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa. La Fig. 3a mostró que PEG-GO-PEI tenía evidente capacidad de condensación hacia siRNA a una proporción de peso de 10, mientras que la retardación completa de la migración de siRNA por PEG-GO-PEI-FA se observó cuando la proporción de peso alcanzó 20 (Fig. 3b). Por tanto, PEG-GO-PEI-FA podría proteger el siRNA de la degradación pero, al mismo tiempo, necesita un poco más de nanocomplejo para demostrar buena capacidad de unión. Esto puede asociarse con los potenciales zeta de PEG-GO-PEI-FA que no eran tan altos. Estos resultados indicaron que PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA tenían suficiente capacidad de entrega, especialmente PEG-GO-PEI-FA, que además exhibió su potencial como vector válido para la entrega eficiente y segura de genes.

Análisis de Captación Celular

Es crucial que los transportadores puedan dirigirse específicamente a tumores para la entrega génica. Para confirmar si el transportador PEG-GO-PEI-FA podía entrar fácilmente en las células, usamos FITC como sonda fluorescente para imagen intracelular. Al mismo tiempo, los núcleos se tiñeron con DAPI y la citomembrana con Dil. Como se muestra en la Fig. 4, el grupo control y el grupo PEG-GO-PEI no mostraron señales de fluorescencia verde alrededor de los núcleos y la citomembrana. Esto implicó que PEG-GO-PEI no entró en las células. La PEI 25K y PEG-GO-PEI-FA/siRNA aparecieron como señal de fluorescencia verde alrededor del núcleo, lo que demostró claramente que PEG-GO-PEI-FA podía penetrar membranas celulares y entrar en las células. Los nanocomplejos PEG-GO-PEI-FA mostraron la captación celular más activa, tal vez atribuible a que el FA puede unirse específicamente al FR sobreexpresado en la superficie de células SKOV3. Estos resultados sugirieron que el FA jugó un papel crítico en la mediación de la captación celular eficiente de los nanocomplejos PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA/siRNA. Lo más importante, la capacidad del FA para unirse a su receptor no se vio afectada por el enlace amida covalente, y la endocitosis mediada por receptor no se vio obstaculizada.

Análisis de Escape Lisosomal

Para el sistema de entrega de siRNA, deben escapar del endosoma o lisosoma formado. Sin embargo, si no lo hacen, el siRNA se degradará o drenará fuera de la célula. Evaluamos la capacidad de escape endosomal mediante localización intracelular de los nanocomplejos usando CLSM. Dado que muchos informes han demostrado que la PEI 25K puede favorecer el escape endosomal o lisosomal por "efecto esponja de protones", se usó PEI 25K como control. En este estudio, los nanocomplejos se marcaron con FITC. Primero, estimamos que los nanocomplejos entraron en el lisosoma por la señal amarilla que la señal fluorescente verde de FITC superponía con la señal fluorescente roja de LysoTracker Red. La PEI 25K apareció como señal amarilla tras incubación durante 4 h con células y otros materiales aparecieron como señal amarilla tras incubación durante 2 h con células, implicando que los materiales habían entrado en las células (Fig. 5). Si los nanocomplejos escapan del lisosoma por la señal cian brillante, la señal fluorescente verde de FITC se combina con la señal fluorescente azul de DAPI. Como se muestra en la Fig. 5a, la señal verde se observó en la acumulación en los núcleos, y hubo una señal cian brillante tras incubación de PEI/siRNA durante 8 h con células, indicando que PEI/siRNA había escapado del lisosoma. Sin embargo, PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA/siRNA tuvieron algunas señales verdes débiles para penetrar los núcleos tan temprano como 2 h, y más señal verde se acumuló en los núcleos junto con el aumento del tiempo de incubación. Y hubo una señal cian brillante cuando PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA/siRNA se incubaron durante 4 h con células (Fig. 5b, c). Esto indicó que los materiales habían escapado del lisosoma tan temprano. En una palabra, estos resultados mostraron que PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA/siRNA mantuvieron una excelente capacidad de escape endosomal o lisosomal y pueden facilitar eficientemente el escape lisosomal y la transfección génica in vitro.

Evaluación de Inhibición Celular de PEG-GO-PEI-FA/siRNA

En el caso actual, el efecto terapéutico de PEG-GO-PEI-FA/siRNA se examinó mediante ensayo CCK-8 en células SKOV3 in vitro. Como se muestra en la Fig. 6a, no encontramos influencia significativa en la tasa de supervivencia de células tumorales a diferentes concentraciones (10–100 μg/mL) y diferentes puntos de tiempo (12 y 24 h) en el grupo PEG-GO-PEI-FA. Incluso cuando la concentración superó 100 μg/mL, la tasa de supervivencia de células tumorales fue aún superior al 80 %. Por tanto, elegimos 100 μg/mL para el próximo estudio de inhibición celular. Se exhibió citotoxicidad más débil en el grupo PEG-GO-PEI/siRNA y Lipo2000/siRNA (tasa de inhibición inferior al 20 %). Comparado con PEG-GO-PEI/siRNA y Lipo2000/siRNA, PEG-GO-PEI-FA/siRNA tuvo un efecto inhibitorio significativo en el crecimiento de células tumorales SKOV3. PEG-GO-PEI-FA/siRNA inhibió células SKOV3 de manera dependiente del tiempo (Fig. 6b). Estos resultados indicaron que PEG-GO-PEI-FA/siRNA tuvo el mejor efecto de inhibición para el incremento de células tumorales y podríamos usar PEG-GO-PEI-FA como nanotransportador ideal para la entrega génica.

Conclusiones

En este estudio, sintetizamos exitosamente un nuevo sistema de entrega génica, PEG-GO-PEI-FA. La no citotoxicidad por sí misma y la excelente compatibilidad biológica de PEG-GO-PEI-FA garantizaron sus perspectivas como vector de entrega génica seguro y efectivo. Los nanocomplejos PEG-GO-PEI-FA/siRNA exhibieron propiedades físico-químicas sobresalientes para la entrega génica dirigida. Además, PEG-GO-PEI-FA/siRNA pudo entrar fácilmente en células de cáncer de ovario SKOV3 y escapar de los lisosomas. El ensayo de citotoxicidad demostró que PEG-GO-PEI-FA/siRNA tuvo un buen efecto de inhibición en células de cáncer de ovario de manera dependiente del tiempo, y exhibió un efecto citotóxico más alto comparado con otros grupos. Sobre la base de los resultados mencionados, PEG-GO-PEI-FA puede proporcionar buena expectativa como vector génico para entrega génica dirigida y estrategia más efectiva en tratamientos de carcinoma ovárico.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio están incluidos en este artículo publicado y sus archivos de información suplementaria.

Abreviaturas

AFM:

Microscopio de fuerza atómica

CCK-8:

Kit de ensayo colorimétrico de proliferación celular

CCLE:

Enciclopedia de líneas celulares de cáncer

CLSM:

Microscopio confocal de barrido láser

DAPI:

4'-6-Diamidino-2-fenilindol

DLS:

Dispersión dinámica de luz

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DPBS:

Salina fosfato tamponada de Dulbecco

EB:

Bromuro de etidio

EDC·HCL:

Clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida

FA:

Ácido fólico

FBS:

Suero fetal bovino

FITC:

Isotiocianato de fluoresceína

FTIR:

Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier

FR:

Receptor de folato

GEPIA:

Análisis interactivo de perfil de expresión génica

GO:

Óxido de grafeno

MWCO:

Corte de peso molecular

NGO:

Óxido de grafeno a nanoescala

NHS:

N-hidroxisuccinimida

NPs:

Nanopartículas

PBS:

Solución fosfato tamponada

PDI:

Índice de polidispersidad

PEG:

Polietilenglicol

PEI:

Polietilenimina

siRNA:

ARN de interferencia pequeño