Herramientas de bioimagen basadas en microcápsulas de polielectrolito codificadas con nanopartículas semiconductoras fluorescentes:diseño y caracterización de las propiedades fluorescentes

Métodos

El objetivo, el diseño y el entorno del estudio

Fabricación de microcápsulas de polielectrolito codificadas en QD

Los QD de CdSe / ZnS (núcleo / capa) con un máximo de fluorescencia a 590 nm recubiertos con óxido de trioctilfosfina (TOPO) fueron sintetizados por el Dr. P. Samokhvalov en el Laboratorio de Nano-Bioingeniería de NRNU MEPhI (Moscú, Rusia). La purificación y solubilización QD se llevaron a cabo como se describe anteriormente [20, 21]. El TOPO se eliminó de la superficie de QD disolviendo los QD en cloroformo y precipitándolos posteriormente con metanol; el procedimiento se repitió tres veces. Después de eso, los QD se disolvieron de nuevo en cloroformo y se precipitaron con una solución de cisteína en metanol en una relación de masa de QD a cisteína de 1:0,13. El precipitado QD se lavó del exceso de cisteína con metanol y se secó en un concentrador de vacío. Las QD secas se resuspendieron en agua con la adición de hidróxido de sodio 0,1 M. Posteriormente, la dispersión se sonicó mediante un baño de ultrasonidos y se filtró (tamaño de poro, 0,22 µm). A la dispersión resultante, se añadió un derivado de tiol de PEG que contenía un grupo carboxilo terminal en una relación de masa de 1:4,6. La mezcla se incubó durante la noche a 4 ° C y las QD PEGiladas se purificaron usando cromatografía de filtración en gel . El contenido de QD de las muestras obtenidas se determinó espectrofotométricamente a la longitud de onda del primer excitón. Los QD solubilizados se caracterizaron por el diámetro hidrodinámico y el potencial ζ utilizando dispersión de luz dinámica y microelectroforesis láser Doppler mediante Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Unido).

La codificación de QD se realizó utilizando una técnica modificada de deposición capa por capa de polímeros de policatión y polianión cargados de manera opuesta, así como QDs solubles en agua funcionalizados con derivados de tiol carboxilados de PEG, sobre la superficie de micropartículas de carbonato de calcio obtenidas como se describió anteriormente. [22]. Las capas de polielectrolito polimérico se formaron a partir del policatión poli (clorhidrato de alilamina) (PAH) y el polianión poli (4-estirenosulfonato de sodio) (PSS) o ácido poliacrílico (PAA); los fluoróforos eran CdSe / ZnS QDs PEGilados solubles en agua con un pico de fluorescencia a una longitud de onda de 590 nm, un potencial ζ de -26,7 ± 0,8 mV y un diámetro hidrodinámico de 18,7 a 23,3 nm. Durante la microcápsula codificada por QD, el proceso de fabricación después de cada depósito de capa, la carga superficial de la micropartícula (potencial ζ) se controló mediante microelectroforesis láser Doppler.

Las micropartículas de carbonato de calcio se resuspendieron en agua ultrapura y se añadieron 0,5 ml de una solución de PAH 2 mg / ml en NaCl 0,5 M. La suspensión se sonicó en un baño de ultrasonidos y se incubó durante 20 min mientras se agitaba a temperatura ambiente. Después de eso, el exceso de polímero se lavó mediante centrifugación seguido de resuspensión en agua MilliQ. Para aplicar la siguiente capa, que consiste en el polianión polimérico, las microperlas se resuspendieron en 0.5 mL de agua ultrapura, y la suspensión se mezcló con 0.5 mL de una solución de PSS de 2 mg / mL en NaCl 0.5 M, sonicada en un baño de ultrasonidos para 60 s, se incubó durante 20 min mientras se agitaba a temperatura ambiente y se lavó del exceso de polímero como se describió anteriormente. El lavado de las micropartículas después de cada etapa de aplicación del polielectrolito se repitió tres veces. Antes de la codificación, se aplicaron cinco capas de polielectrolito sobre las micropartículas de carbonato de calcio, la quinta capa consistía en el policatión. Después de eso, se agregaron QD solubilizados y la mezcla se incubó mientras se agitaba permanentemente durante 80 min. Luego, se aplicaron seis capas sucesivas de polímeros cargados de manera opuesta, la sexta consistente en polianión PSS o PAA. Se obtuvieron microcápsulas huecas de polielectrolito codificadas con QD disolviendo los núcleos de carbonato de calcio de las microperlas sin cáscara resultantes lavándolas con 0,2 M de etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA) (pH 6,5). Después de eso, la superficie de la microcápsula se modificó adicionalmente con albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-Aldrich, EE. UU.) Dispersando las micropartículas en una solución tampón de fosfato 50 mM (pH 7,4) que contenía 1% de BSA y posteriormente se incubaron a 4 ° C. durante 12 h en la oscuridad. Poco antes de su uso, la suspensión de microcápsulas huecas se lavó del exceso de BSA cinco veces con una solución tampón de fosfato 50 mM (pH 7,4). Las microcápsulas de polielectrolito obtenidas se almacenaron a 4 ° C en la oscuridad.

Microscopias ópticas y de fluorescencia de las microcápsulas de polielectrolito codificadas en QD

La morfología y la distribución de tamaño de las micropartículas se analizaron mediante microscopía óptica y de fluorescencia. Para estimar la distribución de tamaño de las micropartículas, fijamos 5 μL de la suspensión de micropartículas en 10 μL de glicerol al 50% en un portaobjetos. Las muestras se examinaron mediante un microscopio Axio Observer 3 (Carl Zeiss, Alemania) con una lente LD A-Plan 40x / 0.55 M27 en un campo de luz. Las imágenes fluorescentes se obtuvieron utilizando un iluminador de mercurio HBO 100 (Burner Mercury) con un conjunto de filtros de paso largo XF115-2 FITC, que incluye un filtro dicroico 505DRLP, un filtro de excitación 475AF40 y un filtro de emisión 510ALP (Omega Optical, EE. UU.), Un plan EC -Lente Neofluar 100x / 1.30 Oil Iris M27 (WD =0.20 mm), una apertura numérica ajustable de 0.7 a 1.3, y aceite de inmersión Immersol 518F (Carl Zeiss, Alemania).

Las características morfológicas de las microcápsulas obtenidas se estudiaron en secciones de las microcápsulas de polielectrolito codificadas ópticamente con una superficie libre de BSA fijadas en medio de incrustación epoxi. Para ello, la suspensión de microcápsulas se deshidrató secuencialmente con soluciones acuosas de etanol al 30, 50, 70 y 95% y luego se trató con etanol absoluto (Acros Organics, EE. UU.) Tres veces para asegurar una deshidratación completa. Cada etapa de deshidratación duró 15 minutos. Las muestras deshidratadas de microcápsulas se transfirieron a una mezcla de epoxi-etanol 1:1 durante 12 hy luego a una mezcla de epoxi-etanol 3:1 durante 3 h. Luego, las muestras se transfirieron a un medio epóxico de incrustación limpio y los bloques de epoxi se polimerizaron a 45 ° C durante 12 hya 60 ° C durante 72 h. A continuación, se cortaron secciones de 150 nm de estos bloques que contenían microcápsulas de polielectrolito codificadas por QD fluorescentes mediante un ultramicrótomo Leica EM UC6 (Leica Microsystems, Austria) equipado con un cuchillo de diamante Ultra AFM 35 (Diatome, Suiza) de 2,0 mm de ancho. Las secciones se transfirieron a un portaobjetos y se examinaron bajo un microscopio fluorescente Axio Vert.A1 (Carl Zeiss, Alemania) utilizando un iluminador de mercurio HBO 100 (Burner Mercury) para excitación y un juego de filtros fluorescentes TexasRed de 45 HQ ( d =25 cambio libre (E), un BP de excitación 560/40, un divisor de haz FT 585 y un BP de emisión 630/75) (Carl Zeiss, Alemania) para registrar la fluorescencia. Se obtuvieron imágenes fluorescentes usando una lente Carl Zeiss EC Plan-Neofluar100x / 1.30 Oil Ph3 y aceite de inmersión Immersol 518F (Carl Zeiss, Alemania). Las imágenes se analizaron y procesaron con el software Zen (Carl Zeiss, Alemania) e Image J 1.48 v (EE. UU.).

Características de fluorescencia de las microcápsulas codificadas en QD

Las características de fluorescencia de las QD originales utilizadas para codificar y las microcápsulas codificadas por QD se analizaron utilizando un lector de placas multimodal Infinite 200 PRO (TECAN, Suiza). Antes de las mediciones, la placa con pocillos que contenían suspensiones de microcápsulas y microesferas codificadas por QD se centrifugó utilizando una centrífuga 5810 R (Eppendorf, EE. UU.) Con un rotor А-2-DWP a 2630 × g durante 20 min. Los máximos de fluorescencia de QD libres y QD incrustados en la cubierta de polímero de las microcápsulas de polielectrolito se determinaron a una longitud de onda de excitación de 480 nm; Se utilizó el modo de escaneo inferior para el análisis de las muestras.

Citometría de flujo

Se utilizó un citómetro de flujo FACSCanto II (Becton Dickinson, EE. UU.) Equipado con un láser de argón azul (488 nm) como fuente de excitación para analizar las muestras de las micropartículas de carbonato cálcico originales, las micropartículas con la cubierta de polielectrolito que contiene QD y el Microcápsulas huecas codificadas por QD. Analizamos alícuotas de 0,5 ml de una suspensión que contenía 10 ⁶ microperlas / microcápsulas; el número de eventos recopilados fue 2500. La intensidad de la fluorescencia se registró en los canales estándar de luz dispersa hacia adelante (FSC), luz de dispersión lateral (SSC) y ficoeritrina (PE, 585/42 nm). Los datos se procesaron utilizando el software FACSDiva (Becton Dickinson, EE. UU.).

Materiales

Usamos derivados de tiol carboxilados de PEG que contienen un espaciador de PEG de 12 monómeros (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), Poli (clorhidrato de alilamina) (PAH) con Mw ≈ 15.000 Da (Sigma-Aldrich, Japón), poli (4-estirenosulfonato de sodio) (PSS) con Mw ≈ 70.000 Da (Sigma-Aldrich, EE. UU.) Y ácido poliacrílico (PAA) con Mw ≈ 15.000 Da (Sigma-Aldrich, EE. UU.). El carbonato de sodio, el cloruro de calcio, la sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético deshidratada, la albúmina de suero bovino (BSA), el medio de inclusión epoxi y otros reactivos eran de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Todas las soluciones de trabajo se prepararon con agua MilliQ (18,2 mΩ cm) obtenida mediante un sistema de purificación de agua Direct-Q (Millipore, Francia) y se filtraron a través de filtros con un tamaño de poro de 0,22 μm.

Análisis estadístico

Se utilizaron los paquetes de software MS Office Excel 2007 y Origin Pro 2015 para el análisis estadístico de los datos. Los resultados se presentan como las medias y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes.

Resultados y discusión

Desarrollo de microcápsulas de polielectrolito codificadas en QD

Usamos la técnica de deposición capa por capa para obtener agentes de bioimagen en forma de micropartículas fluorescentes codificadas por QD porque el método sugerido no requería solventes orgánicos, permitía el uso de polímeros biocompatibles [23, 24] y aseguraba una inmovilización eficiente de QD dentro de la capa de polímero [21]. La fabricación de microcápsulas de polielectrolito fluorescente codificadas ópticamente con QD modificadas en la superficie, solubles en agua, consiste en la aplicación de cinco capas de polielectrolito con carga opuesta sobre la superficie de micropartículas de carbonato de calcio que sirven como matrices como primer paso, seguido de la codificación de la capa de polielectrolito con negativamente QD cargados, recubriendo la capa de QD con capas protectoras de polielectrolitos cargados de manera opuesta, disolución de la matriz central de la micropartícula y, finalmente, modificación de la superficie de la microcápsula con BSA (Fig. 1). La carga superficial negativa de las micropartículas de carbonato de calcio asegura la adsorción de HAP debido a la interacción electrostática del policatión con la superficie de la micropartícula. El potencial ζ positivo de la superficie resultante de la adsorción de PAH sobre las partículas permite la aplicación posterior del polianión PSS, así como QD modificados con HS-PEG ₁₂ -COOH, que también tiene una carga superficial negativa debido al grupo carboxilo y, por lo tanto, puede adsorberse sobre la capa de policatión de PAH. La incrustación de los QD en la membrana de polielectrolito polimérico se realiza aplicando capas de polielectrolito de cobertura adicionales (al menos de cuatro a seis de ellas), como se muestra en la Fig. 1a, b.

El diseño y estructura de las microcápsulas de polielectrolito codificadas con puntos cuánticos (QD): a Un diagrama esquemático de la disposición de las capas en la membrana de microcápsulas de polímero. b Cambios en el potencial ζ de la superficie de las micropartículas de carbonato de calcio durante la formación de capas de electrolitos poliméricos y la codificación QD. c Una microfotografía fluorescente de las microcápsulas de polielectrolito codificadas con CdSe / ZnS QDs solubilizadas con HS-PEG ₁₂ -COOH. * Los potenciales ζ de la superficie de la microcápsula después de que se eliminó el núcleo; ** una etapa adicional en la fabricación de microcápsulas de polielectrolito codificadas por QD con una superficie modificada con BSA

Las microcápsulas huecas que contienen QD inmovilizados en su membrana polimérica se obtienen disolviendo las micropartículas de carbonato cálcico con EDTA 0,2 M (pH 6,5) y formando el complejo soluble en agua de la sal cálcica del ácido etilendiaminotetraacético, cuya difusión a través de la membrana polimérica da como resultado la formación de cavidades dentro de las microcápsulas. Para obtener microcápsulas de polielectrolito codificadas por QD con una superficie modificada con BSA, el polianión PAA se coloca en capas sobre la 11ª capa del policatión PAH. Se utiliza PAA debido a su valor de la constante de disociación tras la interacción con la superficie de la microcápsula. El valor de pKa de PAA (pKa ≈ 4,7) es menor y, por lo tanto, más ácido en comparación con PSS (pKa ≈ 7,5) [25, 26], lo que da como resultado un mayor potencial ζ de la superficie de la microcápsula. La carga de la superficie modificada con PAA facilita la adsorción pasiva de BSA debido a la interacción electrostática entre BSA y PAA. Sin embargo, el ensamblaje entre PAA y BSA da como resultado una disminución de la carga superficial negativa de la microcápsula (Fig. 1b). Después de la deposición de BSA sobre la superficie de la microcápsula, se produce el blindaje de la capa de PAA cargada negativamente por grupos amino electrostáticamente positivos de BSA, por lo tanto, el potencial ζ de las microcápsulas codificadas por QD recubiertas con BSA probablemente se determine principalmente por el comportamiento electrostático de BSA como un revestimiento exterior de microcápsulas [26].

Los QD pegilados solubles en agua se caracterizan por una distribución de tamaño estrecha, la ausencia de agregaciones en la dispersión y una alta estabilidad coloidal. Es probable que esto asegure la adsorción homogénea de QD en la superficie de la microperla y facilite la codificación efectiva y, por lo tanto, la obtención de microcápsulas fluorescentes brillantes (Fig. 1c).

El uso de proteínas, como BSA, para la modificación de la superficie hace que las microcápsulas de polímero sean más biocompatibles y más resistentes a la adhesión entre sí. Esto también asegura la pasivación temporal de la superficie de la microcápsula, que es importante para el estudio posterior de las microcápsulas formadas por los complejos interpoliméricos PAH-PSS o PAH-PAA en términos de interacción in vitro con las células y comportamiento in vivo [27,28,29]. .

Las microcápsulas obtenidas codificadas por QD son esféricas (Fig. 1c) y se caracterizan por una distribución de tamaño estrecha (Fig. 2) con un tamaño medio de 4,45 ± 0,65 μm. Este tamaño es comparable al de los glóbulos rojos, siendo incluso más pequeño que él [30]. Además, como se mostró anteriormente, la membrana de polímero de las microcápsulas es una estructura flexible propensa a deformarse. Al inyectarse por vía intravenosa, las microcápsulas de este tamaño no pueden atravesar las barreras sangre-tejido, lo que permite rastrear el transporte y la distribución de microcápsulas codificadas ópticamente en el cuerpo [31, 32]. Sin embargo, en localizaciones con una mayor permeabilidad de la pared de los vasos sanguíneos, p. Ej., En áreas de inflamación y crecimiento de tumores, las microcápsulas pueden penetrar en el espacio extravascular, lo que se espera que asegure la obtención de imágenes y la monitorización de la administración dirigida [33,34,35 , 36].

Distribución de tamaño de las microcápsulas de polielectrolito codificadas ópticamente con puntos cuánticos, donde el número de microcápsulas analizadas fue 600

Las características de fluorescencia y estructura de las microcápsulas de polielectrolito codificadas en QD

Las microcápsulas fabricadas se caracterizan por un pico de fluorescencia a una longitud de onda de 590 nm, que corresponde a la de las QD solubles en agua originales utilizadas para la codificación óptica de las microcápsulas. Esto indica que los polielectrolitos poliméricos que constituyen la membrana de la microcápsula no afectan las propiedades fluorescentes, particularmente el máximo fluorescente, de los QD en las microperlas y las microcápsulas preparadas a partir de ellas (Fig. 3).

El efecto de la incorporación de puntos cuánticos (QD) en la membrana de polímero de las microperlas (MCB) y microcápsulas (MCC) sobre sus características de fluorescencia:se muestra el espectro de fluorescencia de una solución QD que contiene 2.241 mg de QD; esto corresponde a la cantidad de QD utilizados para la codificación óptica de los MCB

La Figura 4 muestra los histogramas de distribución para la intensidad de las señales de las poblaciones de microcápsulas codificadas por QD, así como microcápsulas de placebo, en el canal de fluorescencia de PE (575/25 nm) y FSC-A y SSC-A (488/10 nm) ) canales del citómetro de flujo. Los datos indican una diferenciación efectiva entre el placebo y las microcápsulas codificadas ópticamente en el canal de PE (575/25 nm) (Fig. 4a, b). La intensidad de la señal de fluorescencia de las microcápsulas en el canal PE (575/25 nm) es ~ 10 ⁴ , que demuestra una alta capacidad de fluorescencia de las microcápsulas codificadas por QD. En los canales FSC-A y SSC-A (488/10 nm), las distribuciones para las dos poblaciones de microcápsulas se superponen, lo que indica tamaños relativos y parámetros de granularidad similares del placebo y las microcápsulas codificadas (Fig.4c, d) y, por lo tanto, , homogeneidad de las poblaciones. Aparentemente, esto se debe al hecho de que las membranas de las microcápsulas consisten en un número igual de capas de polímero, conteniendo la membrana de las microcápsulas codificadas solo una capa de QD. Así, las microcápsulas obtenidas se caracterizan por una distribución de tamaño homogénea y unas características óptimas de fluorescencia que aseguran su detección en los canales correspondientes de un citómetro de flujo.

Detectabilidad de microcápsulas de polielectrolito codificadas por QD mediante citometría de flujo: a perfil de diagrama de puntos de microcápsulas en canales SSC-PE; b histograma de distribución de microcápsulas en canal PE; c perfil de diagrama de puntos de microcápsulas en canales SSC-FSC; d Histograma de distribución de microcápsulas en el canal FSC. Se utilizaron microcápsulas sin QD (placebo) como control y se muestran en gris, mientras que las codificadas con puntos cuánticos CdSe / ZnS (emisión de fluorescencia máxima a 590 nm) se muestran en naranja. El número de eventos analizados fue igual a 2500. Los diagramas de puntos y los ejes del histograma se muestran como SSC-A, FSC-A, PE-A, donde A significa que los datos están representados por el área de señal

Las microfotografías de secciones de las microcápsulas de polielectrolito codificadas por QD mostradas en la Fig. 5 demuestran que las microcápsulas son huecas, y la señal fluorescente brillante detectada es emitida por las membranas de polímero que contienen QD. Estos datos confirman la eficiencia del procedimiento utilizado para disolver el núcleo y demuestran una señal de fluorescencia brillante de las microcápsulas fabricadas, que se puede detectar utilizando los filtros correspondientes, Texas Red y PE en los casos de microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, respectivamente. Las microcápsulas de polielectrolito preparadas que contienen QD en su capa de polímero poseen propiedades fluorescentes más altas en comparación con las microcápsulas de polielectrolito marcadas con tintes convencionales como isotiocianato de fluoresceína (FITC) o aminofluoresceína [14, 37]. De lo contrario, las microcápsulas codificadas con QD usando el enfoque capa por capa tienen un brillo comparable o incluso inferior al de las microperlas codificadas con tintes orgánicos usando la técnica de hinchamiento. El brillo está determinado por el producto del coeficiente de extinción y el rendimiento cuántico. Los rendimientos cuánticos de QD solubles en agua a temperatura ambiente son de alrededor del 40%, lo que es comparable con el de los tintes orgánicos [22, 38, 39], mientras que las extinciones de QD son casi 100 veces mayores que las de los tintes orgánicos. De lo contrario, debido al gran tamaño de las QD, es posible que sus cantidades dentro de la cubierta de la microcápsula no sean comparables con las de las moléculas de colorantes orgánicos. Por lo tanto, las cantidades de moléculas de colorante orgánico que codifican pueden ser muy superiores a las de las QD, lo que garantiza un brillo comparable. Por otro lado, la codificación de las microcápsulas con las QD proporciona una ventaja comparativa tan importante como la ausencia total del fotoblanqueo. Además, los QD de diferentes colores (tamaños) pueden excitarse con la misma excitación de longitud de onda. Por lo tanto, el uso de QD de diferentes colores para la codificación de microcápsulas puede proporcionar un número prácticamente ilimitado de códigos ópticos resueltos espectralmente [21].

Microfotografías de secciones de microcápsulas de polielectrolito codificadas con puntos cuánticos. Las flechas en ( a ) indican las áreas que se muestran en ( b , c ) a mayor aumento

Conclusiones

La técnica desarrollada para obtener microcápsulas de polielectrolito codificadas por QD garantiza una codificación óptica eficaz. Las microcápsulas de polímero fabricadas se caracterizan por una distribución de tamaño óptima y una alta intensidad de fluorescencia para ser utilizadas para su detección eficiente mediante citómetros de flujo comerciales y microscopios confocales. Por tanto, las microcápsulas diseñadas son agentes fluorescentes potenciales para bioimagen in vitro e in vivo. Un mayor desarrollo de la plataforma versátil basada en microcápsulas estaría dirigido a proponer nuevas herramientas teranósticas y de bioimagen basadas en micropartículas fluorescentes codificadas por QD que responden a diferentes estímulos físicos o químicos externos junto con la fotoexcitación.

Abreviaturas

BSA:

Albúmina de suero bovino

EDTA:

Etilendiaminotetraacetato disódico

PAA:

Ácido poliacrílico

PAH:

Policatión poli (clorhidrato de alilamina)

PEG:

Polietilenglicol

PSS:

Polianión poli (4-estirenosulfonato de sodio)

QD:

Punto cuántico

TOPO:

Óxido de trioctilfosfina

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