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Liposoma funcionalizado con aptámero anti-Epcam (Syl3c) para la administración dirigida de doxorrubicina:estudios antitumorales in vitro e in vivo en ratones portadores de carcinoma de colon C26

Resumen

En este estudio, hemos funcionalizado en superficie doxorrubicina nanoliposomal pegilada (DOX) con aptámero anti-EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales) mediante la inserción posterior de DSPE-mPEG 2000 conjugado con aptámero anti-EpCAM en Caelyx® (ED-lip). Se determinaron el tamaño, la carga, el perfil de liberación y la citotoxicidad y la absorción celular de la formulación. La caracterización del ED-labio demostró un ligero aumento de tamaño y PDI junto con la disminución del potencial zeta, lo que indicó que la post-inserción se realizó de manera eficiente. Los resultados de la citometría de flujo y la microscopía fluorescente han demostrado que ED-lip mejoró la tasa de captación celular en la línea celular C26 en comparación con Caelyx®. El ED-lip también tuvo más efectos citotóxicos que Caelyx®, lo que indicó la eficacia del aptámero anti-EpCAM como ligando dirigido. La biodistribución farmacocinética y tisular de formulaciones en ratones con tumores C26 demostró que ED-lip no afectó el perfil de distribución de DOX en comparación con Caelyx® en modelo animal. Además, ED-lip mejoró eficazmente la acumulación tumoral de DOX y promovió la supervivencia de los animales en comparación con Caelyx®. Estos resultados sugieren que la funcionalización de Caelyx® con aptámero anti-EpCAM es prometedora en el tratamiento del cáncer y merece una mayor investigación.

Introducción

Los sistemas de administración de nanofármacos (NDDS) con un tamaño de 100 a 200 nm se acumulan pasivamente en el microambiente del tumor a través del efecto de mayor permeabilidad y retención (EPR). Esto ocurre a través del revestimiento endotelial suelto y el drenaje linfático débil. Sin embargo, datos recientes indicaron que solo menos del 1% del fármaco administrado podría llegar al sitio del tumor [1]. La falta de capacidad para penetrar en la matriz extracelular densa (MEC) del tumor, el retorno del fármaco liberado a la circulación y la heterogeneidad de los tumores son las razones responsables de esta falla [2]. Se han utilizado diferentes estrategias para mejorar la acumulación tumoral de NDDS utilizando estímulos endógenos y exógenos [3]. Estos NDDS podrían responder a los estímulos exógenos como la luz y tienen la capacidad de utilizarse en la formación de imágenes de tumores [4]. Hay muchos nanomateriales inorgánicos diferentes que tienen la capacidad de utilizarse como agentes anticancerígenos [5, 6]. Sin embargo, en el caso de los nanomateriales inorgánicos, se debe prestar atención a sus toxicidades y seguridad ambiental [7,8,9,10,11].

La administración dirigida activa es un enfoque importante que ayuda a los NDDS a administrar agentes terapéuticos más eficientes a los tumores y minimizando la exposición a tejidos no diana [12, 13]. Un agente de dirección ideal para la administración dirigida es una molécula que tiene afinidad por las proteínas de la superficie celular o receptores regulados positivamente por células o componentes tisulares particulares [14].

La molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) es una glicoproteína transmembrana que se considera un ligando candidato para el direccionamiento activo. Hallazgos recientes indicaron que EpCAM tiene células epiteliales sanas normales de baja expresión, mientras que en las células cancerosas su expresión se vuelve en niveles más altos (hasta 1000 veces) [15,16,17]. Durante el desarrollo del cáncer, el patrón de expresión de EpCAM cambia de la membrana basal y basolateral en el epitelio normal a la superficie apical en las células epiteliales tumorales [18]. Esta expresión diferencial convierte a EpCAM en un ligando muy interesante para la administración de fármacos que podría mejorar el índice terapéutico del fármaco [19].

Se ha demostrado que EpCAM es un marcador de células madre cancerosas (CSC) o células iniciadoras de tumores (TIC), cuya expresión en el cáncer está relacionada con el mal pronóstico [20]. CSC o TIC son células que tienen autorrenovación, la capacidad de producir más células del mismo tipo, que tienen funciones clave en el desarrollo de tumores y metástasis [21]. La sobreexpresión de EpCAM se ha informado en CSC de varios tumores sólidos [22]. Recientemente, los aptámeros han atraído mucha atención en un amplio rango de investigación y emergen como moléculas potencialmente poderosas que pueden usarse en NDDS como ligando de direccionamiento [23, 24]. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos basadas en ADN o ARN que poseen estructuras secundarias y terciarias que tienen afinidad por sus objetivos, como los receptores de la superficie celular [23, 24]. Los aptámeros también tienen varias ventajas sobre, por ejemplo, no son inmunogénicos y tienen un peso molecular bajo (8-25 kDa) con estabilidad química y térmica. Además, su síntesis y modificaciones químicas es de bajo costo y escalable [25]. El direccionamiento selectivo de los NDDS a través de aptámeros específicos anti-EpCAM podría considerarse como una opción de direccionamiento eficaz para administrar agentes quimioterapéuticos en el microambiente tumoral [19, 26]. En este sentido, diferentes estudios demostraron que los nanoportadores funcionalizados con aptámeros anti-EpCAM podrían mejorar eficazmente la administración de fármacos contra el cáncer a las células tumorales [15, 27, 28].

El objetivo de este estudio es desarrollar un aptámero de ADN anti-EpCAM (SYL3C) -anoliposomas pegilados cargados con doxorrubicina (DOX) (ED-lip) como modelo de NDDS. Dicha funcionalización se realizó mediante la química de acoplamiento EDC / NHS entre el grupo amina del aptámero y el grupo carboxilo de DSPE-mPEG 2000 , que se inserta posteriormente en el liposoma como se muestra en la Fig. 1. El labio del DE se caracteriza por tamaño, potencial zeta y porcentaje de encapsulación de doxorrubicina, perfil de liberación y citotoxicidad. Luego, evaluamos si estos ED-lip podrían mejorar la captación celular in vitro y administrar DOX al tumor mediante la orientación en ratones con tumores de carcinoma de colon C26.

Preparación de Caelyx® funcionalizado anti-EpCAM (ED-lip). un Vinculación de aptámero anti-EpCAM a DSPE-mPEG 2000 a través de la unión covalente de las aminas primarias (-NH2) del aptámero anti-EpCAM al grupo carboxilo (-COOH) de DSPE-mPEG 2000 . b Método posterior a la inserción para la preparación de Caelyx® (ED-lip) funcionalizado con anti-EpCAM

Resultado y discusión

Caelyx®, doxorrubicina liposomal pegilada es uno de los agentes quimioterapéuticos más utilizados y es la primera nanopartícula aprobada por la FDA que ha sido indicada para el tratamiento del cáncer de ovario, el sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA y el mieloma múltiple. Caelyx® penetró pasivamente en el sitio del tumor a través del efecto EPR [29]. Aunque, Caelyx® ha mejorado significativamente la farmacocinética y la vida media de DOX; sin embargo, las principales limitaciones de Caelyx® son una captación celular insuficiente y una baja tasa de liberación del fármaco en el sitio del tumor [29]. Aquí, utilizamos el aptámero SYL3C como un ligando de orientación para funcionalizar la doxorrubicina liposomal (ED-lip) para dirigir la molécula EpCAM en la superficie de las células cancerosas, lo que permite la entrega de DOX a un sitio diana específico a través del proceso de orientación activa.

Conjugación de DSPE-mPEG 2000 a Aptamer

En el presente estudio, utilizamos la química de acoplamiento EDC / NHS para la conjugación de aptámeros anti-EpCAM funcionalizados con amina al grupo carboxílico activo de DSPE-mPEG 2000 -COOH. La ventaja de esta reacción de acoplamiento que utiliza la química de acoplamiento EDC / NHS y la formación del enlace amida es su estabilidad y la reducción de interacciones no específicas entre aptámeros [30]. Los aptámeros podrían modificarse con amina primaria o grupo tiol y conjugarse covalentemente para activar el grupo carboxilo o pirrol de maleimida, respectivamente [31]. Los aptámeros modificados con el grupo tiol se conjugaron con el grupo funcional maleimida de DSPE-PEG 2000 . Luego, DSPE-PEG 2000 -aptamer post-insertado en la estructura del liposoma para decorar la superficie exterior de los liposomas [32]. Una limitación importante de la química del tiol maleimida es que durante el almacenamiento, el grupo tiol de los aptámeros puede verse afectado por la oxidación y conducir a la formación de un enlace disulfuro (S-S) entre dos aptámeros modificados con tiol. Estos aptámeros diméricos no pueden participar en la reacción de conjugación con el grupo funcional maleimida de DSPE-PEG 2000 [30]. Por lo tanto, el uso de reacciones EDC / NHS aumenta los rendimientos del producto y mejora en el método posterior a la inserción.

El aptámero tiene algunas ventajas sobre los anticuerpos, incluida la facilidad de síntesis y ampliación, baja toxicidad sistémica y falta de inmunogenicidad [33]. Aquí, después de la conjugación del aptámero con el lípido, se reclutó el método de post-inserción para hacer Caelyx® decorado con aptámero anti-EpCAM (ED-lip). En general, la técnica posterior a la inserción es un método simple y eficaz para la unión de aptámeros a la superficie de los liposomas y proporciona una mayor tasa de incorporación de aptámeros en los liposomas [34].

Usamos un ensayo de cambio de movilidad de electroforesis en gel para la evaluación de la post-inserción de aptámero anti-EpCAM en el liposoma. Como se muestra en la Fig. 2, los aptámeros cargados negativamente migraron en el gel y se observaron sus bandas mientras no había ninguna banda equivalente para la formulación del labio ED, porque el labio ED quedó atrapado en la línea del pozo y no pudo moverse a través del gel. Estos resultados indicaron que las micelas conjugadas con aptámeros se insertaron con éxito en la superficie de los liposomas.

Electroforesis en gel de agarosa de la formulación ED-lip. Las muestras se cargan en el gel de agarosa. La luz ultravioleta visualizó el gel. Se indican los pocillos correspondientes a aptámeros en escalera, aptámeros libres y aptámeros conjugados PL. La falta de la banda correspondiente en el liposoma-Aptamer indicó la confirmación posterior a la inserción

Caracterización fisicoquímica de ED-lip

La caracterización fisicoquímica de Caelyx® y ED-lip se demostró en la Tabla 1. El tamaño y la carga de las formulaciones preparadas revelaron que la modificación de Caelyx® con aptámero anti-EpCAM no tuvo un efecto significativo en el tamaño de partícula ( p > 0,05). El tamaño de los liposomas antes de la inserción del aptámero (Caelyx®) era de alrededor de 96 nm con PDI de 0,11, después de la inserción posterior (ED-lip) el tamaño de los liposomas aumentó parcialmente a 117 nm con PDI de 0,14 que tienen un tamaño deseable para la entrega a tumor. Los resultados de estudios anteriores también indicaron que la incorporación de ligandos dirigidos conduce a un aumento de tamaño y PDI de los liposomas [35, 36]. Además, el potencial zeta del ED-lip (- 19,25) se volvió más negativo que el de Caelyx® (- 12). Se demostró que la conjugación de ARN-aptámero en el liposoma resultó en la disminución del potencial zeta del liposoma [37]. El aumento en el tamaño y el potencial zeta negativo del labio del DE podría ser una prueba de la inserción exitosa de aptámeros conjugados en la superficie del liposoma [38]. Estos resultados son consistentes con nuestro estudio anterior que indicó la unión de aptámero a la superficie de Caelyx® que conduce a un ligero aumento en el tamaño de partícula y el potencial zeta más negativo en el aptámero funcionalizado Caelyx® [38, 39]. Sin embargo, la eficacia de la post-inserción debe probarse en términos de tiempo de incubación y temperatura para alcanzar un liposoma post-insertado más eficiente con mejor tamaño y PDI. La eficiencia de encapsulación de Caelyx® y ED-lip fue del 100% (consulte la Tabla 1).

El número de aptámeros post-insertados en la superficie del liposoma se determinó como se describe [6]. La cantidad total de contenido de fosfolípidos de la formulación liposomal determinada por ensayo de fosfato fue 14 mM. Dado que, el número medio de moléculas de lípidos en un liposoma con un tamaño medio de 100 nm es 8 × 10 4 el número de liposomas en cada mililitro es casi 10 14 [38]. El peso molecular del aptámero fue g / mol. El número de DSPE-mPEG 2000 -El aptámero se determinó basándose en métodos de ensayo de fosfato en los que los moles de moléculas de fosfato se corresponden con los moles de moléculas conjugadas. Según estos datos, el número de moléculas de aptámero por cada ml de solución alícuota es de 10 15 .

Perfil de lanzamiento DOX

La inserción de micelas conjugadas de aptámeros en la superficie exterior de Caelyx® puede afectar el perfil de liberación del DOX. Por lo tanto, evaluamos la liberación de DOX en ED-lip en comparación con Caelyx® en dextrosa al 5% con FBS al 50%. Este medio podría imitar el comportamiento de liberación de las formulaciones en el plasma [40]. La Figura 3 mostró que no hay una diferencia significativa en la liberación de DOX de las formulaciones Caelyx® y ED-lip durante las 24 h de estudio y solo se liberaron cantidades insignificantes de DOX. Esto es consistente con nuestros estudios previos que indicaron que la inserción de aptámero en la superficie del liposoma no afectaba la estabilidad de la membrana y el perfil de liberación de DOX [38, 39]. Esto se debe principalmente a la estabilidad de la formulación de Caelyx® que se formuló utilizando un método de carga remota controlado por gradiente de pH [41].

Estudio de lanzamiento. Perfil de fuga de contenido de DOX de Caelyx® y ED-lip a 37 ° C en presencia de FBS al 50% en dextrosa durante 24 h de estudio. Datos representados como media ± desviación estándar (SEM) ( n =3)

Interacción celular y absorción celular por microscopía fluorescente

La interacción celular y la absorción celular de las formulaciones liposomales se evaluaron a 4 ° C y 37 ° C y se muestra en la Fig. 4. La evaluación de la eficacia de focalización de ED-lip indicó que no había diferencias entre las intensidades fluorescentes medias (MFI) de células CHO-K1 tratadas con Caelyx® y ED-lip a 4 ° C y 37 ° C (Fig. 4a, c). Sin embargo, los datos demostraron que el ED-labio tenía una absorción considerablemente mayor por las células C26 en comparación con Caelyx® a 4 ° y 37 ° C (Fig. 4b, d) que fue estadísticamente significativa a 37 ° C ( p <0,0001). El ED-lip tuvo una absorción significativa en comparación con el Caelyx® ( p <0,001). Estos resultados indicaron que la especificidad diana mejorada con ED-lip debido al aptámero anti-EpCAM tiene una mayor afinidad por la línea celular C26 en comparación con las células CHO-K1. El DOX libre pasa libremente a través de la bicapa lipídica y entra en la célula, por lo que tiene la mayor absorción celular entre las formulaciones y, por lo tanto, tiene la mayor citotoxicidad. En el caso de Caelyx®, la PEGilación limita la tasa de endocitosis y resultó en una disminución de la citotoxicidad. Sin embargo, la presencia de aptámero anti-EpCAM en la superficie del liposoma (ED-lip) mejora la tasa de internalización de la formulación en las células y aumenta su citotoxicidad en comparación con Caelyx® [38]. Los datos de microscopía fluorescente demostraron que la diferencia entre la captación celular de ED-lip y DOX libre en la línea celular C26 a 37 ° C no fue significativa (Fig. 5). Sin embargo, la escala se basa en la intensidad de DOX internalizada representada en la Tabla 2 en la que tanto ED-lip como DOX han mostrado diferencias estadísticamente significativas con Caelyx® en la captación celular de C26 ( p <0,001). Aunque las células C26 expresan un bajo nivel de EpCAM en su superficie [42], los datos de este estudio sugirieron que la presencia de aptámero anti-EpCAM podría mejorar la tasa de proceso de internalización de los liposomas [43].

Interacción celular y absorción celular de formulaciones liposomales evaluadas a 4 ° C y 37 ° C. un La interacción celular CHO-K1 de las formulaciones a 4 ° C y 37 ° C. b La interacción de formulaciones con células C26 a 4 ° C y 37 ° C. c El gráfico demostró el MFI medio de las formulaciones en células CHO-K1 y C26. Datos representados como media ± desviación estándar (SEM) ( n =3). **** p <0,0001

Microscopía fluorescente. Los resultados de la internalización celular de DOX en líneas celulares C26 visualizados por microscopía fluorescente. Células teñidas con DAPI. Tanto el DOX libre como el ED-lip tienen un mayor nivel de internalización de DOX en comparación con Caelyx®. Células inspeccionadas con un aumento de × 200

Estudio de citotoxicidad

Los efectos de citotoxicidad de las formulaciones de DOX, Caelyx® y ED-lip libres se indican en la Fig. 6. Se utilizan diferentes concentraciones de formulaciones para tratar células durante 1, 3 y 6 hy se dejan incubar durante las siguientes 72 h. Los datos demostraron que todas las formulaciones tienen efectos sobre las células en función del tiempo y de la dosis. La viabilidad de las células C26 tratadas con la formulación ED-lip disminuyó en comparación con las células tratadas con Caelyx®. Dado que las células CHO-K1, como células negativas para EpCAM, muestran una respuesta más baja al ED-lip en comparación con las células C26, parece que el aptámero anti-EpCAM aumentó la entrega específica de Caelyx® a las células objetivo. Estos resultados podrían confirmar la captación celular específica de ED-lip por las células C26. Estos resultados enfatizaron la importancia del uso de la administración dirigida del fármaco con agentes dirigidos específicos para la administración selectiva del fármaco a las células diana con la reducción de los efectos secundarios del fármaco evitando fuera del objetivo [44]. Como se informó anteriormente, el direccionamiento activo de Caelyx® con ligandos de direccionamiento específicos como el aptámero y el anticuerpo conduce a aumentar el direccionamiento activo del tumor y la administración de fármacos específicos a las células diana, lo que a su vez mejoró la eficacia terapéutica de DOX [35, 39].

Efecto de citotoxicidad in vitro (IC50) de ED-lip, Caelyx® y doxorrubicina libre contra células CHO y células C26 después de diferentes tiempos de exposición. Datos representados como μg / ml ± desviación estándar (SEM) ( n =3). * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001, **** p <0,0001

Biodistribución y farmacocinética

Con el fin de evaluar cómo el aptámero anti-EpCAM afecta la biodistribución de DOX, inyectamos una dosis de 10 mg / kg de ED-lip y Caelyx® en ratones portadores de tumores subcutáneos de cáncer de colon C26. La concentración de DOX en plasma a las 3, 12, 24, 48 y 72 h después de la inyección con Caelyx® y ED-lip se muestra en la Fig. 7. Los resultados muestran que el comportamiento de las concentraciones de DOX en plasma en ambos grupos fue similar y no no hubo ninguna diferencia significativa entre ambas formulaciones. Como se muestra en la Tabla 3, la conjugación de aptámero anti-EpCAM a la superficie liposomal disminuyó ligeramente el tiempo medio de circulación de 39,3 ha 34,2 hy MRT de 47,6 a 42,9 h (ver Tabla 3). Los parámetros farmacocinéticos indicaron que la conjugación del aptámero anti-EpCAM en el liposoma disminuyó ligeramente t ½ y MRT, que coincidían con informes anteriores, demostraron que la conjugación del aptámero en la superficie liposomal acelera la eliminación de los liposomas [38]. La adsorción de proteínas y la consiguiente eliminación por parte del sistema fagocítico mononuclear (MPS) podría ser la razón de la aceleración del aclaramiento sanguíneo de las nanopartículas conjugadas con ligando [45].

Nivel plasmático de DOX. Los resultados de la concentración frente al tiempo de la cantidad de DOX en sangre a las 3, 12, 24, 48 y 72 h después de la inyección. Datos representados como media ± desviación estándar (SEM) ( n =3)

Como se muestra en la Fig. 8, se compararon las concentraciones de DOX en los principales órganos recolectados en los grupos que recibieron Caelyx® y ED-lip. Los efectos secundarios más importantes del DOX libre es la cardiotoxicidad que Caelyx® reduce significativamente el riesgo de este efecto adverso [46]. La biodistribución de ED-lip en el hígado, pulmón y bazo es significativamente mayor que Caelyx® a las 3 h. La presencia de vasos sanguíneos con fugas y el aumento en el tamaño y el PDI del labio del DE después de la inserción pueden ser las razones de una mayor acumulación de labio del DE en estos tejidos en épocas anteriores. Se demostró que el aumento del tamaño de las nanopartículas a 150 nm mejora la acumulación de nanopartículas en el hígado, los pulmones y el bazo [47]. Mientras tanto, los resultados del estudio de biodistribución muestran claramente el mecanismo EPR en la acumulación de nanopartículas en el tumor. La Figura 8 muestra claramente que tanto ED-lip como Caelyx® se acumulan gradualmente en el sitio del tumor y alcanzan un máximo alrededor de las 12 h, permanecen en meseta hasta las 24 hy luego disminuyen a las 48 y 72 h, gradualmente. Es interesante en todos los puntos temporales de 3, 12, 24, 48 y 72 h; la acumulación de ED-lip en el tumor es significativamente mayor que la de Caelyx®, lo que podría deberse a la eficacia de la focalización activa con aptámero anti-EpCAM. Estos resultados indicaron que la unión del aptámero a la dosis de la superficie del liposoma no afectó la distribución de DOX en el riñón. Por lo tanto, parece que los aptámeros anti-EpCAM promueven eficazmente la penetración tumoral específica de los liposomas, lo que también podría deberse a la sobreexpresión de las moléculas de EpCAM en las células endoteliales vasculares del tumor [48]. Anteriormente, se indicó que los aptámeros anti-EpCAM podrían mejorar la penetración tumoral en tumores de xenoinjerto [49]. Las CSC o TIC también son el objetivo de la terapia anti-EpCAM. La administración de aptámeros anti-EpCAM como ligando de direccionamiento para dirigir EpCAM mostró efectos prometedores en el direccionamiento de las CSC [22, 50]. En este caso, se podría sugerir que parte del efecto antitumoral eficaz de ED-lip podría deberse a la orientación exitosa de las CSC.

Biodistribución tisular. Los resultados de la biodistribución de DOX en corazón, tumor, hígado, pulmón, bazo y riñón. Las concentraciones (μg / g) informadas a las 3, 12, 24, 48 y 72 h después de la inyección para cada órgano. Datos representados como media ± desviación estándar (SEM) ( n =3). * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001, **** p <0,0001

Actividad antitumoral in vivo

La eficacia terapéutica de ED-lip se evaluó en el modelo de tumor de carcinoma de colon C26. El tamaño del tumor, el peso corporal y la supervivencia se controlaron durante casi 2 meses y los resultados se resumen en la Fig. 9 y la Tabla 4. Los datos indican que ED-lip no tiene una influencia obvia en el peso corporal de los ratones así como en Caelyx® (ver Fig. 9a ). Como se muestra en la Fig. 9b, después de la inyección intravenosa de Caelyx® y ED-lip, la tasa de crecimiento del tumor se inhibe eficazmente hasta el día 30 después de la inyección, y no hay una diferencia significativa en los grupos liposomales. Después de 30 días después de la inyección, la tasa de crecimiento del tumor se aceleró, sin embargo, la tasa de crecimiento en los grupos que recibieron fármacos fue aún más lenta que en el grupo que recibió PBS. La diferencia entre el grupo Caelyx® y ED-lip no fue significativa durante los 30 días posteriores a la inyección. Los resultados de supervivencia se representan en una gráfica de Kaplan-Meier. La Figura 9c muestra que ED-lip mejora la curva de supervivencia en comparación con PBS o Caelyx®. Los principales indicadores del estudio de supervivencia se resumieron en la Tabla 4. Los tumores en tres ratones del grupo ED-lip se curaron completamente, por lo que el MST para este grupo no está definido. El tratamiento con ED-lip aumentó el TTE de 41,1 a 49,7 días y dio como resultado una actividad antitumoral eficaz con TGD al 90,27% con MST indefinido debido a la eliminación completa del tumor en tres ratones (ver Tabla 4).

Eficacia terapéutica in vivo de formulaciones en ratones hembra BALB / c portadores de carcinoma de colon C26. Los ratones recibieron una inyección intravenosa de una dosis única de formulaciones (10 mg / kg). un Representa el respectivo perfil porcentual en peso del BALB / c en cada grupo experimental. b Representa los seguimientos del tamaño del tumor en ratones BALB / c. c Muestra el gráfico de supervivencia para BALB / c. Datos representados como media ± DE ( n =5)

Los datos del tamaño del tumor demostraron que el labio del ED podría inhibir drásticamente el crecimiento del tumor. Los resultados del análisis de supervivencia mostraron que el tratamiento con ED-lip aumentó MST y TTE. El grupo que recibió ED-lip tuvo un mayor porcentaje de TGD y fue más efectivo en comparación con Caelyx®. Nuestros hallazgos son consistentes con el alto nivel de concentración de DOX en el tejido tumoral del grupo tratado con ED-labio. Por lo tanto, la DOX liposomal conjugada con aptámero mejora su penetración y, en consecuencia, mejora la acumulación de fármaco en el sitio del tumor, lo que a su vez conduce a un aumento de la eficacia de Caelyx® y un mayor porcentaje de TGD en los datos de supervivencia. Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que los aptámeros anti-EpCAM podrían servir como un importante agente de dirección para la administración de fármacos.

Conclusión

Aquí, tenemos Caelyx® funcionalizado en superficie con aptámero anti-EpCAM (SYLC3) vía post-inserción (ED-lip). La citometría de flujo y la microscopía fluorescente mostraron un alto nivel de captación de DOX en las células C26, lo que indicó que el aptámero podría mejorar la tasa de proceso de internalización de ED-lip. Los datos farmacocinéticos indicaron que la postinserción de DSPE-mPEG-EpCAM no cambió la farmacocinética de DOX en comparación con Caelyx®. Sin embargo, la biodistribución del tejido mostró que la mayor acumulación tumoral de ED-lip en comparación con Caelyx® incluso después de 72 h después de la inyección. Demostramos que ED-lip tenía efectos terapéuticos mejorados en ratones con tumores C26. Los parámetros de supervivencia mejorados en ratones tratados con ED-lip, sugieren que el liposoma DOX dirigido a EpCAM es un portador prometedor de administración de fármacos para el tratamiento de cánceres y merece una mayor investigación.

Materiales y métodos

Materiales

El aptámero de ADN 5'-Amina-anti-EpCAM (secuencia de 5 '-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGTTGGCCTG-3') (SYL3C) se adquirió de BIONEER (empresa de biotecnología, Daejeon, Corea del Sur). DSPE-mPEG 2000 -COOH se adquirió de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Dowex®, 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), penicilina estreptomicina y Fluoroshield ™ con DAPI se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Se adquirió caelyx® comercialmente disponible de Behestan Darou Company (Teherán, Irán).

Conjugación de DSPE-mPEG 2000 a Aptamer

El aptámero Anti-EpCAM se vinculó a DSPE-mPEG 2000 a través de la unión covalente de las aminas primarias (-NH2) del aptámero anti-EpCAM al grupo carboxilo (-COOH) de DSPE-mPEG 2000 (Figura 1). La conjugación se realizó mediante la química de acoplamiento EDC / NHS [51]. Brevemente, DSPE-mPEG 2000 se dispersó en tampón de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES) (pH 6,5) y se añadieron EDC / NHS, EDC 400 mM y NHS 100 mM a la dispersión. La dispersión se dejó agitar durante 15 min para activar los grupos carboxilo del lípido. Luego, se añadió aptámero anti-EpCAM a la dispersión y se agitó durante las siguientes 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. La relación molar de lípido:aptámero anti-EpCAM fue 1:1 y la relación molar de EDC / NHS fue 10 veces mayor que la de lípidos.

Modificación de Caelyx® con DSPE-mPEG-Anti-EpCAM Aptamer

ED-lip se sintetizó mediante el método posterior a la inserción. Para realizar la post-inserción, se añadieron micelas de aptámero DSPE-mPEG-anti-EpCAM a 1 ml de caelyx® durante 30 min a 60 ° C. Las cantidades de aptámero DSPE-mPEG-EpCAM se determinaron de acuerdo con el ensayo de fosfato de Bartlett [52]. Basado en el número aproximado de liposomas por mililitro de caelyx® que es aproximadamente 10 14 , el volumen de DSPE-mPEG-anti-EpCAM se ajustó para alcanzar 10 aptámeros por cada liposoma [36]. Se utilizó electroforesis en gel de agarosa para confirmar la inserción posterior [39].

Caracterización fisicoquímica

El tamaño de partícula, el índice de polidispersidad (PDI) y la carga superficial se determinaron mediante el instrumento Dynamic Light Scattering (DLS) (Nano-ZS; Malvern, Reino Unido). Para eliminar el DOX libre, los liposomas se mezclaron con resina Dowex® y se rotaron durante 60 min y se pasaron por columnas Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories Inc.) para eliminar el Dowex® [53]. Las cantidades de DOX en las formulaciones liposomales se determinaron usando un espectrofotómetro de fluorescencia LS-45 (Perkin-Elmer, Reino Unido), (excitación:emisión 485:590 nm).

Estudio de lanzamiento

Para evaluar la liberación de DOX, se añadió 1 ml de formulación a los 9 ml de dextrosa (con 50% de suero fetal bovino (FBS)) y en determinados intervalos de tiempo (0, 1, 2, 4, 6, 12 y 24 h), se tomaron muestras. Después de eliminar el DOX libre con resina Dowex®, se determinaron las cantidades de fármaco que quedaban en los liposomas mediante un espectrofotómetro de fluorescencia y se calculó el porcentaje de liberación [39].

Cultivo celular

Las líneas celulares de carcinoma de colon C26 y ovario de hámster chino (CHO-K1) se adquirieron del Instituto Pasteur de Irán. Las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI1640 complementado con 10% de FBS obtenido de Gibco (Thermos Fisher Scientific, EE.UU.) y 100 UI / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Las células se incubaron a 37 ° C con un 5% de CO 2 y 95% de atmósfera humidificada por aire.

Ensayo de interacción celular y absorción celular

La interacción celular y la absorción celular de las formulaciones se evaluaron a 4 ° C y 37 ° C, respectivamente. En esta prueba se seleccionaron dos líneas celulares, CHO-K1 y C26. Las células sembradas en cada pocillo de las placas de 12 pocillos (2,5 × 10 5 por pozo). Después de una noche de incubación a 37 ° C, los tratamientos añadidos a las células y las placas se colocaron a 4 ° C y 37 ° C y se incubaron durante otras 3 h. Luego, las células se lavaron con PBS y se tripsinizaron. La intensidad de fluorescencia para DOX se determinó mediante citometría de flujo (citómetro BD FACSCalibur). Los datos se analizaron con el software FlowJo versión 7.0.

Evaluación de microscopía fluorescente

El número de 1 × 10 6 células por pocillo C26 Se sembraron células en placas de 6 pocillos en las que ya se había insertado un cubreobjetos microscópico estéril. Después de una noche de incubación a 37 ° C y un 5% de humedad, las células se trataron con DOX libre, Caelyx® y ED-lip durante 24 h para una absorción celular completa [54]. Luego, las células se lavaron con PBS y se fijaron con formaldehído al 4%. Los cubreobjetos se tiñeron con Fluoroshield ™ con DAPI y se montaron en los portaobjetos de vidrio. Los tratamientos se realizaron por triplicado. De cada diapositiva, se seleccionaron seis zonas con un campo de aumento de × 200. Se usó fluorescente intrínseco de DOX para evaluar la captación de las células del fármaco. El escalado se realizó en función de los porcentajes de células que mostraron captación de células DOX en cada campo microscópico:

1:0–20%, 2:20–40%, 3:40–60%, 4:60–80% y 5:80–100%

Evaluación de citotoxicidad

Los valores de CI50 de DOX libre, caelyx® y ED-lip se determinaron mediante ensayo MTT. Para hacer esto, las células CHO-K1 y C26 se sembraron a una densidad de 5 × 10 3 células por pocillo en placas de 96 pocillos a 37 ° C. Después de una noche de incubación, las formulaciones liposomales y la solución de DOX libre se diluyeron en serie en medio sin FBS y se añadieron a cultivos celulares y se incubaron durante 1, 3 y 6 ha 37ºC. Luego, las células se lavaron y se dejaron incubar 72 h. Las densidades ópticas (DO) se midieron usando una absorbancia espectrométrica de 570 nm contra un fondo de 630 nm en un lector de microplacas Stat-Fax 2100 (Awareness Technology Inc. EE. UU.). Luego se calcularon los valores de IC50.

Estudio con animales

Se mantuvieron ratones hembra BALB / c (4-6 semanas, 18-20 g) en jaulas separadas a 22 ± 2 ° C y se mantuvieron con una dieta estándar en gránulos y agua ad libitum. Inyección intraperitoneal (i.p) de ketamina y xilazina (100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilacina) utilizada para anestesiar a los animales [55]. El número de 3 × 10 5 Células C26 por ratón en 60 μl de PBS inyectadas en el flanco derecho, por vía subcutánea. Dos semanas después de la inoculación, cuando el tamaño del tumor creció alrededor de 5 mm 3 , los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos ( n =3 para biodistribución y n =5 para ratones de estudio antitumoral por grupo). Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad de Ciencias Médicas de Mashhad y se realizaron de acuerdo con las reglas internacionales que consideran los derechos de los animales.

Estudios de biodistribución y farmacocinética

Catorce días después de la inoculación del tumor, los ratones se trataron con una dosis de 10 mg / kg de caelyx® y ED-lip por vía intravenosa (i.v.) a través de la cola. El grupo de control recibió 200 μl de solución de PBS. A ciertos intervalos de tiempo (3, 12, 24, 48 y 72 h), los ratones después de la inyección se sacrificaron y se recolectaron muestras de sangre y de tejido (hígado, bazo, riñón, pulmón, corazón y tumor). Luego, la concentración de doxorrubicina en cada muestra se midió en función de la intensidad fluorescente de cada muestra utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia LS-45 (Perkin-Elmer, Reino Unido). Se midió la concentración de doxorrubicina de cada muestra y se calculó el análisis no compartimental de los parámetros farmacocinéticos a partir de los perfiles de concentración en sangre frente a perfiles de tiempo. Luego, los parámetros incluidos debajo de la curva de concentración-tiempo (AUC) y el área debajo de la curva del primer momento (AUMC), la vida media ( t 1/2 ), volumen de distribución ( V d ), C máx , T max ,, Se calcularon el tiempo medio de residencia (MRT) y el aclaramiento (Cl).

Actividad antitumoral in vivo

Con el fin de evaluar la actividad antitumoral, 10 días después de la inoculación del tumor, los ratones con un tamaño de tumor palpable recibieron i.v. dosis de 10 mg / kg de Caelyx® y ED-lip. PBS inyectado en ratones que se consideró como control negativo. Se determinaron los parámetros que incluyen el tiempo para alcanzar el punto final (TTE), el porcentaje de retraso del crecimiento tumoral (TGD), el tiempo medio de supervivencia (MST) y la supervivencia. Durante el estudio, se observaron los cambios de salud y peso corporal de los ratones. El volumen del tumor también se midió con un calibre digital y se calculó de la siguiente manera:

$$ \ mathrm {Tumor} \ \ mathrm {Volumen} =\ left (\ mathrm {Altura} \ times \ mathrm {Longitud} \ times \ mathrm {Ancho} \ right) \ times 0.52 $$

Teniendo en cuenta los aspectos éticos, se extrajeron los ratones en caso de que el crecimiento del tumor fuera> 1000 mm 3 , o se observó una pérdida de peso> 20% o signos de debilidad.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism 6.0 (software GraphPad, Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Los datos se demostraron como media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. La t Se utilizó la prueba para evaluar los resultados del estudio de liberación, citometría de flujo y biodistribución de las formulaciones. Se empleó ANOVA para evaluar los resultados de la microcopia fluorescente y los volúmenes tumorales. El método de Kaplan-Meier utilizado para calcular los parámetros de supervivencia incluyen TTE, MST y TGD%. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen en el artículo.

Abreviaturas

EpCAM:

Molécula de adhesión de células epiteliales

NDDS:

Sistemas de administración de nano fármacos

DOX:

Doxorrubicina

EPR:

Permeabilidad y retención mejoradas

ECM:

Matriz extracelular

CSC:

Célula madre cancerosa

TIC:

Célula iniciadora del tumor

MFI:

Intensidades fluorescentes medias

MPS:

Sistema fagocítico mononuclear

EDC:

1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida

NHS:

N-hidroxisuccinimida

PDI:

Índice de polidispersidad

DLS:

Instrumento de dispersión de luz dinámica

FBS:

Suero fetal bovino

OD:

Densidad óptica

AUC:

Área bajo la curva concentración-tiempo

AUMC:

Área bajo la curva del primer momento

t ½ :

Vida media

V d :

Volumen de distribución

MRT:

Tiempo medio de residencia

Cl:

Liquidación

TTE:

Es hora de llegar al punto final

TGD:

Porcentaje de retraso del crecimiento tumoral

MST:

Tiempo medio de supervivencia

i.p .:

Intraperitonealmente

i.v .:

Por vía intravenosa


Nanomateriales

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