Nanocomplejos de ARNip / PEI modificados con folato funcionalizados para la terapia génica dirigida al cáncer de ovario

Materiales y métodos

Materiales

El óxido de grafeno se obtuvo de Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, China). Ácido fólico (FA), N -hidroxisuccinimida (NHS) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) se adquirieron de Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, China). Se adquirieron PEI 25K ramificado, PEG (PM =2000), agarosa e hidrocloruro de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC · HCL) de Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). La solución tamponada con fosfato (PBS), la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y todos los demás productos químicos se adquirieron en Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Todos los otros productos químicos fueron de grado reactivo. El medio RPMI-1640 (Gibco), suero fetal bovino (FBS) (Gibco), tripsina (Gibco) y tampón TAE 20x se adquirieron en Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China). El kit de recuento de células 8 (CCK-8) se adquirió de Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China). Los reactivos de transfección LysoTrackerRed, paraformaldehído al 4%, 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y Lipofectamine 2000 se adquirieron en Invitrogen Co. Ltd. (China). La sonda de fluorescencia Dil (número de catálogo:C1036) se adquirió de Beyotime Co. Ltd. El ARN de interferencia corto anti-PLK1 (PLK1-homo-581) (ARNip) fue sintetizado por Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Preparación de PEG-GO-PEI-FA

La síntesis de PEG-GO-PEI-FA se realiza de acuerdo con la estrategia que se muestra en la Figura S2 (A). En primer lugar, se sonicó en baño continuo 10 ml de suspensión acuosa de GO (1000 μg / ml) a 50 W durante 2 h. Luego, se agregaron 1 mL de EDC · HCL (5000 μg / mL) y NHC (5000 μg / mL) y se sonicaron intermitentemente durante 30 min a 100 W, seguido de la adición de PEG (10 mg) sonicados durante 30 min y se agitó en un agitador durante 6 ha 0ºC. Para eliminar los reactivos sin reaccionar y obtener la solución de GO-PEG, la mezcla se dializó durante 24 h en agua destilada con una membrana de diálisis (MWCO, 3500 Da). Luego, la solución de GO-PEG se sonicó durante 30 min, se añadió 1 mL de EDC · HCL (5000 μg / mL) y NHC (5000 μg / mL) y se sonicó durante 30 min nuevamente, seguido de la adición de PEI 25K (5000 μg / mL). ) 2 mL. La mezcla se sonicó durante 30 min y se agitó durante 6 ha 0ºC. Posteriormente, para obtener el PEG-GO-PEI, se dializó la mezcla durante 24 h en el agua destilada con una membrana de diálisis (MWCO, 3500 Da) nuevamente. La solución de PEG-GO-PEI se sonicó durante 60 min, se añadió 1 mL de EDC · HCL (5000 μg / mL) y NHC (5000 μg / mL) y se sonicó durante 30 min de nuevo, seguido de la adición de 10 mg de FA a la solución. . La solución se sonicó durante 30 min y se agitó durante 12 ha 0ºC y se dializó durante 48 h para obtener PEG-GO-PEI-FA de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. La solución de nanocomplejos se secó mediante liofilizador al vacío (Biosafer-10D).

Caracterización

El potencial zeta de la superficie y el tamaño medio de partícula de los nanocomplejos en solución acuosa se midieron mediante dispersión de luz dinámica (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, Reino Unido). Las morfologías de los nanocomplejos se observaron mediante microscopio de fuerza atómica en la atmósfera (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Alemania). Los espectros de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) fueron adquiridos por el espectrógrafo Thermo Nicolet 6700 FTIR, utilizando el sedimento de KBr en el rango de 400-4000 cm ⁻¹ . Los espectros de absorción UV-Vis de los nanocomplejos se midieron mediante espectrofotómetro UV-Vis (UV, EV300, EE. UU.). El Raman de los nanocomplejos se midió con un microscopio dispersivo Raman (Senterra R200-L, Alemania) con una longitud de onda de excitación de 532 nm.

Ensayo de bioseguridad in vitro

El SKOV3 (células de cáncer de ovario humano) se adquirió de Keygen (China). Las células se mantuvieron en medio RPMI-1640, complementado con FBS al 10%, penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 g / ml y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía CO ₂ al 5%. . En este estudio, se analizó la citotoxicidad de los materiales en células SKOV3 mediante el ensayo CCK-8. Brevemente, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 6 × 10 ³ células / pocillo en 100 μL de medio 1640 que contiene 10% de FBS y luego se incuban a 37 ° C durante 12 h en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO ₂ . Luego, se agregaron GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA en concentraciones finales que variaban de 10 a 1000 μg / mL y se incubaron con las células durante 12 h adicionales. Otro, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA se incubaron con diferentes tiempos de 4 a 24 h a las concentraciones de 100 μg / mL. Posteriormente, se agregaron 10 μL de CCK-8 a cada pocillo y se incubaron durante otras 3 ha 37 ° C. Después de eso, se midió la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas. Cada experimento grupal se repitió tres veces. La viabilidad celular relativa (%) relacionada con las células de control cultivadas en medio se calculó como (absorbancia de la muestra - absorbancia del blanco) / (absorbancia del control - absorbancia del blanco) × 100%.

Ensayo de retraso en gel de agarosa

La solución tampón TAE 20x se diluyó con agua tratada con DEPC para preparar una solución de agarosa al 1%. Luego, la solución se calentó durante 5 min en un horno microondas para disolver completamente la agarosa. Cuando la temperatura de la solución de agarosa bajó a 55 ° C, se agregó una solución de bromuro de etidio (EB, 0.5 μg / mL) en la proporción de volumen de 10,000:1 y se mezcló uniformemente, posteriormente, la solución de agarosa por enfriamiento para formar gel de agarosa . Se añadieron al agujero la mezcla de PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA y ARNip en diferentes proporciones de peso. El gel se corrió a 110 V y 40 mA durante aproximadamente 60 minutos, y luego se observó y analizó mediante un generador de imágenes ultravioleta.

Estudios de absorción celular de PEG-GO-PEI-FA

Para investigar la captación celular, los nanocomplejos se marcaron con FITC de acuerdo con el método descrito anteriormente con una pequeña modificación [28]. Brevemente, la solución de nanocomplejos (aproximadamente 1 mg / ml, 2,0 ml) se mezcló con 0,2 ml de FITC (26 mM) disuelto en DMSO y luego se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Las mezclas resultantes se dializaron a través de una membrana de 5000 MWCO para eliminar el FITC no marcado y luego se liofilizaron. Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos (que contenía los cubreobjetos) a una densidad de 2 × 10 ⁵ células / pocillo en 2 mL de medio 1640 que contiene 10% de FBS y luego se incuban a 37 ° C durante 12 h en una incubadora de cultivo celular. Luego, el medio en cada pocillo se reemplazó con medio 1640 sin suero. Posteriormente, las células fueron tratadas con diferentes nanocomplejos / FITC. Las células tratadas sin los nanocomplejos son el grupo de control y las células tratadas con PEI 25 K son el grupo de control paralelo. Después de la incubación durante 4 ha 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO ₂ , se retiró el líquido de la placa de cultivo, se lavaron las células dos veces con DPBS frío (pH =7,4), luego se agregaron 20 μL de DAPI y 5 μL de Dil (tinte de citomembrana) a cada pocillo y se incubaron 20 min a 37 ° C bajo la oscuridad. Posteriormente, se retiraron el DAPI y Dil del medio de cultivo y se lavaron dos veces con DPBS frío (pH =7,4), y se sacaron los cubreobjetos de células y se fijaron en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje Permount TM. Posteriormente, la señal de fluorescencia de los portaobjetos de células se observó mediante un microscopio de barrido láser confocal (CLSM) y se analizó la captación celular de nanocomplejos.

Escape endosómico y penetración en el núcleo

Para visualizar la distribución celular, el escape endosómico y la penetración de nanocomplejos, se sembraron células SKOV3 en una placa de 12 pocillos (que contenía los cubreobjetos) a una densidad de 1 × 10 ⁵ células / pocillo en 2 ml de medio 1640 que contiene 10% de FBS y luego se incuban durante 12 h (37 ° C, 5% de CO ₂ ). Luego, el medio en cada pocillo se reemplazó con 1 ml / pocillo de medio 1640 sin suero. Posteriormente, se agregaron los diferentes nanocomplejos (100 μg / mL) marcados por FITC en placa de 12 pocillos para 1 mL / pocillo. Después de 6 h, se retiró el líquido, las células se lavaron dos veces con DPBS frío (pH =7,4) y se añadió LysoTracker Red (5 μg / mL) a la placa de 12 pocillos para 50 μL / pocillo. Después de la incubación durante 15 min a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO ₂ , se retiró el líquido de la placa de 12 pocillos, se lavaron las células dos veces con DPBS frío (pH =7,4), luego se agregaron 20 μL de DAPI a cada pocillo y se incubaron durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad. A continuación, se eliminó el líquido DAPI y se lavó dos veces con DPBS frío (PH =7,4). Posteriormente, con paraformaldehído al 4% fijado 15 min a temperatura ambiente, se retiraron los cubreobjetos y se fijaron en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje Permount TM. La señal de fluorescencia de los portaobjetos se observó mediante microscopía de barrido láser confocal y se analizó el escape lisosómico y la penetración en el núcleo de los nanocomplejos [29].

Análisis de citoinhibición

Analizamos el efecto de inhibición celular de PEG-GO-PEI / siRNA y PEG-GO-PEI-FA / siRNA usando el ensayo CCK-8. En breve, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 6 × 10 ³ células / pocillo en 100 μL de medio 1640 que contiene 10% de FBS y luego se incuban a 37 ° C durante 12 h en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO ₂ . Luego, se agregaron PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA en concentraciones finales que variaban de 10 a 500 μg / mL y se incubaron con las células durante 12 y 24 h adicionales. Luego, se incubaron PEG-GO-PEI / siRNA y PEG-GO-PEI-FA / siRNA con células de 4 a 48 h a una concentración de 100 μg / mL. El ARNip se transfectó con Lipofectamine 2000 y no se trató como grupo de control. Posteriormente, se agregaron 10 μL de CCK-8 a cada pocillo y se incubaron durante otras 3 ha 37 ° C. La absorbancia se midió a 450 nm. Cada experimento grupal se repitió tres veces. La tasa de inhibición (%) se calculó como 1 - (absorbancia de la muestra - absorbancia del blanco) / (absorbancia del control - absorbancia del blanco) × 100%.

Estadísticas

Cada prueba experimental se repitió tres veces y los datos se analizaron utilizando el software SPSS 17.0. Prueba ANOVA unidireccional para análisis de grupos múltiples y t de Student no emparejado La prueba para el análisis de dos grupos se utilizó para la comparación. Los datos se expresaron como media y desviación estándar (DE), y la significación estadística se estableció en p <0.05.

Resultados y discusión

Síntesis de PEG-GO-PEI-FA

La expresión de FR se analizó en primer lugar en diferentes líneas de células cancerosas basadas en la base de datos Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; http://portals.broadinstitute. Org / ccle) [30] y en diferentes tejidos de ovario basados ​​en Gene Expression Profiling Interactive Base de datos de análisis (GEPIA2; http://gepia2.cancer-pku.cn) [31]. Los resultados fueron consistentes con investigaciones previas (Figura S1). Por lo tanto, elegimos FA como ligando de orientación para la entrega de genes.

El óxido de grafeno ciertamente tiene muchos grupos que contienen oxígeno, incluidos carboxilos en el borde, hidroxilos y grupos epoxi en el plano basal producidos por el proceso de oxidación [32]. Para obtener GO a nanoescala (NGO), GO se rompió continuamente mediante sonicación en baño a 50 W durante 2 h y luego siguió la unión covalente de PEG / PEI / FA a GO utilizando la química EDC / NHS, como se ilustra en la Figura S2 (A). La Figura S2 (B) mostró la ruta de tratamiento de PEG-GO-PEI-FA / ARNip. El análisis de la conjugación química se llevó a cabo mediante la tecnología de espectros diferenciales FTIR para obtener los picos de absorción espectral [33]. Como se muestra en la Fig. 1a, la existencia de OH (3425 cm ⁻¹ ), C =O (1719 cm ⁻¹ ) y C =H (1350 cm ⁻¹ ) se encontraron grupos funcionales en GO e indicaron la existencia de hidroxilo y carboxilo en la superficie de GO. CH (2885 cm ⁻¹ ) se pudo encontrar el estiramiento de la banda de vibración cuando el PEG reaccionó con GO a través de enlaces covalentes estables; esto indicó que el PEG se había injertado en GO, y la eficacia de conjugación con PEG fue de aproximadamente el 6%. Después de que PEI y FA reaccionaron con GO, el NH (1590 cm ⁻¹ ), C – N (1420 cm ⁻¹ ) se observó el estiramiento de la banda de vibración, lo que indica que PEI y FA se habían injertado en GO mediante esterificación. Estos resultados demostraron que la conjugación PEG-GO-PEI-FA se sintetizó con éxito.

El exitoso análisis sintético de PEG-GO-PEI-FA utilizando espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) y espectrofotómetro UV-Vis. un Los espectros FTIR de GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA. b Los espectros de absorción UV-Vis de GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA

La Figura 1b mostró los espectros de absorción de UV-Vis de GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA. El GO tuvo un pico de absorción de 223 nm. El FA tenía un pico de absorción de 275 nm. El GO-PEG mostró una curva suave, lo que indica que PEG se había conjugado con GO y suavizó la montaña de GO. El PEG-GO-PEI tenía un pico de absorción en 219 nm, lo que ilustra que el PEI se había injertado en la superficie de GO-PEG. El PEG-GO-PEI-FA tenía un pico de absorción en 219 nm y 275 nm, revelando que el FA se había injertado en el PEG-GO-PEI. Todos estos resultados demostraron aún más la síntesis exitosa de PEG-GO-PEI-FA.

Caracterización de PEG-GO-PEI-FA

Los datos proporcionados en la Tabla 1 mostraron el tamaño de partícula y el potencial zeta de los nanocomplejos. El tamaño de partícula de los nanocomplejos aumentó gradualmente a 218,4 nm mientras que PEG, PEI y FA se injertaban progresivamente en la superficie de GO. El potencial zeta cambió de - 16,5 a + 17,5 mv cuando PEI se conectó a GO, lo que facilitó la capacidad de adsorber ADN o ARN con carga negativa a través de la interacción electrostática y la captación celular. Los potenciales zeta de PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA / siRNA fueron + 14,7 mv y + 14,5 mv, respectivamente. Los potenciales zeta revelaron que PEG-GO-PEI-FA o PEG-GO-PEI-FA / siRNA eran más pequeños que PEG-GO-PEI debido a la carga negativa de FA y siRNA. Estos indicaron que PEG-GO-PEI-FA / siRNA podría adsorberse en la superficie de las células por la interacción de carga y ser utilizado por endocitosis mediada por receptores en la citomembrana [34].

La morfología de la superficie y el tamaño de partícula del nanoportador también se midieron mediante AFM y DLS. Como se muestra en la Fig. 2a, el GO mostró una superficie lisa y una estructura laminar con un tamaño de partícula de 192,1 nm. Después del injerto de PEG, PEI y FA en la superficie de GO, el tamaño de partícula de PEG-GO-PEI-FA aumentó a 216,1 nm y se observaron muchas protuberancias en la superficie de PEG-GO-PEI-FA (Fig. 2b ), lo que sugiere que una gran cantidad de decoraciones se inmovilizaron en las hojas GO. Al mismo tiempo, la altura del PEG-GO-PEI-FA fue mayor que el GO, lo que se debe principalmente a la unión de PEG, PEI y FA en ambos planos de la hoja GO.

La caracterización del sistema de entrega a nanoescala. Se utilizó microscopía de fuerza atómica (AFM) y dispersión dinámica de luz (DLS) para caracterizar la morfología y las distribuciones de tamaño: a GO y b PEG-GO-PEI-FA. Espectros Raman para el análisis de la superficie de óxido de grafeno generado de GO, GO-PEG y PEG-GO-PEI c

La espectroscopia Raman es una de las más utilizadas para medir la caracterización y las propiedades estructurales de los materiales nanocarbonados [35]. Como se muestra en la Fig. 2c, el espectro Raman de GO mostró la banda de vibración a 1600 cm ⁻¹ (Banda G) y 1354 cm ⁻¹ (Banda D), y la relación de área de ID / IG fue 1.0385, lo que indica que la parte SP ² la hibridación de GO se había roto y formado hidroxilo y carboxilo. GO-PEG y PEG-GO-PEI mostraron la banda de vibración a 1595 cm ⁻¹ (Banda G) y 1352 cm ⁻¹ (Banda D) y la relación de área de ID / IG fueron 0,7737 y 0,5238. La relación de área de ID / IG se redujo gradualmente después de la reacción de PEG y PEI con el GO; esto indicó que el PEG y el PEI se habían injertado en la superficie del GO.

Análisis de bioseguridad in vitro de las diferentes ONG funcionales

La cuestión de la bioseguridad de los vectores de genes no virales sigue siendo un desafío importante para las aplicaciones clínicas. Las elevadas cargas positivas no solo produjeron una excelente capacidad para condensar y proteger genes, sino que también provocaron una citotoxicidad grave [36, 37]. Para probar la citotoxicidad de nanocomplejos de ARNip libre, se realizó el ensayo CCK-8 con células SKOV3 que habían sido incubadas durante 4, 8, 12 y 24 h con nanocomplejos libres a diferentes concentraciones (de 10 a 1000 μg / mL). Como se muestra en la Figura S3, los nanocomplejos todavía tenían una alta viabilidad celular en el cáncer de ovario a 1000 μg / mL y 24 h. La citotoxicidad de todos los nanocomplejos mostró una forma dependiente del tiempo y la concentración (viabilidad de las células SKOV3:mayor o igual al 84,38% para todos los nanocomplejos en 1000 μg / mL, y mayor o igual al 94,21% para todos los nanocomplejos a las 24 h). con células SKOV3). Estos resultados sugirieron que los nanocomplejos mostraban una citotoxicidad insignificante y podrían servir como un vector genético biocompatible.

El análisis de nanocomplejos combinados con ARNip

La captación celular de moléculas de ARN libre suele ser complicada debido a las sustanciales cargas negativas que llevan [38]. La carga de biomoléculas cargadas negativamente por polímeros catiónicos se adopta ampliamente para resolver el problema [39]. En este artículo, la carga de ARNip en el vector PEG-GO-PEI-FA se logró mezclando ARNip y PEG-GO-PEI-FA en solución acuosa. Como se muestra en la Tabla 1, el potencial zeta de PEG-GO-PEI-FA fue + 14,7 mV, lo que indica que el ARNip se puede adsorber a la superficie de PEG-GO-PEI-FA mediante interacción electrostática. En este estudio, la capacidad de condensación de genes de los nanocomplejos se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa [40]. La Figura 3a mostró que PEG-GO-PEI tenía una capacidad de condensación evidente hacia ARNip en una relación en peso de 10, mientras que el retraso completo de la migración de ARNip de PEG-GO-PEI-FA se observó cuando la relación en peso alcanzó 20 (Figura 3b). Por lo tanto, PEG-GO-PEI-FA podría proteger el ARNip de la degradación pero, al mismo tiempo, necesita un poco más de nanocomplejo para demostrar una buena capacidad de unión. Esto puede estar asociado con los potenciales zeta de PEG-GO-PEI-FA que no eran tan altos. Estos resultados indicaron que PEG-GO-PEI y PEG-GO-PEI-FA tenían suficiente capacidad de entrega, especialmente PEG-GO-PEI-FA, que exhibió además su potencial como vector válido para la entrega eficiente y segura de genes.

La capacidad de carga de ARNip en diferentes proporciones de peso. Se llevó a cabo un ensayo de retardo en gel de agarosa para evaluar la interacción entre el ARNip y el nanoportador. un PEG-GO-PEI y b PEG-GO-PEI-FA en las distintas proporciones de peso (materiales / ARNip)

Análisis de captación celular

Es tan crucial que los portadores puedan apuntar específicamente a los tumores para la entrega de genes. Para confirmar si el portador de PEG-GO-PEI-FA podría entrar fácilmente en las células, utilizamos FITC como sonda fluorescente para la obtención de imágenes intracelulares. Al mismo tiempo, los núcleos se tiñeron con DAPI y la citomembrana se tiñó con Dil. Como se muestra en la Fig. 4, el grupo de control y el grupo PEG-GO-PEI no mostraron señales de fluorescencia verde alrededor de los núcleos y la citomembrana. Implicaba que PEG-GO-PEI no entraba en las células. El PEI 25K y PEG-GO-PEI-FA / siRNA aparecieron como una señal de fluorescencia verde alrededor del núcleo, lo que demostró claramente que PEG-GO-PEI-FA podía penetrar las membranas celulares y entrar en las células. Los nanocomplejos PEG-GO-PEI-FA mostraron la captación celular más activa, quizás atribuyéndose a que el FA puede unirse específicamente al FR que se sobreexpresa en la superficie de las células SKOV3. Estos resultados sugirieron que FA jugó un papel crítico en la mediación de la captación celular eficiente de nanocomplejos PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA / siRNA. Más importante aún, la capacidad de FA para unirse a su receptor no se vio afectada por el enlace amida covalente y la endocitosis mediada por el receptor no se vio obstaculizada.

Captación celular de diferentes nanocomplejos. Imágenes de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) de la captación celular de diferentes nanocomplejos marcados con FITC en células SKOV3 de cáncer de ovario humano después de la incubación durante 4 h. Azul, núcleos (marcados con DAPI); rojo, citomembrana (marcado con Dil); verde, nanocomplejos (etiquetados con FITC). Las barras de escala representan 100 μm, pero la barra de escala es de 10 μm en una sola celda

Análisis de escape lisosómico

Para el sistema de entrega de ARNip, deben escapar del endosoma o formar lisosomas. Sin embargo, si no es así, el ARNip se degradará o drenará fuera de la célula [41,42,43]. Evaluamos la capacidad de escape endosomal mediante la localización intracelular de los nanocomplejos utilizando CLSM. Dado que muchos informes han demostrado que la PEI 25K puede favorecer el escape endosómico o lisosómico mediante el “efecto de esponja de protones” [44], se utilizó la PEI 25K como control. En este estudio, los nanocomplejos se etiquetaron con FITC. En primer lugar, estimamos que los nanocomplejos entran en el lisosomal por la señal amarilla que la señal fluorescente verde de FITC se superpone con la señal fluorescente roja de Lyto Tracker Red. El PEI 25K apareció como la señal amarilla después de la incubación durante 4 h con células y otros materiales apareció como la señal amarilla después de la incubación durante 2 h con células, lo que implica que los materiales habían entrado en las células (Fig. 5). Ya sea que los nanocomplejos escapen o no del lisosomal por la señal cian brillante, la señal fluorescente verde de FITC se combina con la señal fluorescente azul de DAPI. Como se muestra en la Fig. 5a, la señal verde se observó en la acumulación en los núcleos y hubo una señal cian brillante después de la incubación de PEI / ARNip durante 8 h con células, lo que indica que PEI / ARNip se había escapado del lisosoma. Sin embargo, PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA / siRNA tenían una señal verde débil para penetrar en los núcleos tan pronto como a las 2 h, y una señal más verde acumulada en los núcleos junto con el aumento del tiempo de incubación. Y hubo una señal cian brillante cuando se incubaron PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA / ARNip durante 4 h con células (Fig. 5b, c). Estos indicaron que los materiales se habían escapado del lisosoma tan temprano. En una palabra, estos resultados mostraron que PEG-GO-PEI-FA y PEG-GO-PEI-FA / siRNA siguieron siendo una excelente capacidad de escape endosomal o lisosomal y pueden facilitar eficientemente el escape lisosomal y la transfección génica in vitro.

Internalización celular y escape lisosomal de PEG-GO-PEI-FA observado por CLSM. Células de cáncer de ovario SKOV3 incubadas con a PEI, b PEG-GO-PEI-FA y c PEG-GO-PEI-FA durante 0,5, 1, 2, 4 y 8 h. Aquellos en azul fueron teñidos con DAPI, los verdes fueron nanocomplejos marcados con FITC, y aquellos en rojo representaron endosomas y fluorescencia de lisosomas después de teñir con LysoTracker rojo. Las barras de escala representan 100 μm, pero la barra de escala es de 10 μm en una celda

Evaluación de inhibición celular del ARNip / PEG-GO-PEI-FA

En el caso actual, el efecto terapéutico de PEG-GO-PEI-FA / ARNip se examinó mediante el ensayo CCK-8 en células SKOV3 in vitro. Como se muestra en la Fig. 6a, no encontramos una influencia significativa en la tasa de supervivencia de las células tumorales a diferentes concentraciones (10-100 μg / mL) y diferentes puntos de tiempo (12 y 24 h) en el PEG-GO-PEI- Grupo FA. A pesar de que la concentración era superior a 100 μg / ml, la tasa de supervivencia de las células tumorales seguía siendo superior al 80%. Entonces, elegimos 100 μg / mL para el próximo estudio inhibitorio celular. Se mostró una citotoxicidad más débil en el grupo de PEG-GO-PEI / siRNA y Lipo2000 / siRNA (la tasa de inhibición de menos del 20%). En comparación con PEG-GO-PEI / siRNA y Lipo2000 / siRNA, PEG-GO-PEI-FA / siRNA tuvo un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento de células tumorales SKOV3. PEG-GO-PEI-FA / siRNA inhibió las células SKOV3 de una manera dependiente del tiempo (Fig. 6b). Estos resultados indicaron que PEG-GO-PEI-FA / siRNA tuvo el mejor efecto de inhibición para el incremento de células tumorales y podríamos usar PEG-GO-PEI-FA como un nanoportador ideal para la entrega de genes.

In vitro cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA in ovarian cancer SKOV3 cells via CCK-8 assay. un SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. b The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; * p <0.05 (Student’s t test)

Conclusiones

In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.

Disponibilidad de datos y materiales

All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.

Abreviaturas

AFM:

Microscopio de fuerza atómica

CCK-8:

Cell counting kit8

CCLE:

Cancer cell line encyclopedia

CLSM:

Confocal laser scanning microscope

DAPI:

4′-6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dispersión de luz dinámica

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DPBS:

Dulbecco’s phosphate-buffered saline

EB:

Ethidium bromide

EDC∙HCL:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride

FA:

Folic acid

FBS:

Suero fetal bovino

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FITR:

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

FR:

Folate receptor

GEPIA:

Gene expression profiling interactive analysis

GO:

Óxido de grafeno

MWCO:

Molecular weight cutoff

NGO:

Nanoscale graphene oxide

NHS:

N -hydroxysuccinimide

NP:

Nanopartículas

PBS:

Phosphate-buffered solution

PDI:

Índice de polidispersidad

PEG:

Polietilenglicol

PEI:

Polyethyleneimine

ARNip:

Pequeño ARN interferente

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