Nanopartículas basadas en laminarina entregan protoporfirina IX para terapia fotodinámica mejorada: captación celular, generación de ROS y eficacia in vivo

Resumen

Se diseñaron micelas anfifílicas derivadas de conjugados de laminarina (HLDM) para encapsular el fotosensibilizador hidrofóbico protoporfirina IX (Pp IX) para terapia fotodinámica (PDT) de cáncer de mama. Las micelas resultantes, de ~149 nm de diámetro, mostraron liberación dual sensible a pH y redox, mejorando la solubilidad acuosa y la biocompatibilidad. Estudios in vitro con células MCF-7 revelaron captación celular eficiente, generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por luz y apoptosis marcada por daño nuclear. En un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos, micelas HLDM cargadas con Pp IX combinadas con irradiación a 630 nm produjeron una inhibición pronunciada del crecimiento tumoral sin toxicidad sistémica observable. Estos hallazgos demuestran que una nanoplataforma basada en laminarina puede mejorar notablemente la administración de Pp IX y la eficacia de la PDT in vitro e in vivo.

Introducción

La terapia fotodinámica (PDT) aprovecha un fotosensibilizador, luz y oxígeno molecular para producir ROS que matan selectivamente células tumorales preservando el tejido normal. Ha surgido como opción mínimamente invasiva para diversos tumores —incluyendo mama, hígado, pulmón, melanoma y cáncer de piel—, aunque su adopción clínica se ha visto limitada por la acumulación tumoral limitada de fotosensibilizadores convencionales.

La protoporfirina IX (Pp IX) es un fotosensibilizador potente pero hidrofóbico que a menudo se agrega en medios acuosos, reduciendo su ventana terapéutica. El polisacárido marino laminarina, conocido por su biocompatibilidad y actividad antitumoral intrínseca, ofrece una cubierta hidrofílica que puede estabilizar fármacos hidrofóbicos y conferir propiedades de direccionamiento tumoral mediante sensibilidad a pH y redox.

Reportamos la síntesis de un sistema micelar hematina-laminarina-ditiopropiónico-MGK (HLDM) con doble sensibilidad pH/redox que encapsula Pp IX, con el objetivo de mejorar la solubilidad, aumentar la acumulación tumoral y maximizar la citotoxicidad mediada por ROS.

Métodos

Materiales

Laminarina (Sigma-Aldrich), DMSO, L-glutatión, Hoechst 33342, DMEM, FBS, kit de ensayo ROS (Beyotime), reactivos H&E, Pp IX (Aladdin) y todos los demás reactivos fueron de grado analítico. Células de cáncer de mama humano MCF-7 se obtuvieron de la Universidad de Yantai, y ratonas desnudas (14–18 g) de Beijing Vital River.

Síntesis y caracterización de HLDM

HLDM se sintetizó mediante acilación secuencial de ácido ditiodipropiónico con MGK, seguida de esterificación mediada por EDC/DMAP con laminarina. El producto se verificó por ¹H-RMN, IR y espectroscopía UV-vis.

Preparación de micelas HLDM cargadas con Pp IX

HLDM y Pp IX se co-disolvieron en disolvente orgánico y luego se dializaron contra agua desionizada (PMCO 2000 Da) bajo agitación (600 rpm). Las micelas se recogieron a temperatura ambiente.

Caracterización

El tamaño de partícula y potencial zeta se midieron con analizador Beckman Coulter; la morfología se examinó por TEM (Hitachi H-600). La eficiencia de encapsulación (EE) y carga de fármaco (DL) se calcularon a partir de absorbancia UV-vis a 630 nm.

Cultivo celular y estudios de captación

Las células MCF-7 se cultivaron en DMEM/FBS. Para captación, se incubaron con Pp IX libre, micelas LH o micelas HLDM (20 µg mL⁻¹) durante 1–4 h. La fluorescencia se observó por microscopía invertida (Nikon Eclipse E400).

Localización subcelular

Tras 4 h de incubación, las células se fijaron, contratiñeron con Hoechst 33342 y se obtuvieron imágenes para determinar la distribución de Pp IX.

Detección de ROS

Células MCF-7 se trataron con formulaciones (20 µg mL⁻¹) durante 2 h, irradiaron a 630 nm por 30 min y luego incubaron con DCFH-DA (10 µmol L⁻¹). La fluorescencia (exc 488 nm, em 525 nm) indicó producción de ROS.

Ensayo de fototoxicidad y viabilidad

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos, expuestas a concentraciones variables (1–10 µg mL⁻¹) de cada formulación, irradiadas (630 nm, 30 min) e incubadas 24 h. Se añadió MTT (5 mg mL⁻¹) y se midió absorbancia a 490 nm para calcular viabilidad.

Morfología nuclear

Tras 4 h de tratamiento, las células se fijaron, tiñeron con tinte nuclear y obtuvieron imágenes para evaluar condensación de cromatina.

Eficacia y seguridad in vivo

Células MCF-7 (1,5 × 10⁶) se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos. Una vez que los tumores alcanzaron 70–100 mm³, los ratones recibieron uno de cinco tratamientos: suero salino, Pp IX libre (5 mg kg⁻¹), micelas HLDM (5 mg kg⁻¹ equivalentes de Pp IX), Pp IX libre + luz 630 nm, o micelas HLDM + luz 630 nm. El volumen tumoral y peso corporal se monitorizaron cada dos días; los ratones se sacrificaron al día 20 para histología (H&E).

Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± DE (n = 3). Las diferencias se evaluaron por ANOVA de una vía, con *P < 0,05 considerado significativo.

Resultados y discusión

Caracterización de HLDM

El ¹H-RMN confirmó la conjugación exitosa de MGK, ácido ditiodipropiónico, hematina y laminarina, con picos característicos a δ 0,8, 2,8, 6,5 y 3–4 ppm. Los espectros IR mostraron la banda carbonilo éster esperada, y UV-vis una absorción distinta a 580 nm correspondiente a hematina en HLDM.

Propiedades de las micelas

La dispersión dinámica de luz reveló diámetro promedio de 149,3 ± 35 nm y potencial zeta cercano a neutro. Imágenes TEM confirmaron morfología esférica con agregación ocasional a concentraciones mayores. EE y DL fueron 68 % y 12 %, respectivamente, indicando carga eficiente.

Captación celular

La imagen de fluorescencia demostró acumulación dependiente de tiempo y dosis de Pp IX en células MCF-7, con micelas HLDM mostrando captación marcadamente superior a Pp IX libre o micelas LH. La captación mejorada se atribuye al mecanismo de liberación sensible a pH/redox.

Distribución subcelular

Estudios de co-localización revelaron acumulación predominante citoplasmática y mitocondrial de Pp IX entregado por micelas HLDM, consistente con el direccionamiento organelar conocido de Pp IX.

Generación de ROS

La fluorescencia de DCFH-DA fue significativamente mayor en células tratadas con micelas HLDM más luz comparado con Pp IX libre, confirmando producción robusta de ROS solo bajo iluminación.

Fototoxicidad

Bajo irradiación, micelas HLDM lograron >80 % muerte celular a 5 µg mL⁻¹, mientras que Pp IX libre requirió >10 µg mL⁻¹ para efecto comparable. En oscuridad, todas las formulaciones exhibieron citotoxicidad mínima.

Morfología nuclear

Micelas HLDM cargadas con Pp IX indujeron condensación de cromatina y fragmentación nuclear dependiente de dosis, indicativa de apoptosis.

Eficacia in vivo

Solo el grupo de micelas HLDM recibiendo luz 630 nm mostró inhibición significativa del crecimiento tumoral (≈ 70 % reducción al día 20). Pp IX libre con luz produjo supresión modesta, mientras que grupos salino y no irradiados continuaron creciendo. El peso corporal permaneció estable en todos los grupos, y tinción H&E reveló necrosis extensa en la cohorte HLDM + luz.

Conclusiones

Hemos diseñado una micela basada en laminarina, con doble sensibilidad pH/redox, que encapsula eficientemente Pp IX, mejora su solubilidad y facilita liberación tumoral-específica. El sistema entrega potente fototoxicidad mediada por ROS in vitro y logra actividad antitumoral pronunciada in vivo sin toxicidad sistémica. Estos resultados posicionan a las micelas HLDM como plataforma prometedora para futura terapia fotodinámica de cáncer de mama y otros tumores sólidos.

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este artículo están incluidos dentro del artículo.

Abreviaturas

HLDM

Hematina-Laminarina-Ditiopropiónico-MGK

LH

Laminarina-Hematina

Pp IX

Protoporfirina IX

PDT

Terapia fotodinámica

ROS

Especies reactivas de oxígeno