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Nanopartículas de laminarina cargadas con protoporfirina IX para el tratamiento contra el cáncer, su comportamiento celular, detección de ROS y estudios en animales

Resumen

En este estudio se propusieron partículas nanoescaladas a base de conjugado de laminarina como un sistema de administración de protoporfirina IX (Pp IX) en la terapia fotodinámica (TFD) de células de cáncer de mama humano (MCF-7). El ácido hematín-laminarina-ditiodipropiónico-MGK, denominado HLDM, era un material portador anfifílico con doble pH / redox sensible que podía usarse para cargar fármacos hidrófobos para mejorar su solubilidad y mejorar la biocompatibilidad. Por lo tanto, combinamos el fotosensibilizador (Pp IX) con HLDM para fabricar nuevas nano-micelas, en este documento denominadas micelas HLDM cargadas con Pp IX. Las micelas de HLDM cargadas con Pp IX tenían un tamaño de 149,3 ± 35 nm en agua neutra. Se examinaron la fototoxicidad, el efecto de la TFD in vitro y la sensibilidad dual al pH y al microambiente redox de las micelas de HLDM cargadas con Pp IX a diferentes concentraciones utilizando células de cáncer de mama humano MCF-7. Los experimentos sobre fototoxicidad y producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) demostraron que las micelas pueden producir PDT para matar las células cancerosas con una cierta longitud de onda de luz. El experimento de apoptosis indicó que las micelas podrían causar daño nuclear. Se estudió el efecto PDT in vivo de las micelas construyendo el modelo de ratón desnudo portador de tumores de células MCF-7. Los estudios in vivo mostraron que las micelas de HLDM cargadas con Pp IX podrían inducir un efecto antitumoral notable. Una plataforma de nanomedicina basada en laminarina prometedora actúa como un nuevo sistema de administración de fármacos para mejorar la absorción, acumulación y eficacia de la TFD de Pp IX in vitro e in vivo.

Introducción

La terapia fotodinámica (TFD) [1,2,3] es un tipo establecido de terapia afectado por la fuente de luz, el fotosensibilizador y el oxígeno molecular [4], que puede producir especies reactivas de oxígeno (ROS) mediadas [5, 6] letal directo efectos sobre las células cancerosas dentro del área iluminada bajo la condición de naturaleza mínimamente invasiva [6] y baja toxicidad. Puede dar lugar a daños en el ADN [7], activar vías de señalización para facilitar la reacción vasculotóxica que interrumpe el suministro de sangre al área del tumor [8] y provocar el reconocimiento y destrucción de las células tumorales por parte del sistema inmunológico [9]. El efecto final es vencer la resistencia a los medicamentos [10, 11] y provocar un efecto antitumoral selectivo, lo que resulta en la muerte de las células cancerosas.

En la actualidad, los tratamientos tradicionales para el tumor [12], como la radioterapia, la quimioterapia y la cirugía, se utilizan ampliamente en la clínica, pero estos métodos tienen grandes efectos tóxicos y secundarios, gran trauma, gran riesgo, ciertas limitaciones y fácil recidiva. La TFD se utiliza en el tratamiento del cáncer extenso, incluido el cáncer de mama [13,14,15], de hepatocitos [14], de pulmón [16], de melanoma [17] y de piel [18], y se ha convertido en el centro de atención de investigadores nacionales y extranjeros. . La experiencia ha demostrado que la TFD es una mejor opción para alternar métodos convencionales como la quimioterapia [19] y la cirugía en la terapia de diversas enfermedades y tumores [20], ya que tiene ventajas como inhibir la metástasis del cáncer [21] y ser selectiva y adaptable. Sin embargo, las aplicaciones de la mayoría de los fotosensibilizadores se han visto limitadas en la terapia del cáncer debido a su acumulación limitada en el sitio del tumor [22].

La protoporfirina IX (Pp IX) es un fotosensibilizador hidrófobo [23, 24] que tiene un gran potencial para su uso en el diagnóstico y la TFD. La Pp IX es un derivado de la hematoporfirina que también puede provocar apoptosis sin estímulos externos (como la luz láser [25]), lo que demuestra que es probable que tenga una función novedosa para remediar el cáncer [26].

La acumulación tópica de Pp IX en lesiones premalignas y malignas es, por tanto, una estrategia interesante que proporcionar [27], ya que su fluorescencia proporciona un método conveniente para la orientación del tumor [28].

Sin embargo, la Pp IX tiene algunas desventajas que deben resolverse [29], como que tiene poca solubilidad y es fácil de agregar en solución acuosa, lo que resulta en una eficacia reducida. Por tanto, la laminarina [30] es un biomaterial portador de nanomedicina marina que se utiliza como portador de grupo hidrófilo para mejorar las características desfavorables de los fotosensibilizadores. Se ha comprobado que la laminarina posee actividades biológicas efectivas, incluidas las antitumorales, antivirales, etc. La evidencia acumulada sugiere [31] que tiene una buena eficacia terapéutica en diferentes tipos de células cancerosas in vitro e in vivo (como las células cancerosas de mama y colon [32]).

Las nanopartículas de polímero que responden a la estimulación, como los liposomas y las micelas, pueden garantizar aún más la administración del fármaco y reducir los efectos secundarios. Los liposomas [33] se pueden utilizar como herramientas de diagnóstico y terapéuticas, y la anfotericina B se puede incorporar a los liposomas para tratar las infecciones fúngicas [34]. Las nanopartículas micelares poliméricas [35] son ​​un suministro inteligente de fármacos [36]. Las micelas de hematina-laminarina-ácido ditiodipropiónico-MGK (HLDM) cargadas con Pp IX con doble pH / redox sensible y fotorrespuesta contienen un núcleo hidrófobo para cargar Pp IX, así como una capa hidrófila de laminarina. Han sido una de las administraciones nanoscópicas de fármacos más importantes para mejorar las características desfavorables de los fotosensibilizadores [37], como la biodistribución del fármaco, los efectos adversos y la liberación cargada del fármaco [38, 39].

Con respecto a esto, por lo tanto, diseñamos una nanoplataforma multifuncional de administración de fármacos [40] basada en laminarina en respuesta al pH [41] y las propiedades redox [42], que podría mantener la solubilidad en agua y apagar la Pp IX en la circulación sanguínea del cuerpo humano mientras extinción de la Pp IX en sitios específicos [43]. El tipo de administración de fármacos que responde a estímulos internos y externos ha recibido una gran atención, como la temperatura [44], la ecografía [45], el pH y la redox. Se ha estudiado un sistema de respuesta térmica para controlar la administración de fármacos, lo que muestra un potencial para una mejor administración de fármacos [46]. El sistema de administración de fármacos que responde a los estímulos ha promovido la liberación continua de fármacos bajo demanda [47] de forma irreversible y distribuida rápidamente.

En este estudio, se prepararon micelas de HLDM cargadas con Pp IX para superar algunas desventajas de la Pp IX [48], como la inestabilidad y la agregación en la solución acuosa. Presumimos que las micelas HLDM cargadas con Pp IX, autoensambladas a partir de nanoportadores HLDM [49], deberían acumularse y liberarse Pp IX en el microambiente tumoral [50]. Se estimuló la Pp IX para facilitar la generación de ROS después de la acumulación de Pp IX en las células tumorales, lo que podría causar la muerte de las células cancerosas (como en la Fig. 1). La síntesis y caracterización de materiales HLDM había sido probada por 1H-NMR como se informó anteriormente [51]. Entonces, en el presente trabajo, se estudiaron la captación celular, la fototoxicidad, la generación de ROS, la observación morfológica nuclear y el efecto de la TFD in vivo de las micelas de HLDM cargadas con Pp IX.

Ilustración esquemática de nanomedicina basada en laminarina (HLDM) utilizada para administrar el fotosensibilizador para la terapia tumoral

Métodos

Materiales

La laminarina se adquirió de Sigma-Aldrich (Shanghai, RP China). El dimetilsulfóxido (DMSO) fue suministrado por Tianjin Bodi Co. Ltd. El l-glutatión (GSH), Hoechst 33342 fue proporcionado por Sigma-Aldrich (Shanghai, PR China). El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y el suero fetal bovino (FBS) se obtuvieron de Science Biotechnology Co. Ltd. (Shangdong, Yantai, China). El kit de ensayo de especies reactivas de oxígeno (ROS) fue proporcionado por Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). H y E se adquirieron en Bioworld Technology Co. Ltd. (Nanjing, China). Pp IX fue suministrado por Aladdin Reagent Net (Shanghai, China). Todos los demás reactivos y disolventes eran de grado químico.

Las células de cáncer de mama humano (MCF-7) fueron suministradas por el Laboratorio de Farmacología Molecular de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Yantai (Shandong, China).

Se compraron ratones desnudos hembra que pesaban 14-18 g (3-4 semanas) de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.

Síntesis y caracterización de materiales HLDM

Los materiales de HLDM se sintetizaron y proporcionaron utilizando los métodos presentados en informes anteriores [51]. En primer lugar, se utilizó cloruro de oxaloílo para activar el ácido ditiopropiónico en cloruro de acilo, que se aciló con MGK para obtener HOOC-S-S-MGK. Después de eso, se usaron clorhidrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDCI) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) para activar HOOC-S-S-MGK, y luego se llevó a cabo la reacción de esterificación con laminarina a 40 ° C. Finalmente, sintetizamos los materiales HLDM mediante esterificación utilizando EDC / DMAP como catalizador. El DMSO-D 6 y D 2 Se eligió O como disolvente para analizar la composición de los compuestos. Y 1 Los espectros de H-NMR (Advance Bruker 400M; Switzerland Bruker Company, Madison, WI, EE. UU.), Los espectros de infrarrojos y los espectros de absorción UV-visible (200-700 nm) para materiales HLDM se probaron y se determinaron a temperatura ambiente.

Preparación de micelas de autoensamblaje (micelas HLDM cargadas con Pp IX)

Las micelas de HLDM cargadas con Pp IX se aprovecharon mediante el método de diálisis. En pocas palabras, un núcleo hidrófobo consta de MGK, ácido ditiodipropiónico y hematina, así como una capa hidrófila de laminarina que podría autoensamblarse en agua para formar polimicelas. Se cargó Pp IX en el núcleo hidrófobo durante la agitación para obtener micelas de HLDM cargadas con Pp IX. Se dializaron HLDM y Pp IX en agua desionizada (MWCO 2000 Da) en un agitador 90-1 a 600 rpm después de agitar durante un tiempo razonable en reactivo orgánico para disolverse, seguido del procesamiento posterior, para obtener micelas de HLDM cargadas con Pp IX. Todo el procedimiento se llevó a cabo a temperatura ambiente.

Caracterización de micelas

El tamaño de partícula y el potencial zeta para las micelas de HLDM cargadas con Pp IX se determinaron utilizando el analizador de partículas Beckman Coulter (número de pieza:A35878) a temperatura ambiente. La morfología de las micelas HLDM cargadas con Pp IX se visualizó mediante un microscopio electrónico de transmisión H-600 (H-600 TEM; Hitachi, Tokio, Japón). Para determinar la capacidad de carga, las micelas de HLDM cargadas con Pp IX se rompieron mediante un aparato ultrasónico en un reactivo orgánico. La concentración de Pp IX libre en micelas se midió mediante espectros de absorción UV-visible a 630 nm. La eficiencia de atrapamiento (EE) y el contenido de carga de fármaco (DL) se calcularon de acuerdo con la fórmula.

EE (%) =(peso de Pp IX en las micelas de HLDM cargadas con Pp IX / peso de la Pp IX total) × 100%

DL (%) =(peso de Pp IX en las micelas HLDM cargadas con Pp IX / peso de las micelas) × 100%

Cultivo celular

Las líneas celulares de cáncer de mama humano (MCF-7), las líneas celulares de cáncer de colon (CT-26) (Fig.5) y las líneas celulares de cáncer de pulmón (A549) (Fig.5) se utilizaron para determinar las micelas de HLDM cargadas con Pp IX. por microscopio de fluorescencia invertido (AxioVert.A1). Se había probado preliminarmente de forma generalizada que estos materiales tenían un efecto antitumoral. Pero el experimento demostró que MCF-7 podría tener más absorción que las otras dos líneas de células cancerosas. Por lo tanto, se seleccionó MCF-7, cultivado en DMEM (Hyclone) con suero bovino fetal al 10%, para controlar el efecto curativo a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 .

Captación de celda

El medio fresco que contiene Pp IX libre, micelas de laminarina-hematina (LH) cargadas con Pp IX o micelas de HLDM cargadas con Pp IX se agregaron para reemplazar el medio original después de 24 h, respectivamente. Las células MCF-7 luego se cultivaron durante 1 h, 2 hy 4 h (concentración de Pp IX:20 μg / mL) o durante 4 h con las siguientes concentraciones diferentes de Pp IX:10 μg / mL, 20 μg / mL, y 50 μg / mL en la atmósfera anterior. La consecuencia de la captación celular se observó mediante un microscopio de fluorescencia invertido (Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokio, Japón) para tener un análisis cualitativo [52].

Estudio de ubicación de celda

En este estudio, la Pp IX no solo fue un fármaco contra el cáncer para provocar la muerte de las células cancerosas, sino también una sonda de fluorescencia roja para localizar la captación. Las células MCF-7 en medio fresco que contenía Pp IX libre, micelas de LH cargadas con Pp IX o micelas de HLDM cargadas con Pp IX se cultivaron durante 4 horas a una concentración de 20 μg / ml por encima de la atmósfera. Después de fijar con paraformaldehído al 4%, se reemplazó el fijador por Hoechst 33342 (10 μg / mL) para teñir el núcleo durante 15 min. El resultado de la ubicación se visualizó mediante un microscopio de fluorescencia invertido.

Medición de la generación de especies reactivas de oxígeno

La capacidad de generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) se midió intracelularmente utilizando un microscopio de fluorescencia, que utilizó la sonda ROS 2 ', 7'-diacetato de diclorofluorescina (DCFH-DA). Se sembró MCF-7 en placas de seis pocillos y se incubó. Después de 24 h, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco que contenía micelas de HLDM cargadas con Pp IX libre o Pp IX (20 μg / ml) durante 2 h. Las células se lavaron con medio DMEM, seguido de media hora de irradiación (630 nm). Después de lavar dos veces, las células MCF-7 se incubaron con DCFH-DA (10 μmol / L) por encima de la atmósfera durante 30 min, que luego se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia (longitud de onda de excitación:488 nm, longitud de onda de emisión:525 nm) después de lavar nuevamente con medio DMEM.

Ensayos de viabilidad y fototoxicidad

Se inoculó MCF-7 en una planta de 96 pocillos para detectar la citotoxicidad de diferentes formas de dosificación para los ensayos de viabilidad. A continuación, se añadió en cada pocillo el DMEM reciente que incluía diferentes concentraciones de Pp IX libre, micelas de LH cargadas con Pp IX o micelas de HLDM cargadas con Pp IX (1, ​​2, 5 y 10 μg / ml). Para el grupo de fototoxicidad, las células se incubaron durante 4 h para absorber, y se irradiaron adicionalmente durante 30 min, seguido de incubación durante 24 h a la atmósfera por encima de la temperatura. Por otro lado, los pozos se configuraron para analizar la citotoxicidad y viabilidad en condiciones de oscuridad como grupo de control. Se inocularon adicionalmente durante 24 h por encima de la atmósfera.

Luego se agregaron veinte microlitros de solución de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio (MTT) (5 mg / mL) y 180 μL de PBS (pH 7,4) en 96 pocillos placa y se incubó durante otras 3 h. Posteriormente, se utilizaron 150 μL de DMSO para soluto del producto de formazán y se midió la absorbancia (DO) utilizando un instrumento marcado con enzima (SpectraMax M 5) a 490 nm. La viabilidad de MCF-7 se expresó mediante la siguiente fórmula:

Viabilidad =((OD muestra-OD negro) / (OD control-OD negro)) × 100%.

Los valores de DO de la muestra fueron proporcionados por las células tratadas con el fármaco, mientras que los valores del control de DO fueron proporcionados por las células sin fármaco, y los valores de OD negro se obtuvieron de los pocillos sin fármaco ni células.

Observación morfológica nuclear

La línea celular MCF-7 se incubó durante 24 h, y luego se estimuló con micelas de HLDM cargadas con Pp IX durante 4 h. Después de enjuagar y fijar, las células se tiñeron con una sonda de fluorescencia nuclear durante 20 min a 37 ° C, seguido de la eliminación del tinte del medio ambiente usando PBS. Las imágenes de fluorescencia correspondientes se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia.

Evaluación in vivo de eficacia y seguridad

Posteriormente se utilizaron ratones desnudos hembra para investigar la viabilidad anticancerosa de las micelas de HLDM cargadas con Pp IX in vivo. Células MCF-7 (1,5 × 10 6 células / 0,1 ml) en oxter de ratones desnudos hembra como modelos animales, y luego se administró estrógeno por sonda intragástrica para promover el crecimiento del tumor. Los ratones se dividieron al azar en cinco grupos una vez que el volumen de los tumores alcanzó aproximadamente 70-100 mm 3 , que se indicaron como solución salina normal, Pp IX libre (5 mg / kg), micelas de HLDM cargadas con Pp IX (5 mg / kg de equivalentes de Pp IX libres), Pp IX libre (5 mg / kg) más irradiación de luz, y Micelas de HLDM cargadas con Pp IX (5 mg / kg de equivalentes de Pp IX libres) más irradiación de luz. Los grupos tratados con luz se expusieron a láser de 630 nm con 30 min a las 24 h después de la inyección. La eficacia terapéutica se evaluó controlando los volúmenes tumorales en cinco grupos tratados cada dos días y analizando el portaobjetos histopatológico después de 20 días. Y se midieron los pesos corporales para evaluar la seguridad del fármaco en cinco grupos tratados cada 2 días [53].

Análisis estadístico

Todos los datos de este estudio se registraron como medias ± desviación estándar ( n =3). Además, las diferencias significativas entre los diferentes grupos se analizaron mediante el análisis de variación unidireccional (ANOVA). Se consideró que las diferencias eran estadísticamente significativas a niveles de probabilidad de * P < 0.05 (significativo), ** P < 0,01 (muy significativo).

Resultados y discusión

Caracterización de materiales HLDM

1 Los espectros de H-NMR para los materiales HLDM se mostraron en informes anteriores [51]. El pico de metilo para MGK se observó a aproximadamente δ:0,8 (Fig. 2h). 1 Los espectros de H-NMR revelaron un pico de absorción a aproximadamente δ:2.8 (Fig. 2g), que era CH 2 en ácido 3,3-ditiodipropiónico. La aparición del pico de señal en δ:6,5 (Fig. 2j) verificó la presencia de hematina. El pico característico de la laminarina en materiales poliméricos anfifílicos se encontró en la región entre 3 y 4 ppm, lo que indica que el nuevo producto de HLDM se había sintetizado con éxito.

El 1 Espectros de H-NMR de HLDM

Espectros IR para HLDM

Los espectros de IR de los materiales HLDM se mostraron en informes anteriores [51]. El doble pico en la imagen atestigua la conexión del MCK. Además, el pico caracterizado del grupo éster carbonilo se observó en los espectros de IR.

Espectros de absorción visible UV de HLDM

En la Fig. 3a, la hematina tenía una longitud de onda de absorción ultravioleta (aproximadamente 580 nm) y en la Fig. 3b, Laminarina-ácido ditiodipropiónico-MGK no tenía absorción en la misma posición. Los espectros de absorción UV-visible se realizaron para verificar el enlace de la hematina basándose en esto. El resultado indicó que se observó la longitud de onda de absorción caracterizada en 580 nm en materiales HLDM (Fig. 3c). Hematin se había conectado con éxito a los materiales de HLDM.

Espectros de absorción UV-visible de hematina ( a ), Laminarin-S-S-MGK ( b ) y HLDM ( c )

Caracterización de micelas cargadas con Pp IX

El tamaño y el potencial zeta de las micelas de HLDM cargadas con Pp IX se muestran en la Fig. 4a, b. Se demostró que las micelas habían sido absorbidas mejor por las células cancerosas, para mejorar la eficiencia y reducir los efectos secundarios (mayor permeabilidad y efecto de retención, EPR). Las micelas se observaron a simple vista después del filtro de membrana Millipore en la Fig. 4c. Sobre esta base, la imagen de micelas de HLDM cargadas con Pp IX se escaneó mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM) como se muestra en la Fig. 4d. La morfología fue de partículas no uniformes, lo que se debió a que el tiempo para la ecografía fue deficiente. Por otro lado, en la imagen se observó la aglomeración de partículas, probablemente debido a la mayor concentración (Fig. 5).

un , b El tamaño y el potencial zeta de las micelas de HLDM cargadas con Pp IX. c Las micelas de HLDM cargadas con Pp IX en agua. d La imagen TEM de las micelas HLDM cargadas con Pp IX

Captación de micelas de HLDM cargadas con Pp IX, LH cargadas con Pp IX y Pp IX libres en CT-26 (izquierda) y A549 (derecha)

La eficiencia de atrapamiento (EE) y el contenido de carga de fármaco (DL) se calcularon mediante la fórmula (Tabla 1). Después de muchos experimentos, se descubrió que la fluctuación de EE y DL era inestable, ya que habíamos especulado que las micelas de HLDM cargadas con Pp IX podrían agregarse en solución acuosa.

Captación celular

En este estudio, se detectó la fluorescencia de Pp IX para investigar la dependencia del tiempo y la concentración. Como se ve en el diagrama, las micelas de HLDM cargadas con Pp IX se absorbieron en células MCF-7 y su intensidad de fluorescencia aumentó con el tiempo y la concentración. Comparando las tres micelas en la Fig. 6a, las células cancerosas que recibieron micelas de HLDM cargadas con Pp IX tenían más fluorescencia. Esto se debió a que los restos de pH / redox se habían unido a los materiales para responder al microambiente del tumor. Las células cancerosas que recibieron Pp IX libre tenían una fluorescencia más débil debido a la agregación en DMEM.

un Captación de micelas de HLDM cargadas con Pp IX, LH cargadas con Pp IX y Pp IX libres. b Ubicación celular de micelas HLDM cargadas con Pp IX

De lo que se ha discutido anteriormente, podemos sacar la conclusión segura de que los materiales HLDM, incluidos los restos de pH y sensibilidad a la reducción, pueden mejorar la aglomeración de Pp IX y mejorar su absorción y liberación en las células tumorales.

Estudio de ubicación de celda

Como se muestra en la Fig. 6b, el núcleo se tiñó con tinte fluorescente, y luego pudimos ver el fenómeno de fluorescencia roja presentado fuera de la fluorescencia azul. Habíamos especulado que la captación celular podría estar relacionada con el citoplasma, por lo que esta hipótesis fue verificada por el estudio anterior de que Pp IX se había acumulado y localizado en las mitocondrias y el citoplasma de las células tumorales [54].

Medición de la generación de especies de oxígeno reactivo

Como se muestra en la Fig. 7, la especie de oxígeno reactivo (ROS) en las células MCF-7 se controló usando DCFH-DA como indicador, que se había observado que tenía fluorescencia verde en microscopía de fluorescencia. Las micelas de HLDM cargadas con Pp IX tenían una intensidad más fuerte de fluorescencia verde bajo la luz, mientras que la Pp IX libre apenas tenía fluorescencia. Habíamos especulado que la Pp IX libre podría aglomerarse para causar un efecto de auto-extinción en DMEM. La fluorescencia verde de tres grupos fue insignificante sin luz (como el grupo de control). Estos resultados confirmaron que la Pp IX podría estimular el oxígeno para generar ROS como fotosensibilizador en condiciones de luz.

Generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en condiciones de luz

Ensayo de viabilidad y fototoxicidad

Se realizaron ensayos de viabilidad y citotoxicidad celular con las células cancerosas MCF-7 de mama humana en dos entornos externos diferentes, utilizando el ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 8a, la diferencia significativa de daño celular fue insignificante en todas las muestras en la oscuridad. Cuando la concentración de Pp IX se incrementó a 50 μg / mL, la viabilidad de las células MCF-7 que detectamos permaneció en un nivel alto. El fenómeno mostró que la citotoxicidad para las células u órganos no aumentaba significativamente con el aumento de la concentración de Pp IX.

un Viabilidad de las células MCF-7 de Pp IX libre, micelas de LH cargadas con Pp IX o micelas de HLDM cargadas con Pp IX en condiciones de luz. b Toxicidad relativa a la luz de Pp IX libre, micelas de LH cargadas con Pp IX o micelas de HLDM cargadas con Pp IX tras la irradiación. n =3; * indica P < 0,05

Como se muestra en la Fig. 8b, 5 μg / mL de Pp IX tuvo una diferencia significativa en los grupos de fármacos libres y micelas. La citotoxicidad para las células u órganos aumentó significativamente en el grupo de las micelas, ya que la concentración de Pp IX aumentó bajo la luz, mientras que los grupos de Pp IX libres mostraron pocos cambios hasta una concentración de 10 μg / mL. Estos datos mostraron que la eficacia fototóxica de las micelas cargadas con Pp IX era claramente superior a la de la Pp IX libre. Una vez más, el experimento demostró que el fotosensibilizador libre podría acumularse para causar un efecto de auto-extinción. Por lo tanto, podemos concluir que las micelas de HLDM cargadas con Pp IX tienen un enorme potencial para matar células cancerosas con irradiación de luz.

Observación morfológica nuclear

En el estudio de ubicación celular, descubrimos sin saberlo que el núcleo teñido mostraba manchas blancas, y la mayor concentración de Pp IX era más obvia con este fenómeno. Quizás esto se debió al daño del ADN en el núcleo. Como se muestra en la Fig. 8, las micelas de HLDM cargadas con Pp IX a 20 μg / ml podrían causar daño al ADN en comparación con el control correspondiente en MCF-7. Cuando la concentración alcanza los 50 μg / mL, el daño sería grave en las células cancerosas. El estudio de observación morfológica nuclear sugirió que el daño del ADN fue un marcador temprano de la muerte de las células MCF-7 inducida por Pp IX [26] (Fig. 9).

Daño al ADN de las células MCF-7 después del tratamiento con Pp IX

Evaluación de seguridad y eficacia in vivo

Como se muestra en la Fig. 10a, b, se midió el crecimiento tumoral de cinco grupos para evaluar la eficacia in vivo. El grupo tratado con solución salina mostró un crecimiento continuo a una tasa relativamente alta. No hubo diferencia significativa entre los grupos tratados con Pp IX libre y micelas de HLDM cargadas con Pp IX y el grupo de solución salina. Estos datos indicaron que el volumen del tumor se vio menos afectado por Pp IX sin irradiación. Mientras tanto, el grupo tratado con Pp IX libre más luz produjo un ligero cambio en el volumen del tumor. Lo que provocó este fenómeno fue que el fármaco libre era inestable in vivo y, por tanto, era fácil de recoger en sangre. Por lo tanto, podría haberse eliminado antes de llegar al tejido tumoral. Por el contrario, el crecimiento tumoral tratado con micelas de HLDM cargadas con Pp IX se inhibió significativamente en la Fig. 10a. Este fenómeno demostró que las micelas exhibían un efecto antitumoral significativo después de dar una cierta longitud de onda de luz para estimular. En resumen, este experimento demostró que los efectos antitumorales de las micelas de HLDM cargadas con Pp IX habían mejorado obviamente en condiciones de luz.

Evaluación de la seguridad y la actividad antitumoral in vivo. un El volumen del tumor cambia durante los tiempos de tratamiento. b Volumen tumoral de cinco grupos:( a ) solución salina normal, ( b ) Pp IX libre (5 mg / kg), ( c ) Micelas de HLDM cargadas con Pp IX (5 mg / kg de equivalentes de Pp IX libres), ( d ) Pp IX libre (5 mg / kg) más irradiación de luz, y ( e ) Micelas de HLDM cargadas con Pp IX (5 mg / kg de equivalentes de Pp IX libres) más irradiación de luz. c El cambio corporal de los ratones desnudos portadores de tumores

Por otro lado, se midió el peso corporal relativo para evaluar la seguridad de las micelas de HLDM cargadas con Pp IX (Fig. 10c). No hubo una pérdida de peso corporal evidente y cambios insignificantes en todos los grupos, lo que sugiere la buena bioseguridad de estos tratamientos para los ratones.

Además, el portaobjetos histopatológico mostró un polimorfismo nuclear claro en el grupo de solución salina en la Fig. 11. Los cambios patológicos en el tejido tumoral teñido con hematoxilina y eosina (H&E) tuvieron una diferencia significativa en cinco grupos. Los resultados mostraron una ligera condensación nuclear en las micelas de HLDM cargadas con Pp IX y en los grupos de Pp IX libres. Los tejidos tumorales del grupo de micelas de HLDM cargadas con Pp IX (más luz) exhibieron un daño nuclear obvio. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que estos resultados eran consistentes con los resultados anteriores para la evaluación de la eficacia y seguridad in vivo.

Tinción de tumores H&E con diferentes formulaciones. Todos los datos se expresan como media ± DE. n =3; * indica P < 0,05

Hasta la fecha, se han estudiado diversos materiales para la administración de fármacos [55]. En el estudio anterior, sintetizamos con éxito conjugados de laminarina de polisacárido marino duales sensibles al pH / redox [56], y en esta investigación, los conjugados se utilizaron como sistema de administración de Pp IX, para lograr efectos antitumorales. Los experimentos in vivo manifestaron que las micelas de HLDM cargadas con Pp IX podrían administrar eficazmente Pp IX a las células cancerosas y generar efectos letales directos mediados por ROS en las células cancerosas. Los experimentos de citotoxicidad mostraron que las micelas tenían una ligera citotoxicidad sin irradiación de luz, mientras que las soluciones de baja concentración de micelas tenían un impacto notable en la viabilidad celular dentro de una cierta iluminación. A nivel animal, las micelas de HLDM cargadas con Pp IX ejercieron un efecto fototóxico para producir un efecto antitumoral relevante. Por lo tanto, las actividades de las micelas HLDM cargadas con Pp IX se certificaron de manera convincente in vitro e in vivo.

Conclusiones

A novel laminarin-based nanomedicine platform to address undesirable characteristics of Pp IX such as instability and astatic distribution was successfully studied in this research. The photosensitivity and phototoxicity of Pp IX-loaded HLDM micelles were detected and evaluated in vitro and in vivo. Nuclear morphological observation of Pp IX showed that the Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively deliver and accumulate Pp IX to cancer cells and cause nuclear damage. The research on phototoxicity and ROS production manifested that Pp IX-loaded HLDM micelles exhibited a relevant PDT effect, exerting anti-tumor activity with a certain wavelength light. Likewise, the in vivo research testified that the Pp IX-loaded HLDM micelles could induce PDT effect under the light condition, which could remarkably enhance the anti-tumor effect of Pp IX. To sum up, the results for in vitro and in vivo studies indicated that Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively produce PDT effect and can be applied in the future in tumor treatment in the next research. This promising laminarin-based nanomedicine platform will have great potential for becoming new drug delivery system [57] to deliver hydrophobic photosensitizer for cancer photodynamic therapy (PDT).

Disponibilidad de datos y materiales

The datasets supporting the conclusions of this article are included within the article.

Abreviaturas

HLDM:

Hematin-Laminarin-Dithiodipropionic acid-MGK

LH:

Laminarin-Hematin

Pp IX:

Protoporphyrin IX

PDT:

Photodynamic therapy

ROS:

Especies reactivas de oxígeno


Nanomateriales

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  5. Nanopartículas de quitosano cargadas con genisteína y bioflavonoides dirigidas al receptor de folato para un efecto anticancerígeno mejorado en los cánceres de cuello uterino
  6. Nuevas nanopartículas de Au Nanostars @ PEG biocompatibles para la obtención de imágenes de TC in vivo y las propiedades de depuración renal
  7. La preparación de la nanoestructura yema-cáscara de Au @ TiO2 y sus aplicaciones para la degradación y detección del azul de metileno
  8. Propiedades de las nanopartículas de óxido de zinc y su actividad contra los microbios
  9. Síntesis fácil de nanopartículas de iridio sin ligando y su biocompatibilidad in vitro
  10. Síntesis en un solo recipiente de nanopartículas de núcleo-capa de CoFe2O4 @ Ag monodispersas y su caracterización
  11. Influencia del dopaje de Mg en nanopartículas de ZnO para una evaluación fotocatalítica mejorada y análisis antibacteriano