La liberación de CpG con nanopartículas magnéticas de Fe3O4 modificadas inhibe el crecimiento tumoral y las metástasis pulmonares espontáneas para mejorar la inmunoterapia

Materiales y métodos

Materiales y animales

El 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) se obtuvo de Aladdin Company, Inc. Hexahidrato de cloruro férrico (FeCl ₃ ∙ 6H ₂ O) y cloruro ferroso tetrahidratado (FeCl ₂ ∙ 4H ₂ O) se adquirieron del Instituto de Investigación de la Industria Química Fina de Tianjin Guangfu. El siguiente CpG fue sintetizado por Invitrogen Co .:5′-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 ′. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) se adquirió de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.).

Se obtuvieron una línea celular de riñón embrionario humano (293T), una línea celular de tumor de mama murino (4T1) y una línea celular de cáncer de colon (C26) de la American Type Culture Collection (ATCC), y se obtuvieron células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDC) de ratones BALB / c. Se compraron ratones BALB / c hembra de 6 a 8 semanas de edad en Beijing HuaFuKang Laboratory Animal Co. Ltd. Los ratones se criaron y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. Todos los protocolos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

Preparación de FeNP

El método de coprecipitación se utilizó para la síntesis de Fe ₃ O ₄ partículas [29]. En el procedimiento experimental, 11,68 g de FeCl ₃ ∙ 6H ₂ O y 4,30 g de FeCl ₂ ∙ 4H ₂ O se añadieron a un matraz de tres bocas que contenía 200 ml de agua desionizada a 80 ° C, seguido de la adición de 15 ml de NH ₃ al 25% · H ₂ O. Durante el proceso de reacción de 1 h, la mezcla se purgó con N ₂ y revuelto. Treinta miligramos del Fe ₃ preparado O ₄ se dispersó en una mezcla de 60 ml de agua desionizada y etanol absoluto mediante vibración ultrasónica durante 30 min. 0,3 g de Fe ₃ preparado O ₄ se dispersó en una mezcla de 4 ml de agua desionizada y 600 ml de etanol absoluto mediante vibración ultrasónica durante 30 min. Luego, se agregaron 1.2 mL de APTES a la mezcla bajo constante agitación mecánica durante 7 h. El Fe ₃ modificado con APTES funcionalizado resultante O ₄ Las nanopartículas de (FeNP) se separaron magnéticamente del sobrenadante mediante un imán, luego se lavaron con etanol y se secaron a 40 ° C al vacío durante 24 h. Finalmente, se preparó el precipitado de FeNP para su uso posterior.

Caracterización de partículas de FeNP / CpG

Los espectros de distribución del tamaño de partícula de Fe ₃ O ₄ , Las partículas de FeNP y FeNP / CpG se determinaron usando un analizador de tamaño de partículas láser Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) a 25 ° C. Cada prueba se realizó tres veces y se tomó el valor medio. Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión (H-6009IV; Hitachi Ltd., Tokio, Japón) y un microscopio electrónico de barrido (SEM) para observar la morfología de las partículas preparadas.

Se realizó un ensayo de retardo de agarosa para evaluar la capacidad de unión de CpG de las partículas de FeNP. Brevemente, el Fe ₃ modificado con APTES funcionalizado O ₄ Las partículas (FeNP) se mezclaron con 1 μg de CpG en diferentes proporciones (FeNP:CpG, w / w ) en agua destilada. Después de la co-incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, las mezclas se sometieron a electroforesis al 1% ( w / v ) gel de agarosa a 120 V durante 30 min. Luego, el gel se tiñó con Golden View ™ (0,5 mg / ml) y se fotografió con un iluminador UV (Bio-Rad ChemiDox XRS, EE. UU.).

Ensayo MTT

La citotoxicidad de las partículas de FeNP en las líneas celulares C26, 4T1 y 293T se evaluó con un ensayo MTT. Se sembraron en placa células C26, 4T1 y 293T a una densidad de 5 × 10 ³ células por pocillo en 100 μL de medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10% en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 ho 72 h. Las células preparadas se expusieron a una serie de partículas de FeNP a diferentes concentraciones:1,25, 0,625, 0,3, 0,15, 0,07, 0,03, 0,01 y 0 mg / ml por sextuplicado. Después de cultivar durante tiempos puntiagudos, se pipetearon 100 μl de medio completo y 10 μl de MTT en cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 4 h. Se añadió DMSO al soluto durante 30 min y se formó formazán. Luego, se midió la absorbancia a 570 nm con un luminómetro de placa de microtitulación Spectramax M5 (Molecular Devices, EE. UU.). La viabilidad celular de las células no tratadas se consideró al 100%.

Transfección in vitro

Las BMDC se prepararon a partir de ratones BALB / c. Brevemente, las células de la médula ósea del fémur y la tibia se lavaron con medio de cultivo 1640 libre que contenía FBS usando una jeringa. Las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 min, se trataron con tampón de lisis ACK (Lonza Inc.) para eliminar los glóbulos rojos y se resuspendieron en medio de cultivo RPMI-1640 complementado con FBS al 10%, penicilina (100 U / ml) y estreptomicina ( 100 U / mL) a 37 ° C en 5% de CO2 con 20 ng / mL de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). Luego, las células se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 10 ⁶ células por pocillo, y el medio de cultivo se cambió cada 2 días. Las células dendríticas se recolectaron el día 7.

El día 7, se añadió a los pocillos prediseñados un equivalente en partículas de 0,2 μg de CpG conjugado con FITC libre (CpG-FITC) o FeNP que administraba CpG-FITC con una relación de masa de 10:1. Una o 3 h después de la transfección, se eliminó el medio de crecimiento, se tiñeron las células con DAPI durante 10 min y se lavaron las células con solución salina fisiológica tres veces. Se tomaron fotografías de cada pocillo con un microscopio confocal de barrido láser (LSCM) y se midió la eficiencia de la transfección mediante citometría de flujo (citómetro de flujo NovoCyte, ACEA Biosciences, EE. UU.).

Ensayo de inhibición tumoral in vivo

Se inyectaron por vía subcutánea cien mil células C26 o 4T1 en el lomo de cada ratón BALB / c (de 6 a 8 semanas de edad). Los volúmenes de los tumores se midieron posteriormente con un calibre digital y se calcularon mediante la siguiente fórmula:volumen del tumor =0,5 × longitud (mm) × [ancho (mm)] ² . Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 50 mm ³ en tamaño, se aplicaron los tratamientos. Los ratones ( n =10) recibieron inyecciones intratumorales de CpG / FeNP (en una proporción de 10:1) en partículas equivalente a 20 μg de CpG o CpG solo cada 3 días durante cuatro tratamientos. Los ratones que recibieron un equivalente de solución salina normal (NS) o partículas de FeNP se consideraron grupos de control. El tamaño del tumor y el peso corporal del animal se controlaron cada 3 días. El día 31, todos los ratones fueron sacrificados mediante dislocación de la vértebra cervical. El tejido tumoral y otros órganos importantes se fijaron con formalina neutra al 4% seguido de sección en parafina para tinción con HE para evaluar la diferencia morfológica y para inmunofluorescencia para probar microambientes tumorales. En el modelo 4T1, medimos el peso del tumor y contamos el número de nódulos de metástasis pulmonar.

El experimento de nueva provocación del tumor se procesó en el modelo C26. Brevemente, los ratones curados con el tratamiento con FeNP / CpG se volvieron a desafiar con 5 × 10 ⁵ Células C26 o 4T1 s.c. en dos sitios separados en el lado opuesto del flanco sin más tratamiento. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen del tumor 4T1 creció a 200-300 mm ³ o 20 días.

Ensayo de linfocitos T citotóxicos

El ensayo CTL se realizó de acuerdo con métodos publicados. En detalle, se recolectaron linfocitos del bazo como células efectoras y se eliminaron los glóbulos rojos con cloruro de amonio y se pasaron a través de lana de nailon al final de los experimentos de tratamiento. 4T1 o C26 como células diana se marcaron con 300 mci de Na ₂ ⁵¹ CrO ₄ durante 2 hy luego se lavó con PBS y se distribuyó en placas de 96 pocillos. Las células efectoras preparadas se incubaron conjuntamente con las células diana en diferentes proporciones E:T. Los sobrenadantes que contienen radiactividad de las células diana se midieron con un contador de centelleo. La lisis específica se determinó como sigue:% de lisis específica =100 [(liberación en presencia de liberación espontánea de CTL) / (liberación espontánea de liberación máxima)]. En todos los experimentos, la liberación espontánea fue inferior al 30% de la liberación máxima.

Ensayo ELISpot

Se recolectaron esplenocitos de ratones de control o tratados con CpG al final del experimento, y se realizaron ensayos de ELISpot usando el kit ELISpot de IFN-γ / IL-4 Dual-Color de ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los esplenocitos recolectados se incubaron conjuntamente con sus respectivos tratamientos durante 96 h, se vertió la suspensión y se lavaron las células con tampón de lavado tres veces antes de agregar el anticuerpo mixto de IFN-γ e IL-4. Después de ser procesado por agentes cromogénicos, se contó la cantidad de células formadoras de manchas (SFC) bajo un microscopio.

Ensayo ELISA

Se realizó un ELISA para determinar los niveles de títulos de anticuerpos séricos específicos de Ct de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las microplacas recubiertas con proteína Ct entera purificada (BestBio Biotechnology Co. Shanghai, China) se enjuagaron con una solución de PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (PBST) y luego se bloquearon con 100 μl de tampón de bloqueo (leche desnatada al 5% en PBST). a 37 ° C durante 1 h. Después de enjuagar cinco veces con PBST, las placas se incubaron con sueros inmunes (diluidos a 1:1000 en tampón de bloqueo, 100 μl / pocillo) o lavados vaginales (diluidos a 1:10 en tampón de bloqueo, 100 μl / pocillo) a 37ºC. ° C durante 2 h. Después de enjuagar cinco veces con PBST, las placas se incubaron con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRP (diluido a 1:1000 en tampón de bloqueo, 100 μl / pocillo) o anticuerpo IgA anti-ratón de cabra conjugado con HRP (diluido a 1:2000 en tampón de bloqueo, 100 μl / pocillo) a 37 ° C durante 1 h.

Análisis histológico

El tejido tumoral y los órganos principales extraídos de los estudios de inhibición in vivo se fijaron e incluyeron en parafina. Después de desparafinar y rehidratar, las secciones de tejido incrustadas en cera se tiñeron con HE de Mayer. Para analizar los linfocitos infiltrantes (TIL) dentro de los tejidos tumorales de cada grupo, las secciones se sometieron a reparación de antígeno a alta presión, se tiñeron con anti-ratón FITC-CD4, PE-CD8 y PE-CD49b (como fabricante de NK) (BD, EE. UU.) Durante 1 ha 4 ° C, y luego se tiñó con DAPI durante 10 minutos antes del lavado con PBS para obtener imágenes. Se tomó una imagen de cada grupo a través de un microscopio de fluorescencia positiva (Olympus, Japón).

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como el valor medio ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó con un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando el software Prism 5.0c (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.) SPSS 17. Se realizó una comparación entre grupos utilizando la prueba de Tukey para el análisis de varianza de factor único (ANOVA). P los valores <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

Preparación y caracterización de partículas de FeNP / CpG

Para desarrollar una partícula magnética para la administración de CpG con baja citotoxicidad, Fe ₃ O ₄ las partículas se sintetizaron usando el método de coprecipitación como se muestra en la Fig. 1a. Injerto de los grupos aminopropilsilano (–O) 3Si – CH2 – CH2 – CH2 – NH2 de APTES en la superficie de Fe ₃ O ₄ para formar partículas de FeNP (Fig. 1b). CpG cargado negativamente (CpG) se une a grupos funcionales efectivos proporcionados por APTES para formar partículas FeNP / CpG a través de interacciones electrostáticas como se representa esquemáticamente en la Fig. 1c. Según la medición de la dispersión de luz dinámica, el tamaño del Fe ₃ preparado O ₄ las partículas eran de 10,7 ± 4,1 nm (Fig. 2a). Como se observa a través de TEM (Fig. 2b) y SEM (Fig. 2c), Fe ₃ O ₄ desarrollado en este trabajo mostró una forma uniforme y casi esférica. El diámetro dinámico del Fe ₃ modificado por APTES O ₄ partículas fue de 34,5 ± 5,0 nm (Fig. 2d), lo que concuerda bien con los resultados de TEM (Fig. 2e).

Preparación de partículas de FeNP / CpG. un Ecuación de síntesis de Fe ₃ O ₄ partículas magnéticas utilizando el método de coprecipitación. b Reacciones de hidrólisis y condensación con producción de polímero de silano y reacción de silanización de APTES en la superficie de magnetita para formar partículas de FeNP. c Diagrama esquemático de las partículas de FeNP / CpG. Los CpG se unen a la superficie de los FeNP a través de interacciones electrostáticas para formar partículas de FeNP / CpG

Caracterización de partículas de FeNP / CpG. un Espectro de distribución de tamaño de Fe ₃ O ₄ partículas. b Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de Fe ₃ O ₄ . c Imagen de microscopía electrónica de barrido de Fe ₃ O ₄ partículas. d Distribución de tamaño de Fe ₃ recubierto con APTES O ₄ (FeNP) partículas. e La imagen TEM de partículas de FeNP. f La capacidad de unión de CpG de los FeNP se determina mediante un ensayo de retardo en gel. Todos los datos representan tres experimentos independientes

Para ilustrar la capacidad de unión de las partículas de FeNP a CpG, se realizó un ensayo de retardo de gel (Fig. 2f). Cuando la relación molar de FeNP con CpG fue de 10:1, no se observó ninguna banda brillante de CpG, lo que muestra que las partículas de FeNP pueden adsorber completamente el CpG cargado negativamente a través de interacciones electrostáticas después de la electroforesis. Por lo tanto, elegimos esa proporción de prescripción para una mayor aplicación en nuestro estudio. Juntos, estos resultados demostraron que CpG puede combinarse con éxito en la superficie de FeNP a través de interacciones electrostáticas, mostrando estabilidad y una dimensión pequeña.

Viabilidad celular y transfección de partículas de FeNP / CpG in vitro

Para describir con más detalle la caracterización biofísica in vitro, detectamos la citotoxicidad de FeNP en células 293T, 4T1 y C26 en el punto de 24 ho 72 h (Fig. 3a). No hubo una relación obvia dependiente de la dosis entre la viabilidad celular y las partículas de FeNP en las células 293T, C26 y 4T1. La tasa de supervivencia celular fue de más del 80% a las 24 h y del 60% a las 72 h en tres tipos de células, incluso a una concentración de FeNP de 1,25 mg / ml. Estos resultados demostraron la biocompatibilidad de las partículas de FeNP, ya sea para células normales (293T) o células tumorales (C26, 4T1).

Citotoxicidad y actividad de absorción de partículas de FeNP / CpG in vitro. un Ensayo MTT. Detectamos la viabilidad de las células 293T, 4T1 y C26 después del tratamiento con diversas concentraciones de partículas de FeNP durante 24 o 72 h. No hubo diferencias significativas en la viabilidad celular con ninguna dosis de FeNP. b , c La detección de la captación de FeNP / CpG en BMDC. BMDC preparados después de GM - CSF tratamiento durante 7 días se transfectaron con CpG-FITC o CpG-FITC liberado con FeNP durante 1 o 3 h antes de lavarse, fijarse y etiquetarse intensamente con DAPI. Las imágenes se capturaron mediante microscopía confocal de barrido láser (LSCM). En comparación con el CpG libre marcado con FITC, el FeNP / CpG con mayor intensidad de fluorescencia ( b ) y la eficiencia de la transfección fueron estadísticamente significativas ( c ). Estos datos fueron representativos de tres experimentos independientes, la media ± error estándar; * P < 0,05, * P < 0.01 y *** P < 0,001 frente al grupo no tratado

Las células dendríticas como principales células receptoras de CpG desempeñan un papel importante en una respuesta inmune antitumoral mediada por TLR9. El CpG, como un potente adyuvante de polarización de tipo 1, induce a las CD a activar una respuesta inmunitaria dentro del tumor mediante la secreción de quimiocinas y citocinas. Por lo tanto, el suministro eficiente de CPG a las células DC es crucial para lograr una respuesta antitumoral. En nuestro estudio, se utilizó CpG conjugado con FITC para investigar la capacidad de suministro de partículas de FeNP a las CD in vitro. Después de 1 o 3 h después de la transfección, mediante microscopía confocal de barrido láser (LSCM), la intensidad de fluorescencia celular en los grupos tratados con partículas de FeNP recubiertas con CpG conjugado con FITC (FeNP / CpG-FITC) fue mayor que la de los grupos tratados con cantidad equivalente de grupos CpG libres (Fig. 3b). Las partículas de FeNP / CpG-FITC pudieron transfectar hasta el 18,3% de las CD después de 1 h. Luego, 3 h después de la transfección, la proporción de células positivas aumentó al 39,2% (Fig. 3c). Mientras tanto, con respecto a las células tratadas con CpG conjugadas con FITC libres, se pudo observar una fluorescencia mínima incluso 3 h después de la transfección, con menos del 10% de transfección. Por lo tanto, se sugiere que la liberación de CpG por partículas de FeNP aumentó la captación celular de CpG.

Los FeNP administran CpG al xenoinjerto e inhiben el crecimiento tumoral y las metástasis pulmonares espontáneas in vivo

La actividad anticancerígena de las partículas de CpG / FeNP se evaluó por primera vez en modelos de tumor de trasplante subcutáneo de cáncer de colon C26 y cáncer de mama 4T1 in vivo. Cuando el volumen del tumor era de aproximadamente 50 mm ³ , los ratones se dividieron al azar en cuatro grupos para comenzar el tratamiento ( n =10). Los ratones se trataron con una inyección intratumoral de partículas de CpG / FeNP tres veces durante todo el experimento (Fig. 4a). En nuestro estudio, la inyección intratumoral de partículas de FeNP / CpG resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral del xenoinjerto en comparación con el de los grupos de control, y la tasa de inhibición fue de hasta un 69% ( P <0.05 versus NS) (Fig. 4b). En comparación con el grupo de tratamiento con solución salina normal (NS) (0,90 ± 0,08 g) y el grupo de FeNP (0,81 ± 0,03 g), los grupos tratados con partículas de FeNP / CpG experimentaron una reducción estadísticamente significativa en el peso del tumor (0,38 ± 0,03 g, P <0,001). Comparativamente, el grupo de CpG libre mostró una capacidad anticancerosa mínima (0,68 ± 0,03 g) (Fig. 4c). Además, los ratones del grupo de control de PBS desarrollaron metástasis pulmonares extensas, en comparación, los tratados con las partículas de FeNP / CpG mostraron una disminución del 64,1% en el número de nódulos tumorales en el pulmón (Fig. 4d, e), lo que demuestra el poder de las partículas de FeNP / CpG en el tratamiento de tumores metastásicos. Como se muestra en la Fig. 4f, la tinción H&E del pulmón mostró una carga pulmonar reducida con metástasis claramente pulmonares después del tratamiento con FeNP / CpG que otros grupos. Estos resultados indican que la administración de FeNP CpG en células 4T1 no solo inhibió significativamente el crecimiento del tumor 4T1 ( P <0,001 versus NS), pero también suprimió la metástasis del cáncer de mama a los pulmones.

Capacidad antitumoral de partículas de FeNP / CpG in vivo. un Programa de tratamiento del antitumoral por partículas de FeNP / CpG tanto en modelos de xenoinjerto de cáncer de colon C26 como de cáncer de mama 4T1 mediante inyección intratumoral in vivo. b - d El tratamiento con partículas de FeNP / CpG inhibió el crecimiento de tumores 4T1. b Curvas de crecimiento tumoral representativas del modelo de tumor 4T1. c Peso medio del tumor. d Nódulo tumoral de pulmón promedio en cada grupo que muestra claramente metástasis pulmonar después de la inyección intratumoral de FeNP / CpG. e , f Imágenes de campo claro y tinción H&E de los pulmones: e El número de metástasis pulmonares visibles, las flechas indican metástasis pulmonares. f Tinción H&E de la metástasis pulmonar. Barras de escala, 100 μm para tinción H&E. g , h Las partículas de FeNP / CpG inhibieron significativamente el crecimiento de tumores de xenoinjerto C26: e curvas de crecimiento tumoral de cada grupo durante el experimento y f peso medio del tumor. Había 10 ratones en cada grupo. g Experimento de nueva provocación del tumor. yo En el modelo C26, los ratones que se curaron con el tratamiento con FeNP / CpG se volvieron a desafiar con 5 × 10 ⁵ Células C26 (flanco derecho) o 4T1 (flanco izquierdo) s.c. en dos sitios separados en el lado opuesto del flanco sin más tratamiento. Las imágenes que se muestran son ratones representativos a los 20 días después de la nueva provocación del tumor. Todos los datos fueron representativos de tres experimentos independientes, la media ± SEM; * P < 0,05, * P < 0.01 y *** P < 0,001

De manera similar, se observó un efecto antitumoral mejorado significativo con los grupos de tratamiento con FeNP / CpG en el modelo subcutáneo de ratones incubados con C26. Como se muestra en la Fig. 4g, el tumor creció rápidamente en los ratones de control, el grupo de vehículo y el grupo de CpG, con volúmenes tumorales medios de aproximadamente 2300 ± 239,4 mm ³ , 2116,7 ± 360,9 mm ³ y 1353,3 ± 158,9 mm ³ , respectivamente, para el día 31. Por el contrario, en el grupo FeNP / CpG, el crecimiento tumoral se inhibió extremadamente, con un volumen tumoral medio de aproximadamente 153,7 ± 62,7 mm ³ ( P <0,01 frente a NS) y una tasa de inhibición del 94,4%. Los tumores parecieron crecer lentamente después del tratamiento inicial, y una parte de los tumores comenzaron a desaparecer gradualmente después del final de los tres tratamientos. Aún más importante, en los grupos de tratamiento de partículas FeNP / CpG, los tumores en casi la mitad de los ratones habían desaparecido por completo al final del experimento. Como se muestra en la Fig. 4h, el grupo de tratamiento con FeNP / CpG tenía un peso tumoral promedio mucho más bajo que el de los otros grupos ( P <0,001):grupo de tratamiento FeNP / CpG (0,14 ± 0,08 g), grupo NS (2,41 ± 0,26 g), grupo FeNP (2,50 ± 0,4 g) y grupo CpG (1,44 ± 0,32 g). Para determinar si las partículas de FeNP / CpG eran suficientes para mediar la respuesta antitumoral específica, se procesó un experimento de nueva provocación tumoral en el modelo C26 (Fig. 4i). Los ratones cuyos tumores eran completamente regresivos después del tratamiento con partículas FeNP / CpG en el modelo de cáncer de colon C26 se inocularon con tumores 4T1 y C26 en diferentes posiciones en los ratones BALB / c por vía subcutánea y no se les dio ningún tratamiento adicional. Todos los tumores 4T1 crecieron rápidamente y sus volúmenes superaron los 1000 mm3 el día 20 después de la exposición. En contraste, hubo tumores sólidos que eran invisibles a simple vista en el modelo C26, lo que sugiere que los grupos de partículas FeNP / CpG estimularon una respuesta antitumoral específica. Estos resultados sugirieron que la inyección intratumoral de partículas FeNP / CpG inhibió eficientemente el crecimiento de una xenoinjerto subcutáneo.

Las partículas de FeNP / CpG estimulan la respuesta inmune antitumoral sistemática mejorada

Se estudiaron más a fondo los mecanismos antitumorales in vivo de las partículas de FeNP / CpG en los dos modelos anteriores. Para estudiar el tipo de respuesta inmune, aplicamos el ensayo ELISpot para analizar los niveles de IFN-γ / IL-4 del bazo del ratón. Si el nivel de IFN-γ en los linfocitos del bazo (que muestra eritema en el tablero ELISpot) es significativamente mayor que el nivel de IL-4 (que muestra manchas azules en el tablero ELISpot), el tipo de respuesta inmune estimulada fue Th1, es decir, para activar CD8 ⁺ Linfocitos T y principalmente la respuesta CTL del cuerpo. De lo contrario, el tipo de respuesta inmune fue Th2, es decir, para activar principalmente CD4 ⁺ Linfocitos T, estimulando así a los linfocitos B y produciendo anticuerpos específicos de antígeno. Se realizó un ensayo ELISpot de dos colores para medir la expresión de IFN-γ e IL-4 en diferentes tratamientos (Fig. 5a). En comparación con los otros tres grupos, el número de células formadoras de manchas (SFC) de IL-4 e IFN-γ secretadas por los linfocitos del bazo de los ratones tuvo una tendencia ascendente en el grupo de tratamiento con partículas FeNP / CpG, y el número de SFC la secreción de IFN-γ fue 1,5 veces mayor que la de IL-4 ( P <0,05), lo que implicó una respuesta inmunitaria celular antitumoral mejorada después de la inyección intratumoral de partículas de FeNP / CpG. Además, el suero de los ratones tratados con NS, FeNP, CpG y FeNP / CpG se analizó usando un ensayo ELISA para determinar la presencia de IgG total específica del tumor después de tres inmunizaciones. En el modelo de tumor C26, aunque los ratones inmunizados con FeNP / CpG desarrollaron títulos significativamente más altos de IgG específica del tumor que los de otros grupos (Fig.5b), no hubo diferencia estadística entre los ratones inmunizados con FeNP / CpG y los ratones inmunizados con CpG. .

The mechanism of antitumor immune response. un ELISpot assay. Splenocytes were harvested from NS or treated mice after the final treatment, and ELISpot assays were performed using the mice IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot kit in the C26 xenograft model. b In the C26 model, serum antibody titers in tumor-bearing mice treated by FeNP/CpG particles were tested using an ELISA assay. Each symbol represents an individual mouse, and horizontal lines indicate the median as determined by Mann–Whitney U pruebas. c CTL assays. The cytotoxicity of splenocytes against C26 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay. d Representative immunofluorescence images showing infiltrating immune cells in tumor tissues in each group. The FeNP/CpG particles treatment groups with enhanced CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T and NK (CD57 ⁺ ) cell infiltration in tumors compared to that of other groups. e The cytotoxicity of splenocytes against 4T1 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay

To assess the cell-mediated immune response stimulated by the FeNP/CpG, CTL activity was assessed using the 51Cr release assay on C26 and 4T1 cells ex vivo (Fig. 5c, e). When the killing activity of CTL was at a 100:1 ratio of effector cells to target cells, in the C26 cells, the effectors in the FeNP/CpG groups showed 8.2-fold more tumor-killing activity than that in the NS group and 9.7-fold and 1.7-fold more than that in the FeNP and CpG groups (P  < 0.05 versus NS) (Fig. 5c). Similarly, this observation was coincident with the result in the 4T1 cells; the FeNP/CpG group had 7.4-fold more tumor-killing activity than that of the NS group and 6.6-fold and 1.4-fold more than that of the FeNP and CpG groups (P  < 0.01 versus NS). These results illustrated that compared to that of free CpG, the use of APTES-coated Fe₃ O ₄ to deliver CpG can stimulate a more intense humoral immune response and result in a better antitumor efficiency in vivo.

The FeNP/CpG Increases Infiltrating Lymphocytes in Tumors and Alters Tumor Microenvironments

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), a primary immune component infiltrating solid tumors, are considered the manifestation of the host antitumor reaction. Immunofluorescence analyses were performed to study TILs in tumors. The intensity of infiltration by CD4 ⁺ T cells, CD8 ⁺ T cells and CD49B ⁺ NK cells was studied (Fig. 5d). There was a significant increase in the intensity of infiltration of NK cells, CD4 ⁺ T cells, and CD8 ⁺ T cells in tumors from the FeNP/CpG groups compared with that in the FeNP, CpG, and NS groups (P  < 0.005), which suggests that FeNP/CpG not only stimulates a higher immune response but also alters the tumor microenvironment by activating more immune cells into the tumor tissues. During the entire experiment, the mouse body weight and state were observed, and there was no piloerection, poor appetite, weight loss, or abnormal behavior in the C26 xenograft model (Fig. 6a). As shown in Fig. 6b, no significant pathological changes in heart, liver, spleen, lung, or kidney were observed through HE analysis. No histopathological changes and changes of body weight were observed in the 4T1 subcutaneous xenograft model (data not shown). Overall, our data suggested that the developed FeNP particles for CpG delivery were capable of treating cancer and inhibiting tumor metastasis with high safety.

Safety and toxicity evaluation of FeNP/CpG formulation. ( a ) Body weight changes in NS, FeNP, CpG, and FeNP/CpG groups. b The section of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in each group was collected and stained with H&E staining. No significantly pathological changes were observed in any group (magnification, × 200)

Discusión

Synthetic CpG, identified as an effective drug in immunotherapy by simulating the immune activation of natural bacterial DNA [28,29,30], have been characterized in a variety of tumor models. CpG intratumoral injection is one of treatments in clinical trials on CpG. Molenkamp and his colleagues showed that the intratumoral injection of CpG alone or combined with radiotherapy could obviously increase the tumor-specific CD8 ⁺ T cell immune response in lymphoma or melanoma patients, causing systemic tumor regression [31]. So far, CpG combined with other treatments showed both a great antitumor effect and good security, which suggests that CpG are quite effective in tumor immunotherapy. However, the greater challenge of CpG truly coming into clinical application is if they can efficiently be delivered into the cells to combine with receptors such as TLR9 to stimulate an immune response. Nanotechnology can address such concerns by enhancing the delivery of CpG to antigen-presenting cells, and a number of nanocarriers have been explored for this purpose [32,33,34]. The nanoparticle formulations explored include gelatin particles, liposomes [35, 36], and DNA origami structures, but these were only explored in the context of combination treatments.

In this study, we first developed a non-viral delivery system, FeNPs, which were easily formed via APTES-modified Fe₃ O ₄ , to deliver CpG into BMDCs. The CpG surrounded the surface of the modified magnetic Fe₃ O ₄ particles via electrostatic interactions to form FeNP/CpG particles with a small size distribution. The FeNP/CpG particles not only showed enhanced transfection efficiency compared to that of free CpG but also had a great antitumor effect in subcutaneous tumor models of C26 colon cancer, with 94.5% tumor inhibition, and 4T1 breast cancer, with a 64.3% inhibitory rate, though intratumoral injection in vivo. Moreover, FeNP/CpG treatments significantly stimulate an effective antitumor immune response and alter the tumor microenvironment by recruiting a number of immune cells to tumor tissues.

We further discuss possible reasons to account for the enhanced transfection and therapeutic efficiency of FeNP/CpG particles over that of free CpG. First, the developed FeNPs take advantage of characteristics such as their good histocompatibility, superparamagnetism, and a strong positive charge (for the Fe₃ O ₄ particles) to assist in delivering the CpG into the intracellular space, resulting in drug-carrier particles focusing on the tumor site to increase the drug concentrations in the area, reduce the drug loss, and improve drug utilization. Simultaneously, APTES was used to modify Fe₃ O ₄ , providing more CpG binding sites to firmly bind the CpG onto the carrier. FeNPs exerted higher cell viability on 293T, C26, and 4T1 cells in vitro, and there was no remarkable pathological change after FeNP/CpG treatment by intratumoral injection that could avoid the side effects due to CpG entering into circulation by systemic administration. Second, the FeNP load CpG into DCs with a higher transfection efficiency than that of free CpG, increasing opportunities for integration with intracellular TLR9, which is widely expressed in macrophages, NK cells, DCs, and so on. The combination of CpG and TLR9 induces the secretion of local cytokines and chemokines, recruiting and activating immune cells of the innate immune response to stimulate the antitumor immune response; additionally, NK cells and CTLs could kill tumor cells directly or use IFN-γ or granzyme B to kill tumor cells [37, 38]. We suspected that FeNP/CpG may be taken up by the recruited immune cells to trigger the secondary cascade amplification of the immune response. Third, some studies have indicated that CpG can react with tumor cells expressing TLR9, aiming to induce tumor cell autophagy [39]. Autophagy may enhance the sensitivity of tumor cells to the immune response, and the ATP dependent on autophagy could be released extracellularly and used to recruit DCs into the tumor tissue, activating the tumor-specific T cell immune response. This therapy is a form of immunization that uses the in situ tumor as a source of antigen and introduces CpG as an adjuvant to activate an immune response within the tumor. In our study, although the FeNP/CpG was injected without any specific tumor antigen, a cell-specific and systematic immune response could be elicited, and the contralateral tumors appear regressive, as shown in the tumor re-challenge experiment and the two-tumor site model. In addition, being coated with the lysate of tumor cells in a 96-well plate, the ELISA assay showed after FeNP/CpG intratumoral injection in mice that the antitumor antibody titer in the serum appeared to significantly increase. The ELISpot assay suggested that FeNP/CpG treatment, to a great degree, increased the spleen lymphocyte secretion of IFN-γ and IL-4, especially that of IFN-γ , which indicated that the humoral immunity responses and cellular immunity responses were both enhanced by treatment with FeNP/CpG in mice. In addition, immunohistochemistry analyses were performed to study TILs in the tumor microenvironment. Compared to that in the other groups, in the FeNP/CpG group, the number of CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T, and NK cells in the tumors showed a significant increase. Taken together, our study suggested that FeNP/CpG particle intratumoral injection may be a potential tumor immunotherapy strategy.

In recent years, treatment strategies based on nucleic acids have become one of the important areas of tumor treatment. The negative charge of the lipid bilayer of cell membranes makes it difficult for nucleic acid drugs with the same charge to pass through the cell membrane into the cell. Thus, APTES-modified Fe₃ O ₄ as a safe and efficient delivery system is expected to be used for other nucleic acid drugs to contribute to the carrier solution.

Conclusión

In summary, magnetic APTES-modified Fe₃ O ₄ particles (FeNP) were used to deliver CpG adjuvants via intratumoral injection to treat C26 colon carcinoma and 4T1 breast cancer, with enhanced antitumor ability over that of free CpG. The prepared FeNPs showed high stability, low toxicity, and high transfection ability for CpG in vitro and in vivo. Our results demonstrated the potential capacity of FeNP particles in non-viral nucleic acid drug delivery and offered an alternative strategy for CpG immunotherapy.

Abreviaturas

APTES:

3-Aminopropyltriethoxysilane

BMDC:

Bone marrow-derived dendritic cell

CpG:

Cytosine-phosphate-guanine

CpG-FITC:

FITC-conjugated CpG

FeNP:

3-Aminopropyltriethoxysilane-modified Fe₃ O ₄ nanoparticle

FeNP/CpG:

FeNP-delivered CpG particles

FeNP/CpG-FITC:

FeNP-delivered CpG-FITC particles

GM -CSF :

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

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