Nanopartículas Bimetálicas Cu:Ag: Eficacia Antibacteriana Mejorada Contra Cepas Resistentes a Antibióticos – Estudio de Acoplamiento Molecular

El estudio de acoplamiento molecular de NPs bimetálicas Cu:Ag se realizó usando el software ICM Molsoft v3.8–4a o superior (Molsoft L.L.C., La Jolla, CA) para identificar interacciones de unión con residuos clave del sitio activo. La herramienta de preparación de proteína/receptor de ICM se usó para optimización y preparación de estructura de los blancos enzimáticos seleccionados. Los pasos involucraron adición de átomos de H polares, eliminación de moléculas de agua y minimización de energía usando parámetros por defecto. La molécula de ligando co-cristalizado se eliminó para dar espacio al acoplamiento de NPs. El bolsillo de unión se definió usando una caja de malla especificando la posición del ligando cristalizado. La conformación con menor energía de unión de las 10 mejores conformaciones acopladas se seleccionó en cada caso para analizar el patrón de interacción y la tendencia de unión de NPs bimetálicas Ag–Cu dentro del bolsillo activo. Los softwares Pymol y Discovery Studio Visualizer se emplearon para análisis y representación 3D de interacciones de unión. La estructura de NPs bimetálicas Cu:Ag se recuperó de PubChem en formato .sdf.

Caracterización

El análisis estructural y la pureza de fase se observaron mediante XRD (PAN analytical X'pert pro XRD) con radiación Cu-Kα (λ = 0,154 nm, 20° a 80°). La presencia de modos vibracionales correspondientes a diversos grupos funcionales se evaluó usando espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) con espectrómetro Perkin Elmer. Los espectros de absorción se adquirieron usando un espectrofotómetro UV-visible Genesys 10S. FESEM acoplado con espectrómetro EDS (JSM-6610LV) y HR-TEM (JEOL JEM 2100F) se emplearon para visualizar morfologías superficiales. El software ICM v3.8-4a o superior (Molsoft L.L.C., La Jolla, CA) se usó para análisis de acoplamiento molecular.

Resultados y Discusión

El análisis XRD se realizó para evaluar la constitución de fases y estructura cristalina de los productos formulados. La Figura 3a revela el patrón XRD trazado entre 20° y 80°. En Cu:Ag bimetálico, los reflejos observados alrededor de ~38,2°, 46°, 64,4° y 77,1° se atribuyen a los facetas (111), (200), (220) y (311) de la fase fcc de Ag según JCPDS No. 04-0783. En el caso de Cu, las difracciones que aparecen en 32,6°, 44,2° y 51° denotan los planos de red (110), (111) y (200) que confirmaron la presencia de CuO estructurado fcc y Cu metálico, respectivamente, y coinciden bien con JCPDS No. 04-0836. En el patrón extraído, se observaron picos tanto de Ag como de Cu, lo que significa la presencia de NPs que constituyen ambas fases. Además, la existencia de CuO en muestras con menor contenido de Ag (ej. 1:0,025, 1:0,050 y 1:0,075) revela que las NPs de Cu se oxidaron y exhibieron comportamiento no protector a alta temperatura debido a menores concentraciones de Ag. Por el contrario, en la muestra con mayor contenido de Ag (1:0,1), el pico de CuO exhibe baja intensidad lo que indica la formación de producto parcialmente libre de óxido. Esto sugiere que la resistencia a la oxidación mejorada de NPs bimetálicas ocurrirá debido a la adición de Ag. No se detectó pico adicional de impureza dentro de los límites de detección del instrumento, mientras que cada plano cristalográfico comprende sitios energéticamente distintos basados en densidad atómica. Tanto NPs de Cu como de Ag tienen facetas de alta densidad atómica en (111) que sirvieron para exponer la máxima orientación de planos. Usando la ley de Bragg, el espaciado d de Ag y Cu se encontró en 0,24 y 0,21 nm, respectivamente, lo que corresponde al plano distinto (111) de ambos elementos y estaba en línea con hallazgos de HR-TEM (Fig. 6). Los anillos SAED correspondientes (Fig. 3b–d) obtenidos de productos bimetálicos preparados muestran patrones de anillos distintos que demuestran productos bien cristalizados y concuerdan bien con patrones XRD.

Los espectros FTIR se registraron entre 500 y 4000 cm⁻¹ como se presenta en Fig. 3e; la banda transmitida posicionada entre 600 y 900 cm⁻¹ es causada por la formación de enlace Cu:Ag. La banda observada alrededor de ~1200 y 1400 cm⁻¹ se atribuye a C–O y C–H, respectivamente; picos que aparecen en ~1800 y 2100 cm⁻¹ corresponden a enlaces C=O y N–H debido a PVP y NH₄OH. Las transmitancias observadas alrededor de ~2800 cm⁻¹ y 3400 cm⁻¹ se atribuyen a la presencia de C≡N y grupo hidroxilo (O–H).

La Figura 4a muestra los espectros de absorción de NPs bimetálicas Ag–Cu con bandas de absorción claras situadas en 340, 410 y 500 nm, atribuidas a absorción de resonancia plasmónica de superficie de Ag y Cu metálicos. La banda que aparece en 410 nm surge típicamente debido a la presencia de NPs de Ag, y el pico posterior posicionado en 510 nm se atribuye a la existencia de NPs de Cu. Puede sugerirse que NPs bimetálicas se desarrollan con fases distintas de Ag y Cu, en lugar de desarrollo bimetálico, lo que también fue afirmado por resultados XRD como se discutió anteriormente. Se observó un ligero corrimiento al rojo en la banda de absorción a 410 nm y un aumento en la absorción máxima con el aumento del contenido de Ag. Usando la ecuación de Tauc, la banda prohibida de productos bimetálicos preparados se calculó y se encontró en 3,2, 2,9, 2,7 y 2,6 eV, como se demuestra en Fig. 4b–e.

De las imágenes SEM (Fig. 5a–d) de nanocompuestos bimetálicos Cu:Ag sintetizados, se observó que partículas de tamaño pequeño se depositaron en la superficie de partículas grandes. Un aumento en el contenido de Ag del 2,5 al 7,5% condujo a la formación de diversas partículas con morfología variable que finalmente culminó en NPs Cu:Ag gruesas. Además, la acumulación de partículas de Ag desiguales y diminutas aumentó con la concentración de dopante, sugiriendo la aparición de más bloques dispersos en su superficie. Esto significa la gran influencia que el dopaje de Ag en Cu tiene sobre la morfología, lo que se confirmó además con micrografías HR-TEM (ver Fig. 5e–h).

Para elaborar más sobre la morfología y espaciado d de bimetálicos preparados, se empleó HR-TEM con resolución de 10 nm. En Fig. 6a, el espaciado d (0,21 nm) de NPs de Cu corresponde a la faceta (111) de Cu, como también es evidente en resultados XRD (Fig. 3a). La Figura 6b muestra un ligero aumento en el espaciado de capas (0,21 a 0,22 nm) y muestra NPs de Ag con distancia interplanar de 0,24 nm que coincide con el plano (111). De manera similar, Fig. 6c, d muestran espaciados de capas calculados y fases separadas de bimetálico, mientras que Fig. 6e demuestra la forma de partícula de NPs de Ag y Cu. Las partículas en imágenes HR-TEM se ven poseer una estructura núcleo-cáscara. En Fig. 6d dentro de una sola partícula, se registraron franjas de red emanadas de Cu y Ag. Esto sugiere fuertemente la formación de NPs bimetálicas núcleo-cáscara con diferentes proporciones Cu:Ag produciendo NPs cuasi-esféricas irregulares. Además, la imagen TEM mostró partículas que parecen regiones oscuras y brillantes. Esta variación en el contraste dentro de una sola partícula puede indicar la presencia de dos materiales constituyentes distintos sugiriendo la creación de partículas bimetálicas Cu:Ag.

La presencia de pico distinto en espectro EDS y composición elemental proveniente del bimetálico afirmaron la formación exitosa de NPs Cu:Ag. La Figura 7a representa el espectro EDS obtenido de muestra 1:0,050 que muestra picos claros de Cu y Ag. La Figura 7b se tomó de muestra 1:0,10 donde se detectaron picos para C y O en muestras dopadas. Estos aparecen ya que pestañas de carbono se utilizan para sostener muestras durante examen SEM y/o debido a conteos de fondo en sensor SEM–EDS.

La eficacia bactericida in vitro de NPs bimetálicas Cu:Ag usando ensayo de difusión en pozo de agar se presenta en Tabla 1. Los resultados demuestran relación directamente proporcional entre concentración de NPs sintetizadas y zonas de inhibición (mm). Zonas de inhibición estadísticamente significativas (P < 0,05) registradas para (2,5, 5, 7,5 y 10 % en peso) dopante Ag contra S. aureus, E. coli y A. baumannii oscilaron entre 0,85–2,8 mm, 0,55–1,95 mm y 0,65–1,85 mm, respectivamente. Todos los resultados se compararon con agua desionizada (0 mm) y amoxicilina (4 mm) como control negativo y positivo, respectivamente. Similarmente, el % de eficacia de NPs dopadas aumentó (21,2–70%), (13,7–48,7%) y (16,2–46,2%) contra S. aureus, E. coli y A. baumannii, respectivamente. En general, NPs bimetálicas Cu:Ag resultaron más potentes contra S. aureus (gram-positivo) comparado con E. coli y A. baumannii (gram-negativos).

El tamaño, concentración y forma de NPs afectan directamente el estrés oxidativo producido por nanoestructuras. La eficacia bactericida en forma de zonas de inhibición (mm) mejoró debido a mayor dopaje % en peso de NPs bimetálicas Ag-dopado Cu debido a mayor disponibilidad de cationes (++). La acción bactericida respecto a tamaño y concentración muestra una relación inversa al tamaño. Las nanoestructuras de tamaño nanométrico producen especies reactivas de oxígeno (ROS) eficientemente que residen en membranas celulares bacterianas llevando a extrusión de orgánulos celulares y finalmente muerte de bacterias. Además de la producción de ROS, la interacción catiónica de Ag⁺ y Cu⁺⁺ con partes cargadas negativamente de la membrana celular bacteriana resulta en eficacia bactericida mejorada a concentraciones crecientes mediante lisis celular y colapso bacteriano.

Las aplicaciones biológicas de diversas clases de nanopartículas han sido ampliamente estudiadas desde las últimas décadas. Debido a características únicas de NPs, han sido ampliamente utilizadas por su potencial como agente bactericida con capacidad para sustituir antibióticos tradicionales. NPs interactúan con células bacterianas, interrumpen la permeación de membrana celular y destruyen vías metabólicas clave. El mecanismo específico de toxicidad de nanopartículas hacia bacterias necesita explorarse. Se cree que NPs interactúan con célula bacteriana involucrando fuerzas electrostáticas, fuerzas de van der Waals o interacciones hidrofóbicas que finalmente resultan en muerte de bacterias. Las enzimas han sido reportadas como principal factor de virulencia involucrado en infección bacteriana y dirigirlas para inhibir su actividad ayuda a combatir la infección causada. Aquí, el estudio de acoplamiento molecular de NPs Cu:Ag contra blancos enzimáticos de la pared celular junto con la vía biosintética de ácidos grasos identificó el patrón de interacción de unión de estas NPs dentro del bolsillo activo. Teniendo en cuenta el potencial antibacteriano in vitro de estas NPs contra A. baumannii, S. aureus y E. coli, los blancos enzimáticos se seleccionaron de estos microorganismos para obtener una visión del posible mecanismo detrás de su actividad bactericida.

La mejor conformación acoplada observada en caso de NPs bimetálicas Cu:Ag con β-lactamasa de A. baumannii reveló interacción de enlace de hidrógeno con Glu272 (2,8 Å) y Ser286 (3,2 Å) junto con interacción de contacto metálico con Val292 mientras que la puntuación de acoplamiento fue −4,013 kcal/mol (Fig. 8a). Similarmente, la puntuación de unión de NPs bimetálicas Ag–Cu observada contra β-lactamasa de S. aureus fue −4,981 kcal/mol poseyendo enlace de hidrógeno con Ser403 (3,2 Å), Tyr519 (3,6 Å), Gln521 (3,0 Å) y Asn464 (3,1 Å) como se muestra en Fig. 8b.

El segundo blanco enzimático seleccionado en el estudio actual FabI pertenece a la vía biosintética de ácidos grasos y las predicciones de acoplamiento molecular sugirieron NPs bimetálicas Cu:Ag como inhibidor potencial contra este blanco. Las NPs bimetálicas Cu:Ag mostraron buena puntuación de unión (-3,385 kcal/mol) contra FabI de A. baumannii teniendo enlace de hidrógeno con Ser201 (2,7 Å), Ala199 (3,5 Å) y Leu198 (3,3 Å) como se muestra en Fig. 8c. Similarmente, la mejor conformación acoplada de NPs Ag–Cu con sitio activo de FabI de S. aureus mostró enlace de hidrógeno con Gly202 (2,5 Å) y Gln155 (2,5 Å) teniendo puntuación de unión −3,012 kcal/mol (Fig. 8d).

Además, la capacidad de unión de NPs bimetálicas Cu:Ag contra FabH de E. coli también se evaluó y la puntuación de unión observada fue −4,372 kcal/mol teniendo interacción de enlace de hidrógeno con Thr254 (3,5 Å), HIE244 (2,6 Å) y Glu302 (3,0 Å) mostrado en Fig. 8e.

Conclusiones

Las nanopartículas bimetálicas Cu:Ag se prepararon mediante método de coprecipitación para uso en aplicaciones para combatir afecciones relacionadas con bacterias. Los perfiles XRD confirmaron la presencia de CuO estructurado fcc y Cu metálico y partículas de Ag. Se observaron picos tanto de Ag como de Cu lo que significa NPs bimetálicas que implican fases de Ag y Cu. Los planos observados en análisis XRD corresponden bien a anillos SAED. Grupos químicos unidos a productos formulados y banda de transmitancia característica entre 600 y 900 cm⁻¹ fue causada por la formación de enlace Cu:Ag. Los espectros trazados de UV-vis mostraron absorción a 410 nm que surge típicamente debido a la presencia de NPs de Ag, y el pico posterior posicionado a 510 nm se atribuyó a la existencia de NPs de Cu. Las partículas en imágenes HR-TEM se vieron tener una estructura núcleo-cáscara. NPs Cu:Ag mostraron claramente la formación de NPs bimetálicas con diferentes proporciones Cu:Ag produciendo NPs cuasi-esféricas irregulares. Además, el espaciado d de NPs de Cu (0,21 nm) corresponde a la faceta (111) de Cu detectada en resultados XRD. Un ligero aumento en el espaciado de capas (de 0,21 a 0,22 nm) también muestra que NPs de Ag con distancia de capa de 0,24 nm coincidieron con el plano (111). El estudio de acoplamiento molecular mostró buen acuerdo con la actividad bactericida in vitro. La tendencia de unión de NPs bimetálicas Cu:Ag contra la enzima β-lactamasa de la vía biosintética de la pared celular junto con enzimas FabI y FabH de la vía biosintética de ácidos grasos demostró su potencial de inhibición que necesita explorarse más a través de estudios de inhibición enzimática.