Rendimiento fotocatalítico y antibacteriano mejorado de nanoestructuras de óxido de estaño recocidas: un estudio de acoplamiento molecular

Actividad Antimicrobiana

La acción antibacteriana in vitro de SnO fabricado a varios tratamientos de temperatura se valoró contra bacterias patógenas más prevalentes E. coli y S. aureus aisladas de mastitis caprina usando ensayo de difusión en pocillo. Placas Petri conteniendo crecimiento bacteriano activado (estándar 0,5 Mc-Farland) en agar MacConkey solidificado y agar salino manitol se incubaron a 37 °C tras preparar pocillo de 6 mm diámetro usando perforador de corcho estéril. Diferentes concentraciones de nanoestructuras sintetizadas (500 y 1000 μg/50 μl) se aplicaron como dosis baja y alta comparadas con ciprofloxacino (5 μg/50 μl) y ADI (50 μl) como control positivo y negativo, respectivamente. Las placas Petri incubadas overnight a 37 °C declararon zonas de inhibición (mm) que se midieron usando calibre vernier. La actividad antibacteriana medida en términos de zonas de inhibición (mm) se declaró estadísticamente significativa usando análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con SPSS 20.0.

Estudios de Acoplamiento Molecular

La síntesis de pared celular se ha considerado un blanco efectivo para descubrimiento de varios antibióticos con diferentes modos de acción, como antibióticos beta-lactámicos y glicopéptidos. Los antibióticos beta-lactámicos se han reportado como fármacos más comercializados y representan tratamiento más común para infecciones bacterianas [39, 40]. Inhiben biosíntesis de pared celular uniéndose a proteína de unión a penicilina (PBP) y β-lactamasas [41]. Similarmente, enzimas (girasa de ADN) pertenecientes a síntesis de ácido nucleico también se han considerado como blanco efectivo para descubrimiento de antibióticos [42]. Aquí, realizamos estudios de acoplamiento molecular de NPs de SnO₂ contra β-lactamasa y enzima girasa de ADN de E. coli y S. aureus para tener una idea de su posible modo de acción.

Las estructuras 3D-cristalinas de blancos proteicos seleccionados pertenecientes a E. coli y S. aureus se obtuvieron del banco de datos de proteínas con código de acceso: 4KZ9; Res: 1,72 Å [43], 1MWU; Res: 2,6 Å [44] para β-lactamasa, mientras 6KZX; Res: 2,1 Å [45] y 5CTU; Res: 1,45 Å [46] para girasa de ADN como se muestra en Fig. 4.

Los estudios de acoplamiento molecular se realizaron usando software ICM Molsoft (Molsoft L.L.C., La Jolla, CA) [47]. La herramienta de preparación de receptor de ICM se utilizó para estructura proteica involucrando adición de átomos de hidrógeno polares, remoción de moléculas de agua y ligando co-cristalizado. Las estructuras proteicas se optimizaron usando herramienta de minimización de energía con parámetros por defecto mientras que caja de rejilla se usó para identificar bolsillo activo alrededor de ligando cristalizado. Luego, 10 mejores conformaciones especificando orientación de NPs de SnO₂ dentro del bolsillo activo de enzima se generaron en cada caso. La conformación con menor puntuación de enlace se seleccionó para análisis ulterior que reveló patrón de enlace y tendencia de inhibición de NPs fabricados contra estas enzimas seleccionadas.

La estructura de SnO₂ se generó usando herramienta ligedit de ICM mientras que vista 3D de conformación acoplada se generó a través de ICM y visualizador Discovery Studio [48].

Caracterización de Materiales

Difracción de rayos X (XRD) BRUKER D2 Phaser rango 2θ = 10°–70° con Cu Kα (λ = 1,540 Å) se usó para examinar estructura de red y recuperar datos sobre constitución de fase. Grupos funcionales de productos sintetizados se evaluaron mediante espectrómetro Fourier-transform infrared (FTIR) PerkinElmer. Microscopio electrónico de barrido de emisión de campo JEOL JSM-6610LV (FESEM) junto con detector Oxford XMax EDS con software INCA se empleó para analizar morfología y composición elemental de muestras preparadas. Philips CM30 junto con JEOL JEM 2100F microscopio electrónico de transmisión de alta resolución (HR-TEM) se empleó para registrar SAED, imágenes HRTEM y patrones de franjas de red. Las propiedades ópticas de muestras de óxido de estaño preparadas se registraron de 300 a 800 nm vía espectrómetro UV-vis GENESYS-10S.

Resultado y discusión

La Figura 5(a) presenta espectros XRD obtenidos de muestras de óxido de estaño sintetizadas y recocidas a varias temperaturas. Para análisis composicional de fase, se empleó radiación CuKα mientras que la relación Debye-Scherer, D = Kλ/β Cosθ donde λ = 1,54 Å y k = 0,9 se usó para calcular tamaño cristalino del material. A 250 °C, patrón XRD muestra picos con valores 2θ de 29,12° (112), 31,60° (020), 33,57° (113), 40,15° (023), 45,54° (024), 51,35° (222) y 64,57° (225) que son todos atribuidos a fase ortorrómbica SnO (JCPDS: 01–077-2296). Solo un pico registrado a 26,66° (112) pertenece a estructura ortorrómbica SnO₂ (JCPDS: 01–078-1063). Conforme las muestras se recocieron a 500 y 750 °C, los picos de difracción relacionados con SnO desaparecieron y el producto resultante se identificó como SnO₂ ortorrómbico con planos cristalográficos 24,81° (110), 29,12° (113), 31,23° (020), 41,59° (211), 46,90° (117), 59,57° (135) que coincidieron bien con archivo JCPDS No. 01-078-1063 [49]. Los resultados observados de XRD indican que el material preparado fue primero oxidado a SnO a 250 °C. Luego, a 500 °C y superior, se transformó completamente a SnO₂ [50]. Los resultados también muestran que la cristalinidad de muestras mejoró con aumento de temperatura. Además, patrones SAED obtenidos de muestras recocidas a 250 y 750 °C mostraron anillos de puntos brillantes como se ilustra en Fig. 5b, c, respectivamente. Los patrones analizados con planos de red (020), (023), (024) y (112) se asignan a SnO ortorrómbico (Fig. 5b) y (020), (110), (117) y (135) planos de difracción se atribuyen a nanomaterial SnO₂ (Fig. 5c) para muestras recocidas a 250 y 750 °C, respectivamente. La naturaleza cristalina de productos también se confirmó vía imágenes SAED lo cual es consistente con observaciones de XRD.

Espectros FTIR de nanomateriales de óxido de estaño fabricados calentados a 250, 500 y 750 °C se presentan en Fig. 5d. El pico de absorción centrado en ~3580 cm⁻¹ acoplado con banda casi 1602 cm⁻¹ fue atribuido a estiramiento/doblamiento de grupo O–H y enlace Sn-OH debido a que óxido de estaño absorbe cierta cantidad de agua de atmósfera ambiente [51]. Pico de absorción bajo rango 2300–2400 cm⁻¹ se asigna a dióxido de carbono creado en productos tras exposición a atmósfera [52]. Enlaces apareciendo a 1174 cm⁻¹ corresponden a vibraciones de varios tipos de grupos hidroxilo superficiales mientras pico a 1401 cm⁻¹ se debe a vibraciones de doblamiento C–H [53, 54]. Los picos característicos en rango 500–700 cm⁻¹ se atribuyen a vibraciones Sn–O de capa superficial. Un aumento en temperatura recocida causa corrimiento al azul en picos mientras los picos característicos aparecen fuertes y más intensos. Esto puede deberse al proceso de recocido donde átomos de nanomaterial adquieren suficiente energía para cambiar posición de átomos de nanopartícula resultando en recristalización [56].

Análisis FESEM y HRTEM se realizó para recopilar información detallada de morfología y nanoestructura de productos fabricados. Imágenes HRTEM de óxido de estaño recocido a 250, 500 y 750 °C se registraron, como se muestra en Fig. 6a–c. Las imágenes proporcionan evidencia para formación de aglomeración dentro de nanopartículas con forma casi esférica y distribución aleatoria de tamaño de partícula (ver Fig. 6a, c). En Fig. 6b, partículas de gran tamaño, ligeramente transparentes y monodispersas con poca aglomeración pudieron observarse. El mismo comportamiento de distribución de partículas puede observarse en imágenes insertadas a alto aumento. El cambio brusco en comportamiento morfológico a 500 °C es notable. Esta temperatura puede ser una característica durante el proceso de oxidación [22]. Además, Fig. 6d–f muestra micrografías HRTEM obtenidas de muestra recocida a 250, 500 y 750 °C, respectivamente, para detectar distancia interplanar. En cristalitos, espaciado de franjas de red es ~0,225 nm como se muestra en imagen de perfil IFFT insertada en Fig. 6d que corresponde a plano de difracción (023) de fase ortorrómbica de SnO (JCPDS: 01-077-2296). El espaciado d calculado de franjas de red en muestras tratadas a 500 y 750 °C es ~0,364 y 0,367 nm, atribuidos a plano (110) de estructura ortorrómbica SnO₂ según JCPDS NO. 01-078-1063. Estos resultados concuerdan bien con hallazgos XRD [49, 57, 58]. Las imágenes IFFT proporcionadas muestran claramente aumento en espaciado d con aumento de temperatura.

Imágenes FESEM de óxido de estaño recocido a 250 (Fig. 7a) y 750 °C (Fig. 7b) muestran variación en forma y tamaño de estructuras de red como forma no uniforme o aleatoria de partículas con granos individuales grandes y pequeños junto con aglomeración. Figura 7b muestra micrografía FESEM de muestra recocida a 750 °C que significa partículas pequeñas aglomeradas y estructura bien crecida en comparación con muestra recocida a baja temperatura con distribución aleatoria de partículas. La aglomeración de partículas resulta en reducción de energía libre superficial debido a aumento en su tamaño resultando en disminución de su área superficial. La aglomeración de nanopartículas se debe a adhesión de partículas entre sí por fuerzas débiles llevando a entidades de (sub) micrón [59].

La composición de óxido de estaño fabricado recocido a 750 °C se analizó con técnica EDX como se muestra en Fig. 7c. Espectros de muestra mostraron claramente presencia de Sn, O y C con % peso de 53,7, 42,2 y 4,0%, respectivamente. No hubo constituyentes de impurezas en el producto lo que sugirió alta pureza de nanomaterial SnO₂ mientras contenido de C puede originarse de pestañas de carbono usadas para sostener muestras.

Una técnica de espectroscopía de absorción no destructiva se usó para estudiar propiedades ópticas de nanomateriales conductores y semiconductores. Espectros de absorción obtenidos de óxido de estaño recocido a varias temperaturas se ilustran en Fig. 8a. Varios factores afectan absorbancia esperada como deficiencia de oxígeno, banda prohibida de energía, naturaleza de impureza y rugosidad superficial. Espectros obtenidos de óxido de estaño recocido exhibieron corte ultravioleta a 300–365 nm [60], que puede deberse a foto-excitación de electrones de banda de valencia a conducción. Los espectros de absorción disminuyeron ligeramente entre 300 y 365 nm con aumento de temperatura como se muestra en Fig. 8a. Para calcular banda prohibida, relación Tauc αhν = A {(hν - E_g)}ⁿ donde α representa coeficiente de absorción, A representa constante mientras n = 1/2 para banda prohibida directa. Una extrapolación de {(αhν)}² versus hν gráfico proporciona valor de banda prohibida óptica E_g (Fig. 8b). Energías de banda medidas fueron 3,51, 3,32 y 3,71 eV para muestras recocidas a 250, 500 y 750 °C, respectivamente [61, 62]. La banda prohibida de productos es consistente con valores reportados en literatura [61]. En general, a medida que temperatura aumenta, átomos de nanopartículas alcanzan más energía para cambiar su posición para recristalización lo que altera su morfología y reduce tamaño de grano (puede analizarse desde datos HRTEM). A medida que tamaño de partícula disminuye, valor de banda prohibida aumenta lo que se atribuye a efecto normal de confinamiento cuántico. Tendencia similar observada por Malik et al. [63]. La banda prohibida más baja exhibida por nanomaterial recocido a 500 °C se atribuyó a nanoestructuras únicas o sintetización amorfa de óxido de estaño policristalino y generación de vacancias de oxígeno que producen corrimiento al rojo. Modelo Tauc establece que semiconductores amorfos o desordenados en superficie tienen estados de cola de banda localizados con menor energía de banda [64].

La fotoactividad de productos de óxido de estaño recocidos a varias temperaturas se examinó emprendiendo fotodegradación de colorante MB bajo irradiación de luz (Fig. 9). Variación en absorción óptica de solución MB a λ_max = 665 nm durante su foto-descomposición se muestra en Fig. 9a. Adición de muestras fabricadas produce disminución en banda de absorción MB con tiempo. El máximo rendimiento fotocatalítico fue exhibido por muestra recocida a 500 °C (E_g = 3,32 eV) atribuido a morfología específica y baja tasa de recombinación electrón-hueco. Observamos 86,0, 92,4 y 71,6% degradación MB por fotocatalizadores de óxido de estaño preparados por recocido a 250, 500 y 750 °C en 80 min, respectivamente (Fig. 9b). La fotoactividad de materiales semiconductores también está relacionada con su energía de banda prohibida que influye el potencial redox de par electrón-hueco fotogenerado durante proceso de degradación MB. Entre tres muestras probadas, fotocatalizador recocido a 500 °C presentó la menor energía de banda prohibida (3,32 eV) mientras que el % degradación considerablemente mejorado exhibido por este producto fue acreditado a su estructura única y alto grado de aglomeración como se muestra en Fig. 9b. Una pseudo-primer orden de degradación de colorante se ilustra usando ln (C_o/C) vs. tiempo de irradiación: ln (C_o/C) = kt como se exhibe en Fig. 9c donde k denota constante de velocidad, C_o y C representan concentración inicial y final de colorante (MB), respectivamente [63, 65,66,67]. El valor de k usando nanomaterial preparado a 500 °C fue 0,59 min⁻¹ y disminución significativa en muestras sintetizadas a 250 y 750 °C se observó en ~0,50 y 0,31 min⁻¹, respectivamente (Fig. 9d).

Para tratamiento de agua contaminada, fotocatalizadores requieren exhibir estabilidad y reutilización por largos periodos para hacer el proceso económicamente factible. En el presente estudio, cuatro ciclos de pruebas se realizaron para remover MB usando fotocatalizadores de óxido de estaño fabricados para determinar su estabilidad. La observación de cuatro ciclos consecutivos de degradación de colorante se presentan en Fig. 10a, b. Nanomaterial recocido a 500 °C mostró ligera disminución en foto-descomposición MB tras cuatro ciclos (6% disminución). Los resultados de remoción de contaminantes de agua reportados en este estudio son comparables con los reportados por Prakash et al. [65].

Las nanoestructuras de SnO fabricadas a varios tratamientos de temperatura actividad antibacteriana in vitro medida en términos de zonas de inhibición (mm) junto con eficacia comparativa % se muestran en Fig. 11a–d y Tabla 1. Los gráficos presentan proporción directa entre concentración de nanoestructuras y zonas de inhibición formadas. Zonas de inhibición significativas registradas para SnO (250, 500 y 750 °C) muestras para E. coli y S. aureus oscilaron entre 2,85–3,5 mm, 3,35–3,75 mm y 3,25–4,75 mm y 4,55–5,35 mm a concentraciones baja y alta, respectivamente, Fig. 11a, b y Tabla 1. La eficacia % de nanomateriales sintetizados aumentó de 67,0–82,3 a 78,8–88,2% para E. coli y similarmente, 45,4–66,4% y 63,6–74,8% para S. aureus, respectivamente, Fig. 11c, d. Todos los resultados medidos se compararon con ADI (0 mm). Control positivo mostró 4,25 mm y 7,15 mm zonas de inhibición para E. coli y S. aureus, respectivamente, Fig. 11a, b. En general, nanoestructuras SnO₂ optimizadas a 500 °C resultaron más potentes a ambas concentraciones y más ampliamente, SnO₂ resultó más potente contra E. coli gram-negativo (G –ve) comparado con S. aureus gram-positivo (G +ve).

Tamaño, concentración y morfología de nanoestructuras afecta directamente estrés oxidativo producido. Actividad antibacteriana que pone en riesgo tamaño y concentración muestra relación inversa al tamaño [68,69,70]. Nanoestructuras producen más eficientemente especies reactivas de oxígeno (ROS) que existen en membrana bacteriana resultando en extrusión de orgánulos celulares y muerte bacteriana [71]. SnO₂ genera más eficientemente ROS incluyendo peróxido de hidrógeno (H₂O₂), grupos OH e iones superóxido [72]. La eficacia antibacteriana aumentada de SnO fabricado a varios tratamientos de temperatura para E. coli comparado con S. aureus podría atribuirse a diferencia en estructuras de pared celular de bacterias. Bacterias G –ve pared celular consiste en capa delgada de peptidoglicano con membrana externa conteniendo proteínas y fosfolípidos mientras pared celular G +ve contiene capa gruesa de peptidoglicano con ácidos lipoteicoico y teicoico. Esta diferencia mayor en estructura de pared celular de ambas bacterias conduce hacia máxima eficacia de nanoestructuras fabricadas hacia G −ve comparado con G +ve bacterias [18].

Resistencia adquirida por patógenos microbianos contra varios fármacos antibióticos especialmente multirresistencia plantea enorme amenaza a salud pública global y hay necesidad urgente de más fármacos antibióticos con modo de acción novedoso [73]. Antibióticos pertenecientes a varias clases siguen diferentes mecanismos para su actividad y blanco vías vitales para supervivencia bacteriana. Por ejemplo, antibióticos beta-lactámicos como penicilina blanco enzimas involucradas en síntesis de peptidoglicano (precursor importante para síntesis de pared celular) [74] mientras Rifampicina, un antibiótico bien conocido, blanco enzima pertenece a vías biosintéticas de ácido nucleico [42] sugiriendo importancia de ambas vías biosintéticas de pared celular y ácido nucleico como blanco para descubrimiento de nuevos antibióticos [75]. Aunque actividad bactericida de varias nanopartículas se ha reportado previamente en años recientes, aún el mecanismo exacto de su acción no se conoce [76, 77]. Teniendo en cuenta buena actividad antibacteriana de SnO₂ contra E. coli y S. aureus, realizamos estudios de acoplamiento molecular para identificar su posible mecanismo de acción contra enzimas β-lactamasa y girasa de ADN como blanco potencial.

En caso de β-lactamasa de E. coli, la mejor puntuación de enlace observada fue −5,71 kcal/mol mostrando interacción de enlace H con Lys239 (1,80 Å) y Gly235 (1,66 Å) junto con interacción de contacto metálico con Gln35 como se muestra en Fig. 12a, b. Similarmente, la mejor puntuación de enlace obtenida para girasa de ADN de E. coli fue −9,57 kcal/mol teniendo interacción de enlace H con Thr163 (1,46 Å), Gly77 (1,43 Å) y Glu50 (3,36 Å) junto con interacción de contacto metálico con Gly75 como se muestra en Fig. 12c, d.

La mejor puntuación de enlace obtenida para β-lactamasa de S. aureus fue −11,83 kcal/mol. Los patrones de enlace de SnO₂ dentro del bolsillo activo involucraron interacción de enlace H con Ser400 (2,16 Å), Gly522 (1,99 Å) e Ileu524 (1,90 Å). Además, interacción de contacto metálico se observó entre SnO₂ y Gln521 como se muestra en Fig. 13a, b. Para girasa de ADN de S. aureus, la mejor conformación obtenida mostró interacción de enlace H con Gly85 (2,55 Å) y Thr173 (1,54 Å) teniendo puntuación de enlace −8,61 kcal/mol (Fig. 13c, d).

Conclusión

En resumen, nanopartículas de óxido de estaño recocidas a varias temperaturas se sintetizaron por un proceso de precipitación fácil y simple. El recocido de muestras a 250 °C durante síntesis produjo predominantemente SnO ortorrómbico que se transformó a SnO₂ a 500 y 750 °C. Los análisis XRD y HRTEM revelaron que nanopartículas poseían estructura ortorrómbica mientras tamaño de partícula aumentó inicialmente con aumento de temperatura a 500 °C seguido de disminución a 750 °C. Gran tamaño de partícula a 500 °C se atribuyó a estructura única exhibida por muestra recocida a esa temperatura. Nanoestructuras fabricadas demostraron comportamiento bien cristalizado junto con aglomeración. Fotoactividad de nanomateriales de óxido de estaño recocidos se evaluó descomponiendo colorante MB usado como contaminante orgánico modelo y se realizó comparación entre muestras recocidas. Producto sintetizado a 500 °C exhibió 6% mayor actividad comparado a muestra recocida a 250 °C durante degradación de MB. Máxima degradación MB alcanzada en este estudio fue 92% tras 80 min tiempo de irradiación por muestra 500 °C. Se sugiere que radicales (*OH¹⁻ y *O₂⁻) y huecos son entidades activas mayores en proceso fotocatalítico. Predicciones in silico concuerdan bien con actividad bactericida in vitro de NPs SnO₂. Estudios de acoplamiento molecular de NPs SnO₂ contra enzimas seleccionadas, beta lactamasa y girasa de ADN, sugirieron su tendencia a impedir actividad de estas enzimas que necesitan explorarse y confirmarse ulteriormente mediante estudios de ensayo de inhibición enzimática.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos están completamente disponibles sin restricción.

Abreviaturas

EDS:

Espectroscopía de rayos X dispersiva en energía

FTIR:

Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier

G +ve:

Gram-positivo

G −ve:

Gram-negativo

HR-TEM:

Microscopía electrónica de transmisión de alta resolución

JCPDS:

Comité Conjunto de Estándares de Difracción de Polvos

NPs:

Nanopartículas

SnO:

Óxido de estaño

UV–Vis:

Espectroscopía ultravioleta-visible

XRD:

Difracción de rayos X