Fullerenol Hidrosoluble con Grupos Hidroxilo Optimizados Mejora la Inactivación Fotodinámica de Microbios Infecciosos por Dos Fotones

Resumen

Se preparó exitosamente fullerenol hidrosoluble [C₆₀(OH)₄₆] que exhibió alto rendimiento cuántico de oxígeno singulete y generó eficientemente especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, el C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble con mayor composición de grupos hidroxilo expuestos mostró mayor estabilidad y características de dos fotones frente al de menor composición. Por tanto, el fullerenol preparado puede ser un fotosensibilizador efectivo de dos fotones. El C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble presentó propiedades favorables de dos fotones. Durante la terapia fotodinámica de dos fotones, el C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble mostró actividad antimicrobiana sustancial contra Escherichia coli a nivel de energía ultradado de 211,2 nJ píxel⁻¹ con 800 barridos y longitud de onda de fotoexcitación de 760 nm.

Introducción

Diversas moléculas fotosensibilizadoras (PS) se han sintetizado en las últimas décadas. Sin embargo, las aplicaciones clínicas de PS existentes presentan problemas: la mayoría son hidrofóbicas y se agregan en medios acuosos, reduciendo su rendimiento cuántico (QY). Además, los PS agregados no pueden inyectarse por vía intravenosa. Se requiere acumulación selectiva de PS en tejidos enfermos para evitar daño a células sanas. Desarrollar un portador de PS efectivo sigue siendo un gran desafío para la terapia fotodinámica (PDT). Por ello, crece el interés en usar nanopartículas como portadores de PS.

Los avances en nanobiotecnología han estimulado el interés en aplicaciones biomédicas de una nueva clase de nanoestructuras compuestas exclusivamente de átomos de carbono, el fulereno C₆₀, moléculas esferoidales (0,72 nm de diámetro) no tóxicas con propiedades fisicoquímicas únicas. El pequeño tamaño de moléculas de C₆₀ lipofílicas es responsable de su compatibilidad estérica con moléculas biológicas y promueve su integración en regiones hidrofóbicas de membranas. Debido al sistema π-conjugado extendido de sus orbitales moleculares, el C₆₀ absorbe luz ultravioleta–visible (UV-vis) y genera especies reactivas de oxígeno (ROS) con rendimiento cuántico de oxígeno singulete (Φ_Δ) cercano al 100%. Además, sus propiedades fisicoquímicas le permiten generar ROS y servir como PS para PDT. Los fulerenos también pueden inducir efectos prooxidantes, dependiendo del fulereno usado, tipo celular y configuración experimental. El C₆₀ tiene solubilidad extremadamente baja en soluciones polares, limitando considerablemente sus aplicaciones médicas. Sin embargo, por la presencia de dobles enlaces, el C₆₀ puede modificarse fácilmente con grupos químicos para aumentar su solubilidad en agua. Por tanto, los derivados hidrosolubles de C₆₀ tienen mayores oportunidades para aplicaciones médicas, incluyendo neuroprotección, administración de fármacos y genes, fotosensibilización y biosensores.

La microscopía láser de dos fotones (también llamada microscopía láser de dos fotones) implica el uso de excitación "no lineal" localizada para excitar fluorescencia solo en un plano delgado escaneado. Se ha usado en diversos estudios de imagen. Típicamente se acopla con excitación láser de infrarrojo cercano (NIR) para aprovechar la transmisión tisular máxima inherente para bioimagen; el NIR tiene ventajas de dispersión ligera, baja absorción de energía, penetración óptima de irradiación y fotoblanqueo reducido de especímenes. El acoplamiento de microscopía de dos fotones con excitación láser NIR se ha convertido en la técnica preferida para microscopía de fluorescencia en tejidos gruesos y especímenes biológicos profundos y se ha aplicado extensamente en otras terapias de fotoexcitación. Además, por su energía ultradada y fotoexcitación corta, la microscopía láser de dos fotones se considera un enfoque alternativo para realizar PDT. Aunque algunos PS son tóxicos, los de alto Φ_Δ se priorizan para PDT. Un alto valor Φ_Δ es particularmente deseable cuando se usan técnicas de dos fotones para evaluar actividades moleculares en fotopropiedades y realizar estudios microscópicos no lineales eficientemente; esto es deseable porque la relación entre energía absorbida y flujo de energía de entrada al especimen es alta, minimizando posible fotodaño al especimen. Sin embargo, la literatura no incluye estudios que hayan considerado el uso de materiales con propiedades de dos fotones para PDT. Para llenar este vacío, el presente estudio aplicó fullerenol hidroxilado hidrosoluble con fuerte capacidad de donación electrónica y gran sistema π-conjugado para aumentar la eficiencia de transferencia de carga, mejorando así las propiedades de dos fotones. Específicamente, se derivó C₆₀(OH)₄₆ hidroxilado hidrosoluble y se aplicó como PS de dos fotones para eliminación efectiva de microbios usando irradiación láser de femtosegundo de energía ultradada y solo 800 barridos bajo excitación de dos fotones (TPE; longitud de onda de excitación, 760 nm). Para la irradiación láser de femtosegundo de energía ultradada, la energía fue 211,2 nJ píxel⁻¹ y potencia 2,112 mW (respecto al cálculo de potencia láser tras el objetivo, ver sección "Materiales y Métodos" y Fig. 1a, donde la resolución del punto focal x–y y eje z del sistema láser son aproximadamente 0,37538 y 0,90159 μm, respectivamente); además, para el proceso de barrido, el tiempo total de exposición efectiva fue ~3,2621 s, tasa de barrido 4,0776 ms barrido⁻¹, y área de barrido 200 × 200 μm² (ver "Materiales y Métodos" para detalles del cálculo). El C₆₀(OH)₄₆ hidroxilado hidrosoluble logró eliminación de casi 100% de Escherichia coli (E. coli, cepa bacteriana Gram-negativa). Además, el C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble con mayor composición de grupos hidroxilo exhibió fotopropiedades de dos fotones superiores frente al de menor composición bajo TPE; por tanto, el C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble derivado puede considerarse con potencial considerable para uso en PDT simultánea para eliminar microbios malignos.

Materiales y Métodos

Preparación y Caracterización de Fullerenoles Hidrosolubles, C₆₀(OH)₂₁ y C₆₀(OH)₄₆

El fulereno crudo se obtuvo comercialmente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), y el precursor C₆₀(OH)₁₂ se produjo como se describió previamente. Primero, se añadió solución de peróxido de hidrógeno al 30% (100 mL; Sigma-Aldrich) al material inicial, 0,5–1,0 g de C₆₀(OH)₁₂, y la mezcla se agitó vigorosamente a 60 °C bajo aire. Tras enfriar, se añadió una mezcla de disolventes: 2-propanol, éter dietílico y hexano (100–200 mL cada uno; Sigma-Aldrich), y la solución se centrifugó y decantó. El sólido restante se lavó dos veces con 200 mL de éter dietílico mediante centrifugación y decantación. Finalmente, los productos finales C₆₀(OH)₂₁ y C₆₀(OH)₄₆ hidrosolubles se obtuvieron secando el residuo bajo vacío a temperatura ambiente durante la noche. El peso del producto final se calibró mediante análisis termogravimétrico. La morfología se observó por microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HR-TEM, JEOL 3010, Akishima, Tokio, Japón) a resolución ~1,11 ± 0,03 nm y 1,13 ± 0,04 nm para C₆₀(OH)₂₁ y C₆₀(OH)₄₆, respectivamente. La dispersión dinámica de luz (DLS, Malvern Nano-ZS90, Worcestershire, Reino Unido) determinó el tamaño de los materiales. Los grupos funcionales expuestos se examinaron por espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR, RX1, PerkinElmer, Waltham, MA, USA). La espectroscopía UV-vis se realizó con espectrómetro (U-4100, Hitachi, Chiyoda-ku, Tokio, Japón). La química de superficie del fullerenol se examinó por espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS, espectrómetro PHI 5000 VersaProbe, Chanhassen, MN, USA). El peso molecular se determinó por espectrómetro de masas de desorción de campo (FD, AccuTOF, GCx-plus, JEOL, Akishima, Tokio, Japón), confirmando 21 y 46 grupos hidroxilo respectivamente.

Cultivos Bacterianos

E. coli, obtenida de nuestro laboratorio, se cultivó en agar nutritivo LB (por litro: triptona 10 g, extracto de levadura 5 g, cloruro sódico 8 g, agar 15 g, pH 7,5) (Sigma-Aldrich) e incubó a 37 °C.

Ensayo de Biocompatibilidad con Conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC)

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) se mezcló con material (0–9 μg mL⁻¹) e incubó 3 h a 37 °C. Tras incubación, la mezcla se centrifugó y los pellets bacterianos se diluyeron (OD₆₀₀ ~ 0,05). Se realizó dilución 10⁻⁵ a 10⁻⁸ en bacterias incubadas y se sembraron en placas de agar. Las placas permanecieron en incubadora (37 °C) durante la noche. El número de bacterias supervivientes se determinó y expresó como porcentaje (%) correspondiente a UFC mL⁻¹. Datos: medias ± DE (n = 6).

Medición de ψ_Δ

Según estudio previo, ψ_Δ puede obtenerse. Las mediciones se realizaron en D₂O a 355 nm, usando meso-tetra(4-sulfonatofenil)porfina diclorhidrato (TSPP; Sigma-Aldrich) como referencia (ψ_Δ = 0,64).

Medición de Rendimiento Cuántico de Fluorescencia (QY)

El QY de fotoluminiscencia (PL) relativo del agente de contraste es usualmente la relación entre fotones emitidos y absorbidos: QY = QY_ref (η²/η_ref²)(I/A)(A_ref/I_ref), donde QY_ref = 0,28 es el QY de Cy5.5 en dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich) como referencia, η es el índice de refracción de agua bidestilada = 1,33 (η_ref de DMSO = 1,48), I la intensidad de fluorescencia integrada y A la absorbancia a la longitud de onda de excitación. La excitación de un fotón (OPE) o dos fotones (TPE) produce el mismo QY.

Sistema Óptico Láser de Femtosegundo para Medición de Absorción de Dos Fotones (TPA) y Luminiscencia de Dos Fotones (TPL)

Se usó sistema óptico láser de titanio-zafiro (ti-sa) de femtosegundo casero (frecuencia de repetición 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, USA) según estudios previos.

Medición de TPA

Con velocidad de escáner galvométrico de 2 m ms⁻¹, el espectro de excitación se midió a 720–820 nm con potencia de excitación de 2,8 mW [potencia antes del objetivo; potencia tras objetivo (o en muestra) 0,9856 mW o 98,56 nJ píxel⁻¹]. Así se midieron los espectros TPA relativos en función de la longitud de onda de excitación para los fullerenoles.

Medición de Espectros TPL

El material se expuso a TPE del láser de femtosegundo a longitud de onda 760 nm, área de barrido 200 × 200 μm², frecuencia 10 kHz, tiempo de exposición 1,638 s/(barrido, píxel) = 100 μs, 128 × 128 píxeles/barrido, área de píxel 1562,5 × 1562,5 nm². El área del punto focal se calculó como πd²/4, donde d = 0,61 λ/apertura numérica (NA) es el ancho a media altura de la cintura del haz. Por ejemplo, en punto focal x–y con excitación 760 nm y objetivo de inmersión en aceite ×40 con NA 1,3, d = 0,61 × 800 nm/1,3 = 375,38 nm = 0,37538 μm, y la resolución en eje z fue 0,90159 μm. Para excitación 760 nm, el tiempo de exposición por barrido para un nanomaterial individual es (área punto focal/área píxel) × 100 = 4,0776 ms, y tiempo total de exposición t = 4,0776 ms × número de barridos. Se usó objetivo de inmersión en aceite ×40 (NA 1,3) para recoger señales, y el rango de detección del espectrofotómetro fue 300–695 nm.

Los cálculos de potencia láser (mW o nJ píxel⁻¹) usada en la muestra: para objetivo ×40 inmersión en aceite (NA 1,3), la transmitancia a 760 nm es ~88% en este sistema óptico, y la potencia láser de la salida al objetivo es solo 40% de la potencia original por pérdidas. Por tanto, la energía calculada tras objetivo (en muestra) es P_salida (mW) × 40% × 88% = 0,352 × P_salida (mW). Ejemplo: P_salida = 2,8 mW, energía tras objetivo = 2,8 × 0,4 × 0,88 = 0,9856 mW. Con tasa de barrido 10 kHz (cada pulso 0,1 ms píxel⁻¹), la energía en muestra (J píxel⁻¹) ≈ P_salida (mW) × 0,4 × 0,88 × 0,1 ms = 0,0352 × P_salida (J píxel⁻¹). Ejemplo: P_salida = 2,8 mW, energía en muestra = 2,8 × 0,4 × 0,88 × 0,1 ms = 0,09856 μJ píxel⁻¹ = 98,56 nJ píxel⁻¹. La potencia tras objetivo (en muestra) se usó y marcó a lo largo del manuscrito.

Medición de Sección Eficaz Absoluta de TPE

La sección eficaz absoluta de TPE se midió mediante señal de luminiscencia vía sistema óptico láser de femtosegundo según estudios previos. Se verificó la TPL de fluoresceína y rodamina B (Sigma-Aldrich). Los resultados en Fig. 1b se obtuvieron midiendo la dependencia de la intensidad de emisión con rango de potencia 704 nJ píxel⁻¹ (7,04 mW) a 2816 nJ píxel⁻¹ (28,16 mW). Se midió dependencia cuadrática con exponentes 2,03 para fluoresceína y 2,02 para rodamina B al aumentar la potencia de excitación para determinar la luminiscencia por TPE. Según estudios previos, las secciones eficaces de acción de TPE para fluoresceína y rodamina B son 36,4 y 68,0 GM (1 GM = 10⁻⁵⁰ cm⁴ s fotón⁻¹), respectivamente, para excitación 760 nm. También se consultó el sitio web https://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html (Prof. Chris Xu, Universidad Cornell, NY, USA). Las secciones eficaces de acción TPE para fluoresceína y rodamina B se calcularon en 36,5 y 66,1 GM (Tabla 1), error <5% frente al laboratorio del Prof. Xu. En este estudio, la rodamina B se eligió como referencia estándar para determinar la sección eficaz, y las secciones eficaces absolutas de TPE para C₆₀(OH)₂₁ y C₆₀(OH)₄₆ hidrosolubles fueron ~1230,51 GM y ~1037,21 GM, respectivamente. Los parámetros medidos para calcular las secciones eficaces absolutas de TPE se muestran en la Tabla 3. No se observó variación lote a lote en propiedades de dos fotones y capacidad fotodinámica de dos fotones.

Sistema Óptico Láser de Femtosegundo (para Microscopía de Imagen de Vida de Fluorescencia, FLIM)

Se usó sistema óptico láser de ti-sa de femtosegundo casero (frecuencia 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, USA) según estudios previos. Los datos de vida y parámetros se generaron usando ajuste de ecuación triple-exponencial mientras se monitorizaba la emisión bajo TPE (Ex, 760 nm).

Cálculo de Tasas de Decaimiento Radiativo y No Radiativo

El QY de PL y la vida son parámetros mayores al investigar características de emisión de colorantes fluorescentes en diversos entornos. El QY (Q) se expresa: Q = Γ/(Γ + k), donde Γ es la tasa de decaimiento radiativo y k la no radiativa. La vida de fluorescencia se define como tiempo promedio para que un electrón en estado excitado decaiga al estado fundamental. La vida TPL τ también se relaciona con las tasas de decaimiento: τ = 1/(Γ + k). Siguiendo ecuaciones (2) y (3), se calculan las tasas de decaimiento radiativo y no radiativo.

Tras absorción de un fotón, un electrón débilmente unido de la molécula fluorescente (fluoróforo) se promueve a nivel energético superior. El fluoróforo está en estado excitado A*, metaestable; retorna a estado fundamental estable A radiativamente emitiendo fotón hν (A* → A + hν) o no radiativamente disipando energía como calor (A* → A + calor). La despoblación del estado excitado depende de vías de desexcitación disponibles. La fluorescencia es desactivación radiativa del nivel vibracional más bajo del primer estado singulete excitado electrónicamente S₁ al estado fundamental S₀. Los estados singuletes son niveles energéticos poblables por electrón débilmente unido sin inversión de spin. Los procesos de absorción y emisión se ilustran en diagrama de niveles energéticos de Jablonski.

La vida de fluorescencia τ es el tiempo promedio que un fluoróforo permanece en S₁ tras excitación. τ = 1/(Γ + k), donde k = k_ic + k_isc (constante de conversión interna + cruce intersistema a estado triplete). La emisión fluorescente siempre ocurre desde el nivel vibracional más bajo de S₁ (regla de Kasha), indicando que el fluoróforo no tiene memoria de su vía de excitación; OPE y TPE producen mismo espectro, QY y vida.

Determinación de Tasas de Viabilidad Bacteriana Tras Exposición Láser

Método de Conteo UFC

Bacterias (OD₆₀₀ ~ 0,05) se mezclaron con material (3 o 6 μg mL⁻¹) incubando 3 h a 37 °C en oscuridad. Tras incubación, la mezcla se centrifugó, pellets se diluyeron (OD₆₀₀ ~ 0,05) y expusieron a potencia TPE 211,2 nJ píxel⁻¹ con 800 barridos (~3,2621 s exposición efectiva; Ex, 760 nm). Luego dilución 10⁻⁵ a 10⁻⁸ y siembra en placas de agar. Placas en incubadora (37 °C) noche. Bacterias supervivientes determinadas y expresadas como porcentaje (%) correspondiente a UFC mL⁻¹. Datos: medias ± DE (n = 6).

Kit LIVE/DEAD

Mismo protocolo que conteo UFC. Tras exposición TPE, pellets se tiñeron con kit LIVE (SYTO 9, fluorescencia verde)/DEAD (yoduro de propidio, PI, fluorescencia roja) (Thermo Fisher Scientific) según instrucciones. La viabilidad bacteriana se cuantificó para pruebas antimicrobianas, mostrando casi todas las bacterias tratadas con nanomaterial muertas tras tratamiento. Viabilidad similar cuantificada por UFC para determinar efectos antibacterianos eficientes en PDT. Datos: media ± DE (n = 6).

Detección de ROS

Oxígeno Singulete (¹O₂)

(a) Material (3 o 6 μg mL⁻¹) tratado con bacterias (OD₆₀₀ ~ 0,05), incubado 3 h a 37 °C en oscuridad. Luego expuesto a fotoexcitación TPE (211,2 nJ píxel⁻¹, 800 barridos; Ex, 760 nm) y mezclado con reactivo Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) 1 μM (Thermo Fisher) (Ex/Em: 488/525 nm). Medición por espectrómetro de fluorescencia. Para neutralización ROS, mezcla con 30 ppm antioxidante α-tocoferol/linoleato de metilo (Sigma-Aldrich) en oscuridad y misma fotoexcitación TPE. (b) Mismo protocolo pero mezclado con 10 μM trans-1-(2′-metoxivinil)pireno (t-MVP, Thermo Fisher)/0,10 M SDS (Sigma-Aldrich) (Ex/Em: 352/465 nm). Neutralización ROS con 30 ppm α-tocoferol/linoleato de metilo en oscuridad. La reacción de t-MVP con ¹O₂ produce intermedio dioxetano que fluoresce al descomponerse en 1-pirenocarboxaldehído. Esta sonda fluorescente selectiva no reacciona con otras especies oxigenadas activadas (radicales hidroxilo, superóxido, peróxido de hidrógeno). Medición por espectrómetro de fluorescencia.

Anión Radical Superóxido (O₂^•−)

(a) Material (3 o 6 μg mL⁻¹) con bacterias (OD₆₀₀ ~ 0,05), incubación 3 h a 37 °C oscuridad. Fotoexcitación TPE (211,2 nJ píxel⁻¹, 800 barridos; Ex, 760 nm) y mezcla con 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT, 0,45 mM; Sigma-Aldrich). XTT interactúa con O₂^•− produciendo formazán XTT, absorción fuerte (470 nm). Espectrómetro UV-vis monitoriza absorción. Neutralización ROS con 30 ppm α-tocoferol/linoleato de metilo en oscuridad y misma fotoexcitación. (b) Mismo protocolo pero mezcla con 50 mM tampón bicarbonato (pH 8,60) y glutatión (GSH, γ-L-glutamil-L-cisteinil-glicina, Sigma-Aldrich)/0,80 mM tampón bicarbonato (ensayo Ellman para detección O₂^•−). Experimentos según procedimiento previo. Pérdida GSH (%) = diferencia absorbancia muestra vs control negativo / absorbancia control negativo. Señal O₂^•− generado según cálculo previo. Datos: medias ± DE (n = 6).

Ensayo de Captación

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) incubadas con 3 μg mL⁻¹ material. Absorbancia de 3 μg mL⁻¹ material registrada por UV-vis (Abs ~203 nm). Materiales mezclados con E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) a 37 °C de hora 1 a 10, centrifugadas (1200 rpm) para remover exceso material y medir absorbancia del sobrenadante. Diferencia absorbancia entre sobrenadante recogido y material original estimada, resultando porcentaje de captación en cada punto temporal. Datos: medias ± DE (n = 6).

Análisis Estadístico

Significancia estadística por análisis de varianza. Valor p considerado significativo para todos los tratamientos.

Resultados y Discusión

Caracterización del Fullerenol Hidrosoluble

El C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble (fullerenol), determinado como circular y monodisperso, se sintetizó según estudio previo. El tamaño lateral medio fue ~1,13 ± 0,04 nm, determinado por TEM baja magnificación (Fig. 2a) e HR-TEM (Fig. 2b). El fullerenol exhibió cristalinidad favorable con buen espaciado de red, correspondiente al espaciado d de franjas de red {1\overline{1}00} del fullerenol. Sin embargo, estas partículas pueden formar agregados por enlace hidrógeno en solución acuosa pH 7,0. El tamaño medio de agregados fue ~130 nm (análisis DLS). Los agregados permanecieron altamente estables 3 meses en distintos entornos fisiológicos: solución acuosa pH 7,0, PBS 1× y medio de cultivo (Archivo adicional 1: Tabla S1). En espectro UV-vis del fullerenol, picos de absorbencia ~216 y 309 nm, atribuidos a transición π–π* de enlaces C=C aromáticos y transiciones n–π* del hombro C=O, respectivamente. La transición π-electrónica en el fullerenol contenía oxígeno (Fig. 2c), típica de dispersiones acuosas, confirmando la presencia del fullerenol. Caracterizaciones adicionales por FTIR, XPS y espectrometría de masas confirmaron propiedades. FTIR analizó grupos funcionales expuestos: banda estiramiento C–O ~1109 cm⁻¹ (banda 1), estiramiento C–OH fenólico ~1271 cm⁻¹ (banda 2), estiramiento C=O alcohólico terciario ~1422 cm⁻¹ (banda 3), estiramiento C=C ~1674 cm⁻¹ (banda 4), estiramiento C=O ~1721 cm⁻¹ (banda 5), estiramiento C–H intermolecular con enlace hidrógeno y O–H carboxilato ~3318 cm⁻¹ (banda 6). También banda interferencia CO₂. Bandas revelan grupos hidroxilo y carbonilo expuestos y enlaces C=C aromáticos (Fig. 2d). XPS examinó química de superficie, predominantemente átomos de carbono. Espectros C(1s) desconvolucionados revelaron anillo no oxigenado (C–C/C=C, 286,1 eV), enlace C–O (286,9 eV), enlace C=O (288,0 eV). Ratio O(1s)/C(1s) ~35,8% (Fig. 2e). Peso molecular por espectrometría de masas FD (Archivo adicional 1: Fig. S2); número grupos hidroxilo (C–OH) confirmado 46, consistente con ratios atómicos y composiciones de enlace resumidas en Fig. 2. Resultados confirman síntesis exitosa del fullerenol.

Generación de ROS por Fullerenol Hidrosoluble bajo TPE

Un PS absorbe y transfiere energía lumínica a moléculas no absorbentes generando ROS, que matan células diana, dañan vasculatura tumoral y activan respuesta inmune antitumoral. Los PS tienen disposición particular de electrones en orbitales moleculares. En estado fundamental (singulete), tienen pares de electrones con spins opuestos en orbitales de baja energía. La absorción de luz a longitud de onda apropiada eleva un electrón a orbital de alta energía sin cambiar spin. Este estado singulete excitado (S₁) de vida corta (nanosegundos) puede perder energía retornando a estado fundamental emitiendo luz (fluorescencia) o calor. Alternativamente, cruce intersistema, donde el spin del electrón excitado se invierte, ocurre en estado S₁. Esta inversión de spin es responsable de la vida relativamente larga (microsegundos) del estado triplete excitado (T₁). Las transiciones radiativas triplete-singulete están inhibidas por requerir cambio de spin (proceso lento). Desde T₁, el PS puede retornar a estado fundamental emitiendo luz (fosforescencia) o transfiriendo energía a otra molécula. También puede perder energía por conversión interna o transiciones sin radiación al colisionar con otras moléculas. Cuanto mayor la vida en T₁, mayor probabilidad de colisión con otra molécula, resultando en producción ROS. La fotosensibilización de fullerenoles hidrosolubles resulta en transición a estado T₁ de vida larga y posterior transferencia de energía o electrón a oxígeno molecular, generando ROS como ¹O₂ y O₂^•−, con papeles principales en PDT. Por tanto, ¹O₂ y O₂^•− producidos por C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble deben detectarse directamente con irradiación láser. Para detectar formación de ¹O₂ y O₂^•− durante PDT, se inició PDT combinando C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble en estado triplete excitado, oxígeno y luz configurada a longitud de onda y energía adecuadas, introduciendo reactivos SOSG, t-MVP, XTT y GSH. Para explotar capacidad bactericida, se determinó ~760 nm como longitud de onda más eficiente para relación TPA máxima relativa del C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble bajo TPE (Fig. 3a), atribuible a transiciones interbandas. Esta longitud de onda se usó en experimentos posteriores. El C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble se fotoexcitó por TPE a potencia 211,2 nJ píxel⁻¹ con 800 barridos (Ex, 760 nm; tiempo exposición efectiva total ~3,2621 s) y dosis 3 o 6 μg mL⁻¹ (Archivo adicional 1: Tabla S2). Para confirmar participación ROS en efectos PDT del C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble, se usó α-tocoferol para neutralización ROS. La cantidad ROS generada disminuyó tras adición α-tocoferol, pero viabilidad bacteriana observada aumentó como se esperaba. Además, cantidad ROS generada dependió de la dosis administrada. Para prevenir producción ¹O₂ y O₂^•− por exposición inadvertida del C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble a luz blanca (podría comprometer experimentos), experimentos PDT posteriores se realizaron en oscuridad. Este estudio se centró en cantidades generadas de ¹O₂ y O₂^•−. El C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble exhibió efectos antibacteriales considerables, demostrando potencial para aplicación en PDT. Notablemente, tras mismo experimento, el C₆₀(OH)₂₁ hidrosoluble (Archivo adicional 1: Figs. S3, S4; Fig. 3a) fue menos efectivo formando ¹O₂ y O₂^•− comparado con C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble (Archivo adicional 1: Tabla S2). El C₆₀(OH)₄₆ generó más ¹O₂ y O₂^•− que el C₆₀(OH)₂₁; además, tuvieron valores Φ_Δ ~0,93 y ~0,85 respectivamente (referencia: Φ_Δ = 0,64 QY TSPP en D₂O).

Determinación de Capacidad Antimicrobiana usando TPE

Antes de experimentos antimicrobianos, se examinó toxicidad de fullerenoles hidrosolubles para excluir factores que contribuyan a eliminación bacteriana y confundan resultados. Además, para prevenir posible producción ROS por exposición inadvertida de materiales a luz blanca (podría confundir resultados), experimentos PDT deben realizarse en oscuridad. Este estudio usó E. coli Gram-negativa como plantilla experimental. Ensayo conteo UFC determinó número bacterias supervivientes (expresado como porcentaje, correspondiente a UFC mL⁻¹). Bacterias tratadas con dos tipos fullerenoles hidrosolubles (rango dosis 0–9 μg mL⁻¹) incubadas en oscuridad 3 h a 37 °C para determinar absorbancia 600 nm (OD₆₀₀ ~ 0,05; Archivo adicional 1: Fig. S1). Niveles crecimiento bacterias tratadas con fullerenoles monitorizados midiendo absorbancia 600 nm. Absorbancia inicial 0,05 OD₆₀₀, y absorbancia asociada a ambos materiales alcanzó ~0,37 con el tiempo. Ningún material inhibió proliferación bacteriana. Además, materiales generaron reducción ~0 log₁₀ en bacterias supervivientes (Fig. 3b), correspondiente viabilidad ~100% (Fig. 3c). Materiales exhibieron excelente biocompatibilidad con bacterias. Por tanto, materiales incubados 3 h en oscuridad a 37 °C usados para experimentos. Aunque fullerenol hidrosoluble genera ROS, interacciones entre materiales y reactivos (SOSG, t-MVP, XTT, GSH) pueden resultar en señales ROS falsas positivas, confundiendo resultados PDT. Por tanto, para excluir esta posibilidad, bacterias se introdujeron y trataron con materiales. Se observó cantidad ROS generada desde E. coli tratado con material fotoexcitado. Tabla 2 presenta cantidad ROS observada, revelando tendencia similar a Tablas S2–S3 (Archivo adicional 1: materiales solos y material-tratado Bacillus subtilis Gram-positivo); resultados consistentes con señal fosforescencia ¹O₂ emitida desde materiales a 1270 nm (Fig. 3d). PDT contra E. coli realizada con irradiación dosis baja energía (211,2 nJ píxel⁻¹ con 800 barridos, tiempo exposición efectiva total ~3,2621 s; Ex, 760 nm). Efectos PDT en viabilidad E. coli tratada con materiales fotoexcitados de dos fotones determinados (Fig. 4). No efectos bactericidas en bacterias solas (con o sin exposición láser) ni en panel bacterias tratadas con materiales sin tratamiento láser (Fig. 4a). Tras TPE, viabilidad bacteriana relativamente baja; viabilidad para panel tratado con C₆₀(OH)₂₁ hidrosoluble ~15%, correspondiente reducción ~0,823 log₁₀ (Fig. 4b). Por contraste, viabilidad para panel tratado con C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble ~0 (eficiencia eliminación 100%, reducción ~7,736 log₁₀). Al aumentar dosis, efectos bactericidas completos para ambos materiales (Fig. 4c, d). Efectos antimicrobianos no difirieron por tipo bacteria (Gram-negativa E. coli o Gram-positiva B. subtilis) tras fotoexcitación (Archivo adicional 1: Fig. S5). Además, fullerenoles que eliminaron bacterias: mayor composición grupos hidroxilo aumentó capacidad bactericida comparado con menor composición bajo condiciones idénticas.

Observación de E. coli Tratada con Fullerenol Hidrosoluble mediante TEM e Investigación de Propiedades de Dos Fotones

Para observar disrupción de bacterias tratadas con material tras fotoexcitación, se seleccionó C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble con alta eficiencia PDT, e imágenes por TEM. E. coli sin tratamiento (Fig. 5a) incubadas con fullerenol hidrosoluble 3 h, resultando adsorción sustancial materiales en superficies bacterianas. No morfologías inusuales observadas, indicando morfología bacteriana viva normal (Fig. 5b). Ensayo captación reveló adsorción materiales en superficie bacteriana, tasa explosión ~85% primeras 3 h incubación (Fig. 5c); tasa saturación hora 3 a 10. Materiales adsorbidos formaron barrera externa en superficie bacteriana. Sin embargo, E. coli exhibió apariencia distorsionada y cambios morfológicos severos tras 3 días incubación (Fig. 5d), resultando reducción 0,940 log₁₀ correspondiente viabilidad ~18% (Fig. 5f; Archivo adicional 1: Fig. S6). Absorción y recubrimiento material en superficie bacteriana suprimió absorción nutrientes esenciales para crecimiento microbiano y generó cambios en permeabilidad membrana (pared), induciendo desequilibrios osmóticos internos e inhibiendo crecimiento microbiano. Es decir, fullerenol hidrosoluble tuvo efectos antibacterianos (bacteriostáticos o bactericidas) tras 3 días incubación. Además, bacterias tratadas con material fotoexcitado, particularmente E. coli, exhibieron morfologías únicas con daño severo tras 3 h incubación (Fig. 5e, f; Archivo adicional 1: Fig. S6). No burbujas calor generadas en superficie bacteriana incurridas daño, indicando fullerenol hidrosoluble no tuvo propiedades fototérmicas tras fotoexcitación (Archivo adicional 1: Fig. S7). Viabilidad E. coli también determinada por fluorescencia y cuantificación (Fig. 6). Fluorescencia verde indicativa bacterias vivas Fig. 6a revela bacterias expuestas solo a láser mayormente intactas, consistente con Fig. 5a. Bacterias muertas detectables tras tratamiento materiales y exposición láser (fluorescencia roja Fig. 6b), consistente con Fig. 5e. Viabilidad cuantificada para pruebas antimicrobianas. Eliminación casi completa bacterias tratadas con material (Fig. 6c) observada. Viabilidad cuantificada también por ensayo UFC (Figs. 4a, b, 5f, Archivo adicional 1: Fig. S6) demostrando eficiencia antibacteriana C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble en PDT. Según resultados Figs. 4, 5, 6; Tabla 2; Tabla S2 (Archivo adicional 1), E. coli tratada con C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble susceptible a fotoexcitación, resultando mayor tasa muerte, mayor generación ROS y colapso morfológico más severo comparado con E. coli tratada con C₆₀(OH)₂₁ hidrosoluble. En general, sección eficaz absoluta TPE hace fluoróforos eficientes para estudios microscópicos no lineales porque relación energía absorbida/flujo energía entrada al especimen alta, minimizando fotodaño posible. Cuando técnicas dos fotones usadas para imagenar actividades moleculares en preparaciones biológicas vivas y tejidos turbios, sección eficaz favorable deseable. En este estudio, sección eficaz absoluta TPE calculada para C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble ~1037 GM (unidad Goeppert-Mayer, 1 GM = 10⁻⁵⁰ cm⁴ s fotón⁻¹) a longitud excitación 760 nm (fluoresceína referencia estándar sección eficaz [39, 40]; Fig. 1b, Tablas 1 y 3); sección eficaz absoluta para C₆₀(OH)₂₁ hidrosoluble ~1230 GM, similar a estudios relevantes. Estas secciones eficaces facilitan proceso dos fotones. Además, fluorescencia C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble iluminada por proceso dos fotones (Fig. 1b). QY fluorescencia relativo ~0,02 (QY referencia Cy5.5 en DMSO [31]: QY_ref = 0,28); QY absoluto ~0,01; mismos QY derivados para OPE y TPE. Por contraste, C₆₀(OH)₂₁ hidrosoluble tuvo QY relativos y absolutos menores (0,06 y 0,05). También se investigó vida fullerenoles. Efectos tasas decaimiento radiativo y no radiativo en QY y vida calculados. Vida media C₆₀(OH)₄₆ hidrosoluble ~7,797 ns, calculada de vidas observadas 0,149, 1,775, 19,679 ns; vida media C₆₀(OH)₂₁ hidrosoluble ~5,251 ns (Fig. 7, Tabla 4). Ratio tasas decaimiento radiativo/no radiativo C₆₀(OH)₄₆ ~0,020 (tasas ~2,565×10⁶ s⁻¹ a 1,257×10⁸ s⁻¹), mientras C₆₀(OH)₂₁ ~0,064 (~1,143×10⁷ s⁻¹ y 1,790×10⁸ s⁻¹; Archivo adicional 1: Tabla S4). Esto atribuible a existencia grupo hidroxilo en superficie fullerenol hidrosoluble, induciendo recombinación no radiativa pares electrón-hueco, inhibiendo emisión estado intrínseco. Sin embargo, grupos hidroxilo en borde fullerenol hidrosoluble pueden tener orbital molecular ocupado alto. Atribuible a fuerte interacción orbital entre grupos hidroxilo, aumentando eficiencia cruce intersistema (en vez de generación fluorescencia) y generando numerosos triplete nanomaterial con alta composición grupos hidroxilo; resultando alto valor Φ_Δ fullerenol hidrosoluble e induciendo reacción con oxígeno según diagrama Jablonski. Consecuentemente, PDT dos fotones puede realizarse efectivamente usando energía ultradada en tiempo extremadamente corto, proporcionando enfoque alternativo para eliminar especies malignas.