Mejora de la terapia HIFU contra el cáncer usando microburbujas sonodinámicas de N₂O

Resumen

La ultrasonografía focalizada de alta intensidad (HIFU) es un método representativo no invasivo de terapia contra el cáncer, pero su baja eficacia terapéutica y riesgo de daño a tejido normal circundante obstaculizan su desarrollo y aplicación clínica. La terapia sonodinámica (SDT) mata células tumorales mediante moléculas reactivas de oxígeno producidas por sonosensibilizadores durante tratamiento ultrasónico. La SDT puede mejorar la eficacia HIFU al igual que las microburbujas. En este trabajo, desarrollamos microburbujas nanoscópicas de N₂O (N₂O-mbs) mediante método mejorado de oscilación mecánica. Estas microburbujas mostraron buena biocompatibilidad y unión a células tumorales. La sonosensibilidad de N₂O-mbs se detectó tanto extracelular como intracelularmente mediante detección de generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Se evaluaron efectos tóxicos de estas microburbujas sonodinámicas en células tumorales y efecto sinérgico en tratamiento HIFU. La apoptosis significativa fue causada por ROS producidos por N₂O-mbs bajo irradiación ultrasónica. N₂O-mbs combinadas con HIFU aumentaron necrosis y apoptosis celular tumoral in vitro y volumen necrótico coagulativo e intensidad ecográfica en área diana hígado bovino ex vivo. Estas microburbujas sonodinámicas también demostraron inhibir eficientemente crecimiento tumoral in vivo. N₂O-mbs tienen impacto significativo en tratamiento y efecto ablación HIFU debido a ventajas microburbuja y extraordinaria sonosensibilidad. Hallazgo sugiere N₂O-mbs pueden ser nuevo agente auxiliar ultrasónico para promover ablación térmica tumoral HIFU.

Introducción

Los tumores malignos son una de las principales enfermedades que amenazan la vida y salud humana [1]. La ultrasonografía focalizada de alta intensidad (HIFU) es nueva técnica para ablación local no invasiva de tumores. HIFU usada exitosamente en tratamiento tumores sólidos benignos y malignos en hígado, riñón, páncreas, próstata, mama, hueso y útero [2,3]. Sin embargo, limitaciones inherentes HIFU, como decaimiento energía ultrasónica durante tratamiento, debilitamiento acumulación energía en área diana y daño tejido sano no diana reducen efecto terapéutico [4,5]. Campo focal formado por irradiación HIFU es pequeño, usualmente magnitud milimétrica. Toma largo tiempo ablar tumores grandes. Extensión tiempo irradiación HIFU aumenta temperatura corporal, incluso 39,2°C. A medida que profundidad tumor aumenta en cuerpo, energía ablación HIFU también debe aumentar [6]. Esto incrementa riesgo daño físico paciente y reduce eficiencia y seguridad tratamiento HIFU. Por tanto, investigadores se han comprometido a encontrar formas de aumentar eficiencia terapéutica HIFU en años recientes [7-9]. Las microburbujas podrían mejorar sinérgicamente eficacia terapéutica HIFU [7,10]. Gas en microburbuja pertenece a material alta impedancia acústica. Microburbujas aumentan dispersión y reflexión onda ultrasónica en área diana cuando HIFU irradia tejido tumoral [11,12]. Microburbujas aumentan temperatura área diana tumoral y mejoran efecto térmico HIFU al aumentar acumulación energía HIFU en área diana [13]. Además, microburbujas como núcleo cavitación exógeno reducen umbral cavitación tejido y mejoran efecto cavitación HIFU al pasar circulación sanguínea a tejido tumoral [14]. En años recientes, estudios indican terapia sonodinámica (SDT) puede mejorar sinérgicamente eficacia tratamiento HIFU [15,16]. Interacciones entre sonosensibilizadores y ultrasónido producen especies reactivas oxígeno (ROS), incluyendo oxígeno singlete y radicales hidroxilo, que matan células tumorales e inhiben crecimiento tumoral vía apoptosis y necrosis [17]. SDT ha progresado mucho en tratamiento tumoral no invasivo recientes. Permite reducir dosis fármaco y potencia irradiación HIFU vs monoterapias convencionales. Para aprovechar ventajas de ambos, este estudio combinó microburbujas y efecto sonodinámico para mejorar eficacia HIFU. Los sonosensibilizadores son parte importante SDT [18,19]. La mayoría sonosensibilizadores tradicionales estudiados derivan de fotosensibilizadores. N₂O es fotosensibilizador [20,21], produce sustancias tóxicas bajo irradiación luz ultravioleta. En este estudio, también se exploró inicialmente sonosensibilidad N₂O. Previamente hallamos que aplicación anestesia inhalatoria N₂O en operación HIFU agravó grado lesión tejido, incluyendo mayor grosor congestión abdominal y cutánea [22]. Uso combinado N₂O e HIFU jugó efecto sinérgico en lesión tejido. Pero, qué efecto biológico tiene N₂O en tratamiento HIFU no está claro. N₂O es gas molecular pequeño relativamente estable sin biotransformación ni especificidad tisular en células. Puede usarse ampliamente en tejidos sin efecto tóxico en cuerpo [23,24]. Perspectiva atractiva como sonosensibilizador. En este estudio, microburbujas nanoscópicas (N₂O-mbs) preparadas usando N₂O y C₃F₈ envueltos en lípidos. Dosis N₂O reducida y rango acción in vivo limitado efectivamente a área tejido tumoral. Se examinaron efecto sonodinámico N₂O y efecto sinérgico eficacia HIFU.

Materiales y Métodos

Materiales

1,2-dihexadecanoil-rac-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-mPEG2000) comprados Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EE. UU.). Glicerina y agarosa Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). N₂O y C₃F₈ Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (China). 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI), 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA), 3-amino,4-aminometil-2′,7′-difluoresceína, diacetato (DAF-FM DA) y CCK-8 Beyotime Biotechnology (Chongqing, China). Calceína-AM (CAM) y yoduro propidio (PI) Santa Cruz Biotechnology (TX, EE. UU.). Annexin V-FITC/PI Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, China). Sensor verde oxígeno singlete (SOSG) Invitrogen (NY, EE. UU.).

Preparación N₂O-mbs y C₃F₈-mbs

N₂O-mbs preparadas por método película rotatoria combinado con oscilación mecánica. DPPC y DSPE-PEG2000 como materiales cáscara, N₂O como núcleo. Brevemente: 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000 y 10 mL cloroformo vertidos simultáneamente matraz fondo redondo, mezclados y disueltos completamente por ondas ultrasónicas. Películas lipídicas formadas por evaporador rotatorio (60 min, 55°C, 100 rpm). Luego 2 mL glicerol 10% añadido para hidratar películas lipídicas y preparar suspensión. 500 μL añadidos a tubo cápsula. Tubo tapado con tapón goma. Aire en tubo reemplazado por N₂O y C₃F₈ mediante dispositivo desplazamiento gas. Suspensión oscilada mecánicamente por mezclador cápsula plata-mercurio (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., China) 150 s. Finalmente, suspensión resultante sometida a centrifugación diferencial para obtener N₂O-mbs objetivo: centrifugada 300 rpm 5 min, luego 800 rpm 5 min. N₂O-mbs resuspendidas en PBS, almacenadas 4°C para uso posterior.

C₃F₈-mbs fabricadas mismo método oscilación mecánica descrito previamente [25]. N₂O-mbs marcadas DiI preparadas añadiendo DiI durante formación película rotatoria. Cabe mencionar N₂O peso molecular bajo e inestable. N₂O en microburbuja se escapa fácilmente, reduciendo vida media. C₃F₈ gas inerte macromolecular usado ampliamente en estudio agentes contraste microburbujas ultrasónicas. C₃F₈ aumenta estabilidad microburbujas. Por tanto, en este estudio N₂O y C₃F₈ (2:1) mezclados como núcleo N₂O-mbs para aumentar estabilidad.

Fabricación y Detección Rendimiento N₂O-mbs

Morfología y distribución tamaño N₂O-mbs observadas microscopio óptico campo claro. Concentraciones N₂O-mbs y C₃F₈-mbs calculadas globulímetro según guías cálculo. Tamaño partícula promedio y potencial zeta N₂O-mbs determinados sistema dispersión luz láser dinámico (Malvern Instruments, Malvern, UK). Estructura y morfología N₂O-mbs caracterizadas microscopía electrónica transmisión (TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokio, Japón). N₂O-mbs preparadas almacenadas 4°C. Para observar estabilidad N₂O-mbs, morfología y concentración registradas días 1, 2, 3. Simultáneamente, tamaño partícula promedio y potencial zeta determinados.

Cultivo Celular y Modelo Animal

Células cáncer mama humano (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, China) pasadas en lab <3 meses tras resucitación. Células mantenidas incubadora 37°C 5% CO₂, DMEM 10% suero fetal bovino, 50 μg/L estreptomicina, 50 μg/L penicilina. Al 80% confluencia, usadas experimentos.

Experimentos animales según guías Comité Ética Animal Universidad Médica Chongqing. Cierto número ratones nu/nu hembra (4-6 semanas; 15-20 g) comprados Centro Experimentación Animal Universidad Médica Chongqing (Chongqing, China). Establecimiento tumor sólido: células MDA-MB-231 (1×10⁶ células/mL) suspendidas salina normal (100 μL) inyectadas subcutáneamente flanco derecho dorsal cada ratón. Ratones portadores tumor usados experimentos terapéuticos cuando volúmenes tumor ~150 mm³.

Captación Intracelular y Evaluación Biocompatibilidad N₂O-mb

Células MDA-MB-231 fase crecimiento sembradas densidad ~1×10⁵ células/frasco microscopía confocal láser (CLSM) 24 h. Luego 100 μL (1×10⁵ burbujas/mL) solución dilución N₂O-mbs DiI-marcadas medio completo añadida llenar plato confocal con medio. Plato sellado selladores microplacas, almacenado invertido incubadora, manteniendo N₂O-mbs en contacto células. Tras 2 h y 4 h co-incubación, células lavadas suavemente 3 veces PBS, fijadas 4% paraformaldehído (PFA) 20 min, teñidas DAPI 20 min. Finalmente, comportamiento direccionamiento celular N₂O-mbs observado CLSM (Nikon A1, Japón).

Citotoxicidad N₂O-mbs evaluada ensayo CCK-8 estándar. Células MDA-MB-231 sembradas placa 96 pozos (5×10⁴ células/pozo) 24 h. Luego 100 μL diferentes concentraciones (1×10⁴/mL, 1×10⁵/mL, 1×10⁶/mL) N₂O-mb añadidas. Tras 24 h incubación, solución CCK-8 (10 μL) añadida cada pozo. Células cultivadas 37°C 2 h más. Absorbancia cada pozo medida 450 nm lector microplacas Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, EE. UU.).

10 ratones nu/nu hembra sanos ~20 g divididos aleatoriamente dos grupos. Grupo N₂O-mbs (n=5) inyectados intravenosamente N₂O-mbs (200 μL, 1×10⁵/mL); grupo control (n=5) salina normal (200 μL). Tras 21 días, órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) todos ratones extirpados, teñidos hematoxilina-eosina (H&E).

Eficiencia SDT In Vitro N₂O-mbs

Método detección radicales oxígeno basado reporte previo [26]. Brevemente: 10 μL SOSG (500 μM) mezclados 2 mL solución muestra. Tratamientos agrupados: grupo C (control blanco), solo PBS; grupo N₂O-mbs, 100 μL N₂O-mbs (1×10⁵/mL) en 2 mL PBS; grupo C₃F₈-mbs, 100 μL C₃F₈-mbs (1×10⁵/mL) en 2 mL PBS; grupo LIFU, PBS irradiado ultrasónido (2 W/cm²; Instituto Imagen Ultrasónica Ciencias Médicas Chongqing, Chongqing, China) 100 s; grupo LIFU-N₂O-mbs, PBS con N₂O-mbs irradiado ultrasónido; grupo LIFU-C₃F₈-mbs, PBS con C₃F₈-mbs irradiado ultrasónido. Parámetros tratamiento experimental: 2 W/cm² y 100 s mediante análisis/comparación resultados experimentales y consulta literatura [27,28]. Parámetros ultrasónido tratamiento: frecuencia 650 kHz; distancia focal 12,5 mm; modo onda pulsada, ciclo trabajo 50%; duración pulso 1 s. Generación oxígeno singlete (¹O₂) determinada espectrometría fluorescencia (Cary Eclipse, Agilent Technologies) midiendo intensidad fluorescencia (λ excitación/λ emisión = 504 nm/525 nm). Selección intensidad/duración ultrasónido consistente experimentos células in vitro.

Tras detectar generación ROS extracelulares assay SOSG, producción ROS intracelular detectada kit assay ROS basado DCFH-DA. Células MDA-MB-231 sembradas densidad ~1×10⁵ células/frasco CLSM. Distribuidas aleatoriamente 6 grupos: control (sin tratamiento), solo N₂O-mbs (100 μL, 1×10⁵ burbujas/mL), solo C₃F₈-mbs (100 μL, 1×10⁵ burbujas/mL), solo LIFU (2 W/cm² 100 s), LIFU-C₃F₈-mbs, LIFU-N₂O-mbs. Tras incubación 24 h para adherencia celular, cada grupo sometido intervención experimental descrita. Luego misma cantidad DCFH-DA (30 μM) añadida plato correspondiente cada grupo, incubada 20 min oscuridad. Células enjuagadas suavemente 3 veces PBS remover sonda DCFH no entró célula. Finalmente, generación ROS intracelular determinada CLSM. Para verificar eficiencia SDT N₂O-mbs, células sembradas placas 6 pozos, cultivadas 24 h, distribuidas aleatoriamente 6 grupos como arriba. Tratamientos correspondientes realizados cada grupo. Células cada grupo digeridas, preparadas suspensiones celulares concentraciones apropiadas, colocadas plato CLSM. Finalmente, células escaneadas CLSM tras co-tinción tintes CAM/PI diferenciar muertas (rojo) y vivas (verde). Apoptosis detectada citometría flujo tinción Annexin V-FITC/PI. Tras 1 h tratamiento, cada grupo células centrifugadas, recolectadas. Tras co-tinción Annexin V-FITC/PI, detección citometría flujo (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Evaluación Efecto Sinérgico HIFU In Vitro N₂O-mbs en Células Cancerosas

Sistema HIFU (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, China) compuesto unidad ultrasónido diagnóstica, unidad ultrasónido terapéutica y sistema procesamiento central usado como descrito [29]. Parámetros HIFU tratamiento: frecuencia trabajo 0,94 MHz; distancia focal 140 mm; diámetro 220 mm; frecuencia transductor diagnóstico tiempo real 3,5 MHz. Transductores integrados sumergidos agua desgasificada. Evaluar efecto mejora N₂O-mbs tratamiento HIFU: células MDA-MB-231 centrifugadas, 5×10⁵/mL, distribuidas 4 grupos: control (sin tratamiento), solo HIFU (125 W, 5 s), solo HIFU-N₂O-mbs, solo HIFU-C₃F₈-mbs. Tratamientos respectivos realizados cada grupo. Células tratadas centrifugadas, lavadas PBS, doble tinción Annexin V-FITC/PI, recolectadas citometría flujo. Sonda NO DAF-FM usada detectar NO sobrenadante cada grupo tratamiento. Experimentos repetidos 3 veces. TEM identificar morfología ultraestructural células tratadas. Tras cada tratamiento, células fijadas inmediatamente 2% OsO₄, deshidratadas serie alcohol graduado, incluidas planas Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Secciones ultrafinas (100 nm) preparadas, teñidas acetato uranilo y citrato plomo, examinadas microscopio electrónico.

Efecto Sonodinámico Ex Vivo e In Vivo N₂O-mbs Mejora Eficacia Ablación HIFU

Tejidos hígado bovino frescos comprados matadero local, usados dentro 12 h post-sacrificio. Hígado bovino fresco ex vivo con poco tejido conectivo y menos vasos sanguíneos seccionado 10×5×5 cm, desgasificado 1 h 37°C. Hígados bovinos divididos 3 grupos: C₃F₈-mbs, N₂O-mbs, PBS. Primero, hígado bovino fresco colocado contenedor agua desaireada. Luego 200 μL (1×10⁵ burbujas/mL) microburbujas en PBS inyectado directamente hígado bovino manera Fig. 6a. Guiado transductor ultrasónido diagnóstico, punto focal HIFU posicionado sitio inyección. Transductor terapéutico usado realizar ablación 5 s diferentes potencias (100 W, 125 W, 150 W) sitio inyección hígado bovino. Finalmente, volumen necrótico coagulativo área diana tejido hígado bovino calculado según longitud, ancho, profundidad máximos medidos (mm) ecuación: V (mm³) = π/6 × largo × ancho × profundidad. Además, valor gris área diana antes/después ablación HIFU cada grupo registrado imágenes ultrasónido diagnóstico.

20 ratones portadores tumor divididos aleatoriamente 4 grupos (n=5): control (sin tratamiento), HIFU-PBS, HIFU-C₃F₈-mbs, HIFU-N₂O-mbs. Ablación HIFU (125 W, 5 s) tumor aplicada tras inyección intravenosa 200 μL C₃F₈-mbs, N₂O-mbs, PBS. Procedimiento ablación HIFU tumores sólidos similar hígado bovino ex vivo. Primero, ratones anestesiados pentobarbital 1% (8 mL/kg). Sitio tumor ratón inoculado contenedor agua desaireada. Guiado transductor ultrasónido diagnóstico, punto focal HIFU posicionado tejido tumoral. Pesos corporales y volúmenes tumor registrados intervalo 3 días. Finalmente, todos ratones sacrificados 21 días post-tratamiento, tejidos tumorales disecados, enviados para H&E, tinción antígeno nuclear proliferación celular (PCNA), terminal deoxynucleotidyl transferasa dUTP nick end labeling (TUNEL).

Análisis Estadístico

Datos presentados/analizados GraphPad Prism (v7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Datos media ± DE. Experimentos repetidos ≥3 veces. Análisis estadísticos ANOVA un sentido con post-test Bonferroni (comparando todos grupos) o Dunnett (comparando todos grupos vs control). p<0,05 diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

Caracterización N₂O-mbs

Preparación N₂O-mbs por método oscilación mecánica modificado resulta suspensión blanco lechoso altamente estable (Fig. 1a). N₂O-mbs no cambiaron significativamente tamaño partícula y morfología tras 72 h almacenamiento temperatura ambiente. Microscopio óptico: N₂O-mbs tamaño uniforme, buena dispersión, alta estabilidad (Fig. 1b). Concentración N₂O-mbs: 5,12±0,45×10⁸ burbujas/mL. Imágenes TEM (Fig. 1c): tamaño N₂O-mbs distribuido uniformemente, tamaño medio ~450 nm. Dispersión luz dinámica N₂O-mbs: diámetros hidrodinámicos 458,1±17,26 nm (índice polidispersidad=0,368; Fig. 1d), consistente TEM. Potencial N₂O-mbs: -16,2±0,35 mV (Fig. 1e) (Archivo adicional 1: Figura S1).

Captación Intracelular y Biocompatibilidad N₂O-mbs

Citotoxicidad N₂O-mbs células in vitro investigada método CCK-8. Viabilidad celular grupo control definida 100%. Tras 24 h incubación, resultados viabilidad mostraron sin citotoxicidad significativa células MDA-MB-231. Incluso altas concentraciones N₂O-mb, viabilidad >95% (Fig. 2a). Citotoxicidad N₂O-mbs in vivo ratones nu/nu sanos analizada. Fig. 2b: análisis histopatológico órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón) mostró N₂O-mbs no causaron daño tóxico significativo ratones. Resultados indican N₂O-mbs alta biocompatibilidad.

Captación intracelular N₂O-mbs tiempos incubación prolongados (2 h, 4 h) visualizada CLSM. Incubación células con N₂O-mbs DiI-marcadas resultó acumulación gran número N₂O-mbs en membrana y citoplasma células cancerosas. Fig. 2c: buena colocalización N₂O-mbs fluorescencia roja con células fluorescencia azul. Sugiere N₂O-mbs internalizadas eficientemente en células cáncer MDA-MB-231.

Efecto Sonodinámico N₂O-mbs In Vitro

SOSG sonda detección oxígeno singlete común, altamente sensible/confiable detección generación radicales libres oxígeno. Explorar potencial N₂O-mbs como sonosensibilizador, SOSG usado detectar ROS in vitro [30,31]. SOSG se combina ¹O₂ formando SOSG-EP, caracterizado por aumento intensidad fluorescencia. Fig. 3a: tras irradiación ultrasónica solución SOSG con N₂O-mbs, intensidad fluorescencia aumentó significativamente; vs resto grupos, producción radicales libres oxígeno aumentó significativamente (p<0,01).

Además detección ROS generación solución acuosa tras irradiación ultrasónica N₂O-mbs, kit assay ROS DCFH-DA usado determinar producción ROS intracelular N₂O-mbs. Fig. 3b: grupo control positivo demostró mayor intensidad fluorescencia. Siguiente señal fluorescencia verde fuerte apareció solo grupo LIFU-N₂O-mbs, revelando producción consecuente ROS en presencia simultánea N₂O-mbs e irradiación LIFU. Sin fluorescencia obvia grupos restantes (Fig. 3c). Viabilidad celular grupo control 100%. Resultados CCK-8: ~46% muerte celular grupo LIFU-N₂O-mbs (Fig. 3d). Citotoxicidad N₂O-mbs combinación LIFU evaluada observación CLSM muerte celular tras tratamiento. CAM teñió células vivas fluorescencia verde. PI teñió células muertas fluorescencia roja. Fig. 4a: muchas células muertas grupo LIFU-N₂O-mbs. Resultados citometría flujo: tasa apoptosis grupo MDA-MB-231 significativamente mayor que otros grupos (p<0,05) tras tratamiento combinado N₂O-mbs con LIFU (Fig. 4b). Tratamiento combinado C₃F₈-mbs con LIFU no causó muerte/apoptosis celular obvia. Resultados indicaron apoptosis y necrosis extensas respuesta SDT. Resultados citometría flujo consistentes CLSM. Indica N₂O-mbs combinadas con LIFU inducen apoptosis células tumorales in vitro (Archivo adicional 2: Figura S2; Archivo adicional 3: Figura S3).

Evaluación Efecto Sinérgico HIFU In Vitro en Células Cancerosas

Resultados citometría flujo Fig. 5a. Tanto N₂O-mbs como C₃F₈-mbs aumentaron mortalidad células MDA-MB-231 tras ablación HIFU. Además, vs HIFU-C₃F₈-mbs, N₂O-mbs aumentaron significativamente apoptosis MDA-MB-231 (p<0,05; Fig. 5b). Resultados test NO: intensidad fluorescencia sobrenadante grupo HIFU-N₂O-mbs significativamente mayor que grupos restantes (p<0,05) (Fig. 5c). Cambios citoplasma y orgánulos observados TEM (Fig. 5d). Célula grupo control (sin tratamiento) morfología completa. Grandes cantidades sustancias vacuolares citoplasma célula grupo HIFU. Pero células aún tienen membranas celular y nuclear completas. Sin embargo, ambos grupos HIFU-N₂O-mbs e HIFU-C₃F₈-mbs mostraron pérdida integridad membrana celular y desintegración completa estructura celular. Cabe mencionar observaciones TEM solo momento proceso muerte/apoptosis celular tras tratamiento cada grupo. N₂O-mbs como microburbujas exógenas tienen efecto sinérgico obvio tratamiento HIFU. Grupo HIFU-N₂O-mbs, efecto sonodinámico N₂O-mbs promueve más apoptosis celular. Resultados validados tanto detección citometría flujo como experimento in vivo (Archivo adicional 4: Figura S4; Archivo adicional 5: Figura S5).

N₂O-mbs como Sinergista Terapia HIFU

Tras ablación HIFU hígado bovino aislado, región necrótica coagulativa gris-blanca apareció área diana (Fig. 6b). Cambios promedio intensidad eco área diana antes/después HIFU Fig. 6c. Vs grupo PBS, valores intensidad eco diana grupos C₃F₈-mbs y N₂O-mbs aumentaron significativamente tras tratamiento HIFU (p<0,05) y aumentaron al incrementar intensidad ablación HIFU. Volumen necrótico coagulativo últimos dos grupos e intensidad eco imágenes ecográficas modo B área diana ambos aumentaron al incrementar potencia HIFU (Fig. 6d,e).

Efecto sinérgico N₂O-mbs terapia HIFU verificado in vivo. Fig. 7a: fotos digitales ratones y tejido tumoral correspondiente registradas 21 días tras diferentes tratamientos. Crecimiento tumoral inhibido más eficazmente tras N₂O-mbs combinado con HIFU. Efecto sinérgico N₂O-mbs tratamiento HIFU también evaluado tinciones H&E, PCNA, TUNEL (Fig. 7b), demostrando N₂O-mbs combinado con irradiación HIFU causa mayor escala necrosis células tumorales vs HIFU-C₃F₈-mbs. Cambios morfología celular exhibidos HIFU-N₂O-mbs más obvios otros grupos, incluyendo cariopícnosis, cariorrexis, cariolisis, indicando necrosis sustancial células cancerosas.

Además, volumen tumor HIFU-N₂O-mbs mostró tendencia inhibición más significativa que HIFU-C₃F₈-mbs dentro 21 días (Fig. 7c,d).

Discusión

HIFU, nuevo método oncoterapia, reconocido clínicamente, progreso notable tratamiento muchos tumores sólidos [32]. Efecto térmico, cavitación, mecánico, acústico-químico juegan roles significativos matando células tumorales y causando daño irreversible tejido área diana durante ablación HIFU [33]. HIFU impacto limitado tejidos normales circundantes, esencialmente tratamiento tumoral no invasivo. Sin embargo, energía ultrasónido atenuada por mayor distancia transmisión, absorción flujo sanguíneo área diana, bloqueo huesos/gas cuerpo durante tratamiento HIFU, reduciendo energía transferida área diana. Prolongar tiempo ablación y aumentar potencia aumenta riesgo daño tejido normal: quemaduras cutáneas, daño neurovascular, otras complicaciones [34]. Por tanto, necesario aumentar eficacia HIFU. Muchos estudios confirmaron tanto microburbujas como SDT mejoran eficacia HIFU [15,16,35]. N₂O-mbs preparadas en este estudio tienen menor tamaño partícula, pero características similares agentes contraste microburbujas ultrasónicas. Estudios muestran nano/microburbujas misma capacidad imagen microburbujas in vitro, pero mayor capacidad in vivo [36]. Así, N₂O-mbs no solo podrían usarse guía/localización ultrasónido para tratamiento HIFU, sino también como microburbujas exógenas mejorar eficacia HIFU (Archivo adicional 6: Figura S6). Simultáneamente, efecto sonodinámico N₂O-mbs podría mejorar eficazmente eficacia HIFU. Generación ROS tras excitación ultrasónica uno factores más importantes sonosensibilizadores [16]. Verificar sonosensibilidad N₂O-mbs, producción ROS ambos entornos extracelular e intracelular detectada este estudio. Resultado consistente ambas pruebas mostró N₂O-mbs generan ROS tanto solución acuosa como intracelularmente. Estudios también mostraron gases (N₂, O₂) atrapados núcleos cavitación en solución pueden sufrir reacciones escisión produciendo radicales N y O libres [37,38]:

N₂O → N₂ + O₂; O₂ → 2•O; N₂ → 2N· + HO· → NO + H·; NO + HO· → HNO

Efecto cavitación y ventaja empaquetado microburbuja reducen dificultad reacción N₂O [39]. Al incubar con células, N₂O-mbs exhiben buena biocompatibilidad. Alta selectividad, afinidad, carga fármaco nanopartículas [40], así como fagocitosis activa células, promueven unión eficiente N₂O-mbs a células cancerosas. Nanoburbujas muestran mayor penetración, estabilidad, facilidad entrada/agregación alrededor células [36]. Además, efecto sonoporación ultrasónido promueve eficazmente transferencia microburbujas a células [41].

En contraste microburbuja agente contraste tradicional C₃F₈-mbs, N₂O-mbs tienen mayor efecto inhibitorio crecimiento celular tras irradiación ultrasónica, caracterizado por ROS intracelulares aumentados, viabilidad celular disminuida, apoptosis y necrosis. Resultados sugieren preliminarmente efecto tóxico sonodinámico N₂O-mbs.

Experimento sinergia HIFU: parámetros tratamiento grupo experimental 125 W 5 s analizando/comparando resultados experimentales y consultando literatura, validando baja potencia HIFU induce ablación suficiente y reduce efectos adversos. Resultados: N₂O-mbs aumentaron necrosis y apoptosis avanzada más células tumorales. N₂O-mbs actuaron como sinergista nanoscópico microburbuja y su efecto sonodinámico respuesta HIFU puede ser razón diferentes resultados experimentales. Como microburbuja, N₂O-mbs aumentaron deposición energía HIFU área diana, aumentaron temperatura área diana, mejoraron efecto térmico HIFU [11]. Generación efecto cavitación estrechamente relacionada umbral cavitación y concentración núcleo cavitación [42]. N₂O-mbs fueron núcleo cavitación que reducen umbral cavitación HIFU y facilitan efecto cavitación. Por tanto, N₂O-mbs promovieron eficazmente necrosis celular. Como sinergista nanoscópico microburbuja, N₂O-mbs lisan y generan radicales libres y óxido nítrico respuesta ultrasónido. Estudios confirman ROS factores importantes inducción apoptosis [43]. Cabe notar muchos radicales libres causan daño celular. Además generación radicales oxígeno, N₂O puede generar otros radicales en reacciones escisión, como radicales nitrógeno, contribuyen muerte células tumorales. Pequeña cantidad óxido nítrico (NO) detectada sobrenadante celular tras tratamiento HIFU, indicando reacción escisión N₂O ocurrió. An et al. [44] reportaron NO puede tener función antitumoral, mecanismo implica NO atacando enzimas hierro sospechosas causan fallo crecimiento/división celular cuando atrapadas. Además, NO inestable interactúa moléculas oxígeno formar radicales hidroxilo (HO·) y NO₂. Radicales hidroxilo extremadamente citotóxicos promueven apoptosis células tumorales. NO también factor relajante derivado endotelio. Generación NO puede ser razón hiperemia e hinchazón anormal pacientes durante operación HIFU. Experimento hígado bovino ex vivo: comparamos cuidadosamente intensidad eco imágenes ecográficas modo B, cambios patológicos y volumen necrótico coagulativo área diana tras ablación HIFU con N₂O-mbs, C₃F₈-mbs, PBS. Todos resultados consistentes. Vs PBS, N₂O-mbs mejoraron eficazmente efecto ablación HIFU. Este efecto sinérgico mejor demostrado ablación tumor sólido in vivo, manifestado por apoptosis células tumorales aumentada, volumen tumor reducido, inhibición crecimiento tumoral. Hallazgo indica N₂O-mbs pueden ser nuevo agente auxiliar ultrasónico para promover ablación térmica tumoral HIFU. Efecto sinérgico N₂O-mbs en HIFU y mecanismo sinérgico proveen nuevas ideas y práctica teórica investigación sinergistas HIFU. Pero otros mecanismos relacionados sinergia deben explorarse más. Efecto ablación tumoral HIFU combinado N₂O-mbs debe abordarse más.

Conclusión

En resumen, desarrollamos nanopartículas N₂O-mb. Caracterización y biocompatibilidad N₂O-mbs determinadas. Sonosensibilidad N₂O-mbs examinada detectando producción ROS solución acuosa e intracelularmente. Vs C₃F₈-mbs, N₂O-mbs generaron ROS y promovieron apoptosis/necrosis células tumorales, exhibiendo extraordinaria sonosensibilidad. Experimentos sinergia HIFU: efectos sonodinámicos N₂O-mbs aumentaron significativamente apoptosis/necrosis células tumorales in vitro, aumentaron volumen necrótico coagulativo e intensidad eco área diana hígado bovino aislado ex vivo, inhibieron eficazmente crecimiento tumoral in vivo. Resultados sugieren N₂O-mbs podrían ser nuevo tipo sonosensibilizador y nuevo agente auxiliar terapia ultrasónica para ablación tumores HIFU.

Disponibilidad Datos y Materiales

Conclusiones manuscrito basadas en datos todos presentados y mostrados en este artículo.

Abreviaturas

N₂O-mbs:

Microburbujas N₂O

C₃F₈-mbs:

Microburbujas C₃F₈

HIFU:

Ultrasonografía focalizada de alta intensidad

LIFU:

Ultrasonografía focalizada de baja intensidad

SOSG:

Sensor verde oxígeno singlete

SDT:

Terapia sonodinámica

DPPC:

1,2-dihexadecanoil-rac-glicero-3-fosfocolina

DSPE-mPEG2000:

1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]

DAPI:

4′,6-diamidino-2-fenilindol

DiI:

1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindocarbocianina perclorato

DCFH-DA:

2′,7′-diclorofluoresceína diacetato

DAF-FM:

3-amino,4-aminometil-2′,7′-difluoresceína, diacetato

CAM:

Calceína-AM

CCK-8:

Kit Conteo Celular-8

CLSM:

Microscopía confocal láser

TEM:

Microscopio electrónico transmisión

DMEM:

Medio Dulbecco modificado Eagle

FBS:

Suero fetal bovino

PBS:

Salina fosfatada tamponada

DI:

Agua desionizada

ROI:

Regiones de interés

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

NO:

Óxido nítrico