El estudio de la terapia de ultrasonido enfocada de alta intensidad mejorada mediante microburbujas de N2O sonodinámicas

Materiales y métodos

Materiales

1,2-dihexadecanoil-rac-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- N - [metoxi (polietilenglicol) -2000] (DSPE-mPEG2000) se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EE.UU.). La glicerina y la agarosa se obtuvieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). N ₂ O y C ₃ F ₈ se adquirieron de Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (China). Perclorato de 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), 1,1′-dioctadecil-3,3,3 ′, 3′-tetrametilindocarbocianina (DiI), diacetato de 2 ′, 7′-diclorofluorescina (DCFH-DA) , 3-amino, 4-aminometil-2 ', 7'-difluoresceína, diacetato (DAF-FM DA) y CCK-8 se adquirieron de Beyotime Biotechnology (Chongqing, China). La calceína-AM (CAM) y el yoduro de propidio (PI) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (TX, EE. UU.). La anexina V-FITC / PI se obtuvo de Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, China). El sensor de oxígeno singlete verde (SOSG) se compró a Invitrogen (NY, EE. UU.).

Preparación de N ₂ O-mbs y C ₃ F ₈ -mbs

N ₂ Se prepararon O-mbs mediante la película giratoria combinada con el método de oscilación mecánica. Tomamos DPPC y DSPE-PEG2000 como materiales de carcasa y N ₂ O como núcleo. Brevemente, se vertieron simultáneamente 5 mg de DPPC, 2 mg de DSPE-PEG2000 y 10 ml de cloroformo en un matraz de fondo redondo, se mezclaron y se disolvieron completamente mediante ondas ultrasónicas. Luego, las películas de lípidos se formaron mediante un evaporador rotatorio (60 min, 55 ° C, 100 r / min). A continuación, se agregaron 2 mL de glicerol al 10% para hidratar las películas lipídicas y preparar una suspensión. 500 μL de los cuales se agregaron a un tubo de cápsula. El tubo de la cápsula se tapó con una tapa de goma. El aire en el tubo se reemplazó con N ₂ O y C ₃ F ₈ por un dispositivo de desplazamiento de gas. Luego, la suspensión se hizo oscilar mecánicamente mediante un mezclador de cápsulas de plata y mercurio (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., China) durante 150 s. Finalmente, la suspensión resultante se sometió a centrifugación diferencial para obtener el N ₂ objetivo O-mbs, y se centrifugó a 300 rpm durante 5 min, y luego se centrifugó a 800 rpm durante 5 min. N ₂ Se resuspendieron O-mbs en PBS y luego se almacenaron a 4 ° C para su uso posterior.

El C ₃ F ₈ -mbs se fabricaron utilizando el mismo método de oscilación mecánica, como se describió anteriormente [25]. N ₂ con etiqueta DiI Se pueden preparar O-mbs añadiendo DiI durante la formación de la película de centrifugado. Vale la pena mencionar que N ₂ O tiene un peso molecular bajo y es inestable. El N ₂ O en la microburbuja se desborda fácilmente. Por tanto, se reduce la vida media de las microburbujas. C ₃ F ₈ es un gas inerte macromolecular que se usa ampliamente en el estudio de agentes de contraste de microburbujas ultrasónicas. C ₃ F ₈ Puede aumentar la estabilidad de las microburbujas. Por lo tanto, en este estudio, N ₂ O y C ₃ F ₈ (2:1) se mezclaron como N ₂ Núcleo O-mbs para aumentar su estabilidad.

Fabricación y detección de rendimiento de N ₂ O-mbs

La morfología y distribución de tamaño de N ₂ Se observaron O-mbs bajo microscopía óptica de campo brillante. Las concentraciones de N ₂ O-mbs y C ₃ F ₈ -mbs se calcularon mediante globulímetro de acuerdo con las pautas de cálculo. El tamaño de partícula promedio y el potencial zeta del N ₂ Las O-mbs se determinaron mediante un sistema dinámico de dispersión de luz láser (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). La estructura y morfología del N ₂ Las O-mbs se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokio, Japón). El N ₂ preparado Se almacenaron O-mbs a 4 ° C. Para observar la estabilidad de N ₂ O-mbs, la morfología y la concentración se registraron en el primer, segundo y tercer día. Al mismo tiempo, se determinó el tamaño medio de partícula y el potencial zeta de las microburbujas.

Cultivo celular y modelo animal

Las células de cáncer de mama humano (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, China) se sometieron a pases en el laboratorio durante menos de 3 meses después de la reanimación. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO ₂ , utilizando DMEM que contiene suero bovino fetal al 10%, estreptomicina 50 μg / L y penicilina 50 μg / L. Cuando las células alcanzaron el 80% de confluencia, se utilizaron para el experimento.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Chongqing. Un cierto número de ratones desnudos hembras (de 4 a 6 semanas de edad; peso de 15 a 20 g) se adquirieron en el Centro de Experimentación Animal de la Universidad Médica de Chongqing (Chongqing, China). Para el establecimiento de un tumor sólido, las células MDA-MB-231 (1 × 10 ⁶ células / ml) suspendidas en solución salina normal (100 μl) se inyectaron por vía subcutánea en el costado posterior derecho de cada ratón. Todos los ratones portadores de tumores se utilizaron para experimentos terapéuticos cuando los volúmenes tumorales alcanzaron alrededor de 150 mm ³ .

Evaluación de biocompatibilidad y absorción intracelular de N ₂ O-mb

Las células MDA-MB-231 en la fase de crecimiento se sembraron a una densidad de aproximadamente 1 × 10 ⁵ células por matraz de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) durante 24 h. A continuación, 100 μL (1 × 10 ⁵ burbujas / ml) de N ₂ marcado con DiI Se añadió una solución de dilución media completa de O-mbs para llenar la placa confocal con medio. El plato se selló con selladores de microplacas y se almacenó invertido en una incubadora, manteniendo el N ₂ O-mbs en contacto con las células. Después de 2 hy 4 h de co-incubación, las células se lavaron suavemente 3 veces con PBS, se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 min y se tiñeron con DAPI durante 20 min. Finalmente, el comportamiento de focalización celular de N ₂ CLSM (Nikon A1, Japón) observó O-mbs.

La citotoxicidad de N ₂ Se evaluó O-mbs mediante un ensayo CCK-8 estándar. Se sembraron células MDA-MB-231 en una placa de 96 pocillos (5 × 10 ⁴ células / pocillo) durante 24 h. A continuación, 100 μL de diferentes concentraciones (1 × 10 ⁴ / ml, 1 × 10 ⁵ / mL y 1 × 10 ⁶ / mL) de N ₂ Se agregaron O-mb. Después de 24 h de incubación, se añadió solución de CCK-8 (10 μL) a cada pocillo. Luego, las células MDA-MB-231 se cultivaron a 37 ° C durante otras 2 h. Finalmente, se midió la absorbancia de cada pocillo a 450 nm con un lector de microplacas Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, EE. UU.).

Diez ratones desnudos hembra sanos que pesaban aproximadamente 20 g se dividieron en dos grupos al azar. El N ₂ O-mbs ( n =5) grupo se inyectó por vía intravenosa con N ₂ O-mbs (200 μL, 1 × 10 ⁵ / mL) y el grupo de control ( n =5) inyectados con solución salina normal (200 μL). Después de 21 días, los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) de todos los ratones fueron extirpados y teñidos con hematoxilina-eosina (H&E).

Eficiencia in vitro SDT de N ₂ O-mbs

El método para la detección de radicales de oxígeno se basó en un informe anterior [26]. Brevemente, se mezclaron 10 μL de SOSG (500 μM) con 2 mL de la solución de muestra. Los tratamientos se agruparon de la siguiente manera:grupo C (el grupo de control en blanco), se añadió PBS solo; N ₂ Grupo O-mbs, 100 μL de N ₂ O-mbs (1 × 10 ⁵ / mL) en 2 mL de solución de PBS; C ₃ F ₈ -grupo mbs, 100 μL de C ₃ F ₈ -mbs (1 × 10 ⁵ / mL) en 2 mL de solución de PBS; Grupo LIFU, PBS fue irradiado por ultrasonido (2 W / cm ² ; Instituto de Imágenes por Ultrasonido de Ciencias Médicas de Chongqing, Chongqing, China) durante 100 s; LIFU – N ₂ Grupo O-mbs, PBS con N ₂ agregado O-mbs se irradió con ultrasonidos; LIFU – C ₃ F ₈ -grupo mbs, PBS con C ₃ agregado F ₈ -mbs se irradió con ultrasonido. Los parámetros de tratamiento del grupo experimental se establecieron como 2 W / cm ² y 100 sa través del análisis y comparación de los resultados experimentales y la consulta de la literatura [27, 28]. Los parámetros de ultrasonido empleados para fines de tratamiento se establecieron de la siguiente manera:frecuencia, 650 kHz; longitud focal, 12,5 mm; modo de onda de pulso, ciclo de trabajo del 50%; y duración del pulso, 1 s. La generación de oxígeno singlete ( ¹ O ₂ ) se determinó mediante espectrometría de fluorescencia (Cary Eclipse, Agilent Technologies) midiendo la intensidad de fluorescencia ( λ excitación / λ emisión =504 nm / 525 nm). La selección de la intensidad y duración del ultrasonido fue consistente con los experimentos celulares in vitro.

Después de que se detectó la generación de especies reactivas de oxígeno extracelulares (ROS) utilizando el ensayo SOSG, se detectó la producción de ROS intracelulares mediante un kit de ensayo ROS basado en DCFH-DA. Las células MDA-MB-231 se sembraron a una densidad de aproximadamente 1 × 10 ⁵ células por matraz CLSM. Luego, se distribuyeron aleatoriamente en seis grupos:el grupo de control (sin tratamiento), el N ₂ Solo grupo de O-mbs (100 μL, 1 × 10 ⁵ burbujas / mL), el C ₃ F ₈ -grupo solo mbs (100 μL, 1 × 10 ⁵ burbujas / ml), el grupo solo LIFU (2 W / cm ² durante 100 s), el LIFU – C ₃ F ₈ -grupo mbs, el LIFU – N ₂ Grupo O-mbs. Después de la incubación durante 24 h para permitir la unión de las células, cada grupo se sometió a la correspondiente intervención experimental descrita anteriormente. Luego, se agregó la misma cantidad de DCFH-DA (30 μM) al plato correspondiente en cada grupo, y el plato se incubó durante 20 min en la oscuridad. A continuación, las células se enjuagaron suavemente 3 veces con PBS para eliminar la sonda DCFH que no entró en la célula. Finalmente, la generación de ROS intracelulares fue determinada por CLSM. Para verificar aún más la eficiencia SDT de N ₂ Las células O-mbs se sembraron en placas de 6 pocillos, se cultivaron durante 24 horas y se distribuyeron aleatoriamente en seis grupos, como se describió anteriormente. Luego, se realizaron los tratamientos correspondientes en cada grupo. Las células de cada grupo se digirieron y se prepararon en suspensiones celulares a concentraciones apropiadas y se colocaron en una placa CLSM. Finalmente, las células fueron escaneadas por CLSM después de la tinción conjunta con colorantes CAM y PI para diferenciar las células muertas (rojo) y vivas (verde). La apoptosis se detectó mediante citometría de flujo y tinción con anexina V-FITC / PI. Después de 1 h de tratamiento, se centrifugó cada grupo de células y se recogieron las células. Después de la tinción conjunta de Anexina V-FITC / PI, se realizó la detección por citometría de flujo (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Efecto sonodinámico in vitro de N ₂ O-mbs mejora la eficacia del tratamiento HIFU

Se utilizó un sistema HIFU (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, China) compuesto por una unidad de ultrasonido de diagnóstico, una unidad de ultrasonido terapéutico y un sistema de procesamiento central como se describió anteriormente [29]. Los parámetros HIFU empleados para fines de tratamiento se establecieron de la siguiente manera:frecuencia de trabajo, 0,94 MHz; longitud focal, 140 mm; diámetro, 220 mm; y frecuencia del transductor de diagnóstico en tiempo real, 3,5 MH. Los transductores integrados se sumergieron en agua desgasificada. Para evaluar el efecto de mejora de N ₂ O-mbs en el tratamiento con HIFU, las células MDA-MB-231 se centrifugaron, 5 × 10 ⁵ / mL, y distribuidos en cuatro grupos:el grupo de control (sin tratamiento), el grupo solo HIFU (125 W, 5 s), el grupo HIFU – N ₂ Solo grupo O-mbs, el HIFU – C ₃ F ₈ -sólo grupo mbs. A continuación, se realizaron los diferentes tratamientos respectivos para cada grupo. Las células tratadas se centrifugaron y lavaron con PBS, se tiñeron dos veces con Anexina V-FITC / PI y se recolectaron para citometría de flujo. Se utilizó la sonda de óxido nítrico (NO) DAF-FM para detectar NO en el sobrenadante de cada grupo de tratamiento. Todos los experimentos se llevaron a cabo 3 veces. Se utilizó TEM para identificar la morfología ultraestructural de las células tratadas. Después de cada tratamiento, las células tratadas se fijaron inmediatamente con 2% de OsO ₄ , deshidratado en una serie graduada de alcohol e incrustado de manera plana en Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Se prepararon secciones ultrafinas (100 nm), se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron con un microscopio electrónico.

Efecto sonodinámico ex vivo e in vivo de N ₂ O-mbs mejora la eficacia de la ablación de HIFU

Se adquirieron tejidos frescos de hígado de bovino en un matadero local y se utilizaron dentro de las 12 h posteriores al sacrificio. Se cortó hígado bovino fresco ex vivo con poco tejido conectivo y menos vasos sanguíneos en secciones de 10 cm x 5 cm x 5 cm y se desgasificó durante 1 ha 37 ° C. Los hígados de bovino se dividieron en tres grupos:C ₃ F ₈ -grupo mbs, N ₂ Grupo O-mbs y grupo PBS. En primer lugar, se colocó hígado bovino recién aislado en un recipiente que contenía agua desaireada. Luego, 200 μL (1 × 10 ⁵ burbujas / ml) de microburbujas en PBS se inyectó directamente en el hígado bovino de la manera que se muestra en la Fig. 6a. Bajo la guía de un transductor de ultrasonido de diagnóstico, se colocó el punto focal HIFU en el lugar de la inyección. Luego, el transductor terapéutico se utilizó para realizar 5 s de ablación a diferentes potencias (100 W, 125 W, 150 W) en el sitio de inyección del hígado bovino. Finalmente, el volumen necrótico coagulativo del área objetivo en el tejido del hígado bovino se calculó de acuerdo con la longitud, el ancho y la profundidad máximos medidos (mm) mediante la siguiente ecuación: V (mm ³ ) =π / 6 × largo × ancho × profundidad. Además, el valor gris del área objetivo antes y después de la ablación con HIFU en cada grupo se registró en las imágenes de ultrasonido de diagnóstico.

Veinte ratones portadores de tumores se dividieron al azar en cuatro grupos ( n =5 por grupo), incluido un grupo de control (sin ningún tratamiento), un grupo HIFU-PBS, un HIFU-C ₃ F ₈ -grupo mbs y un HIFU – N ₂ Grupo O-mbs. Se aplicó la ablación del tumor con HIFU (125 W, 5 s) después de que los ratones recibieron una inyección intravenosa de 200 μL de C ₃ F ₈ -grupo mbs, N ₂ O-mbs y PBS. El procedimiento de ablación con HIFU de tumores sólidos fue similar al del hígado bovino aislado ex vivo. En primer lugar, se anestesió a los ratones con pentobarbital al 1% (8 ml / kg). El sitio del tumor del ratón se inoculó en un recipiente que contenía agua desaireada. Bajo la guía de un transductor de ultrasonido de diagnóstico, se colocó el punto focal HIFU en el tejido tumoral. Los pesos corporales de los ratones y el volumen del tumor se registraron con un intervalo de 3 días. Finalmente, todos los ratones se sacrificaron 21 días después del tratamiento y los tejidos tumorales se disecaron de los ratones y luego se enviaron para H&E, tinción de antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), marcaje terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP nick final (TUNEL).

Análisis estadístico

Todos los datos se presentaron y analizaron con GraphPad Prism (versión 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Los datos se expresan como la media ± DE. Cada experimento se repitió al menos 3 veces. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA unidireccional con posprueba de Bonferroni (comparando todos los grupos) o posprueba de Dunnett (comparando todos los grupos con un grupo de control). Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización de N ₂ O-mbs

La preparación de N ₂ O-mbs por el método de oscilación mecánica modificada da como resultado una suspensión blanca lechosa altamente estable (Fig. 1a). El N ₂ O-mbs no cambió significativamente en el tamaño de partícula y la morfología después de 72 h de almacenamiento a temperatura ambiente. Bajo el microscopio óptico, N ₂ Se observaron O-mbs con tamaño uniforme, buena dispersión y alta estabilidad (Fig. 1b). La concentración de N ₂ O-mbs fue de 5,12 ± 0,45 × 10 ⁸ burbujas / mL. Como se muestra en las imágenes TEM (Fig. 1c), el tamaño de N ₂ O-mbs se distribuyó uniformemente y el tamaño medio fue de aproximadamente 450 nm. El N ₂ Los resultados de la dispersión de luz dinámica de O-mb revelaron diámetros hidrodinámicos de 458,1 ± 17,26 nm (índice de polidispersidad =0,368; Fig. 1d), lo que fue consistente con los resultados de TEM. El potencial del N ₂ O-mbs fue - 16,2 ± 0,35 mV (Fig. 1e) (Archivo adicional 1:Figura S1).

un Fotografías de N ₂ O-mbs dispersos en agua desionizada; b imagen de N ₂ O-mbs bajo microscopía óptica de campo claro; c imagen de microscopio electrónico de transmisión de N ₂ O-mbs; d distribución de tamaño de N ₂ O-mbs; e potencial zeta aparente de N ₂ O-mbs

Captación intracelular y biocompatibilidad de N ₂ O-mbs

La citotoxicidad de N ₂ Se investigó O-mbs contra células in vitro mediante el método CCK-8. Definimos la viabilidad celular del grupo de control como 100%. Después de 24 h de incubación, los resultados de viabilidad celular no mostraron citotoxicidad significativa para las células MDA-MB-231. Incluso con N ₂ altos Con concentraciones de O-mb, la viabilidad celular se mantuvo superior al 95% (Fig. 2a). La citotoxicidad de N ₂ Se analizó O-mbs in vivo en ratones desnudos sanos. Como se muestra en la Fig. 2b, el análisis histopatológico de los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) mostró que N ₂ O-mbs no causó daños tóxicos significativos a los ratones. Estos resultados indicaron que N ₂ Las O-mbs tienen una alta biocompatibilidad.

un La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo CCK-8; b Tinción H&E de los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) en ratones desnudos hembras sanas con o sin recibir N ₂ O-mbs; c las imágenes de a a d mostrar célula en campo brillante, núcleos celulares teñidos por DAPI, N ₂ O-mbs teñido por DiI, y los resultados combinados de las tres imágenes de fluorescencia; barra de escala =50 μm [ NS sin importancia, en comparación con el grupo de control (0 burbujas / ml)]

La captación intracelular de N ₂ Se visualizó O-mbs durante tiempos de incubación prolongados (2 hy 4 h) mediante CLSM. La incubación de células con N ₂ marcado con DiI O-mbs resultó en la acumulación de una gran cantidad de N ₂ O-mbs en la membrana y el citoplasma de las células cancerosas. Como se muestra en la Fig. 2c, hubo una buena colocalización de N ₂ fluorescente rojo O-mbs con las células fluorescentes azules. Este hallazgo sugiere que N ₂ Las O-mbs se internalizan de manera eficiente en las células cancerosas MDA-MB-231.

Efecto sonodinámico de N ₂ O-mbs in vitro

SOSG es una sonda de detección de oxígeno singlete de uso común que es altamente sensible y confiable para la detección de la generación de radicales libres de oxígeno. Para explorar el potencial de N ₂ O-mbs como sonosensibilizador, SOSG se utilizó para detectar la generación de ROS in vitro [30, 31]. SOSG se combina con ¹ O ₂ para formar SOSG-EP, que se caracteriza por un aumento en la intensidad de la fluorescencia. Como se muestra en la Fig. 3a, después de la irradiación ultrasónica de una solución SOSG que contiene N ₂ O-mbs, el valor de la intensidad de la fluorescencia aumentó significativamente; en comparación con el resto de los grupos, la producción de radicales libres de oxígeno aumentó significativamente ( p <0.01).

un Espectro de fluorescencia de SOSG con N ₂ O-mbs irradiados por LIFU; b la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo CCK8; c imágenes confocales de generación de ROS intracelulares (la fluorescencia verde indica tinción positiva para ROS teñidos con DCFH-DA); d el valor de intensidad de fluorescencia promedio (DCFH-DA) de cada grupo calculado por la Imagen J. (Los datos se muestran como media ± SD, n =5 por grupo, * p <0.05, en comparación con LIFU – C ₃ F ₈ -grupo mbs)

Además de la detección de la generación de ROS en solución acuosa después de la irradiación ultrasónica de N ₂ O-mbs, se utilizó un kit de ensayo DCFH-DA ROS para determinar la producción intracelular de ROS por N ₂ O-mbs. Como se muestra en la Fig. 3b, el grupo de control positivo demostró la intensidad de fluorescencia más fuerte. La siguiente señal de fluorescencia verde más fuerte apareció solo en LIFU – N ₂ Grupo O-mbs, que revela la consecuente producción de ROS en presencia simultánea de N ₂ Irradiación de O-mbs y LIFU. Sin embargo, no se detectó fluorescencia obvia en ninguno de los grupos restantes (Fig. 3c). La viabilidad celular del grupo de control se definió como 100%. Los resultados del ensayo CCK-8 mostraron aproximadamente un 46% de muerte celular en LIFU – N ₂ Grupo O-mbs (Fig. 3d). La citotoxicidad de N ₂ Se evaluó O-mbs en combinación con LIFU mediante observación CLSM de la muerte celular después del tratamiento. Se utilizó CAM para teñir células vivas con fluorescencia verde. Se usó PI para teñir las células muertas con fluorescencia roja. Como se muestra en la Fig. 4a, había muchas células muertas en el LIFU-N ₂ Grupo O-mbs. Además, los resultados de la citometría de flujo mostraron que la tasa de apoptosis del grupo de células MDA-MB-231 era significativamente mayor que la de otros grupos ( p <0.05) después del N ₂ combinado O-mbs con tratamiento LIFU (Fig. 4b). El C ₃ combinado F ₈ -mbs con tratamiento con LIFU no causó muerte celular ni apoptosis obvia. Los resultados indicaron además que se produjo una extensa apoptosis y necrosis en respuesta a SDT. Los resultados de la citometría de flujo fueron consistentes con los del CLSM. Estos resultados indican que N ₂ O-mbs combinado con LIFU inducen la apoptosis de las células tumorales in vitro (archivo adicional 2:figura S2; archivo adicional 3:figura S3).

un Análisis de citometría de flujo de apoptosis y necrosis de células tumorales; b imágenes confocales de células MDA-MB-231 co-teñidas con CAM / PI después de varios tratamientos. Las barras de escala son 100 μm

Evaluación del efecto sinérgico de HIFU in vitro en células cancerosas

Los resultados de la citometría de flujo se muestran en la Fig. 5a. Ambos N ₂ O-mbs y C ₃ F ₈ -mbs aumentó la mortalidad de las células MDA-MB-231 después de la ablación con HIFU. Además, en comparación con HIFU-C ₃ F ₈ -mbs, N ₂ O-mbs aumentó significativamente la apoptosis de MDA-MB-231 ( p <0,05; Figura 5b). Los resultados de la prueba de NO mostraron que la intensidad de fluorescencia del sobrenadante de HIFU – N ₂ El grupo O-mbs también fue significativamente más alto que el de los grupos restantes ( p <0,05) (figura 5c). Los cambios en el citoplasma y los orgánulos se observaron mediante TEM (Fig. 5d). La célula del grupo de control (sin ningún tratamiento) mostró una morfología celular completa. Se encontraron grandes cantidades de sustancias vacuolares en el citoplasma celular del grupo HIFU. Pero las células todavía tienen membranas celulares y membranas nucleares completas. Sin embargo, tanto el HIFU – N ₂ Grupo O-mbs y HIFU – C ₃ F ₈ El grupo -mbs mostró una pérdida de la integridad de la membrana celular y una desintegración completa de la estructura celular. Cabe mencionar que las observaciones de TEM fueron solo el momento en el proceso de muerte celular y apoptosis después del tratamiento en cada grupo. N ₂ Las O-mbs como microburbujas exógenas tienen un efecto obviamente sinérgico sobre el tratamiento con HIFU. En el HIFU – N ₂ Grupo O-mbs, el efecto sonodinámico de N ₂ O-mbs podría promover más apoptosis celular. Los resultados han sido validados tanto en la detección de citometría de flujo como en el experimento in vivo (Archivo adicional 4:Figura S4; Archivo adicional 5:Figura S5)

un Resultados del ensayo de unión de Anexina V-FITC / PI; b la tasa de apoptosis celular promedio en cada grupo; c análisis cuantitativo de la generación de NO de N ₂ O-mbs irradiados por HIFU; d Imagen de microscopía electrónica de transmisión de células. Las barras de escala son 100 μm. (Los datos se muestran como media ± DE, n =5 por grupo, * p <0,05, en comparación con el control, HIFU , HIFU – C ₃ F ₈ -mbs grupos)

N ₂ O-mbs como sinergista para la terapia HIFU

Después de la ablación con HIFU del hígado bovino aislado, apareció una región necrótica coagulativa gris-blanca en el área objetivo (Fig. 6b). Los cambios de intensidad del eco promedio en el área objetivo antes y después de HIFU se muestran en la Fig. 6c. En comparación con los del grupo PBS, los valores de intensidad del eco objetivo del C ₃ F ₈ -mbs grupo y el N ₂ O-mbs group were significantly increased after HIFU treatment (p <0.05) and increased as the HIFU ablation intensity increased. The coagulative necrotic volume of the latter two groups and the echo intensity of the B-mode ultrasound images of the target area both increased as the HIFU power increased (Fig. 6d, e).

un Schematic illustration of ex vivo HIFU ablation on degassed bovine livers; b photography of the targeted area in excised bovine liver after HIFU ablation; c real-time ultrasound images before and after HIFU irradiation on bovine livers at 100 W, 125 W and 150 W for 5 s; d quantitative analysis of echo intensity; e quantitative analysis of coagulative necrosis volume of the targeted area in the excised bovine liver after HIFU ablation. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with 100 W, 5 s, 125 W, 5 s groups)

The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU therapy was further verified in vivo. As shown in Fig. 7a, the digital photos of mice and corresponding tumor tissue were recorded 21 days after different treatment. Tumor growth was more effectively inhibited after N₂ O-mbs combined with HIFU treatment. The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU treatment was also evaluated by H&E, PCNA, and TUNEL staining (Fig. 7b), which demonstrated that N₂ O-mbs combined with HIFU irradiation could cause larger scale of tumor cell necrosis as compared with HIFU–C₃ F ₈ -mbs group. The cell morphology changes exhibited in HIFU–N₂ O-mbs were more obvious than other groups, including karyopyknosis, karyorrhexis and karyolysis, indicating the substantial necrosis of cancer cells.

un Digital photos of tumor-bearing mice and ex vivo tumors 21 days after different treatments; b H&E, PCNA and TUNEL staining of tumor sections after various treatments; c the corresponding calculated tumor volume of each group after 21 days of different treatments; d body weight of tumor-bearing mice for each group. The scale bars in HE staining are 100 μm; the scale bars in TUNEL and PCNA staining are 50 μm. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with HIFU-C₃ F ₈ -mbs group)

In addition, the tumor volume of HIFU–N₂ O-mbs exhibited a more significant inhibited tendency than HIFU–C₃ F ₈ -mbs within the 21 days (Fig. 7c, d).

Discusión

HIFU, as a new method of oncotherapy, has been clinically recognized and has achieved notable progress in the treatment of many solid tumors [32]. The thermal effect, cavitation effect, mechanical effect and acoustic chemical effect play significant roles in killing tumor cells and causing irreversible damage to the target area tissue during HIFU ablation [33]. HIFU has limited impact on surrounding normal tissues and is essentially a non-invasive tumor treatment. However, the energy carried by the ultrasound is attenuated due to increased transmission distance, absorption by the blood flow in the target area and the blockage of bones or gas in the body during the HIFU treatment, so that the energy transferred to the target area is reduced. However, prolonging the ablation time and increasing the treatment power increases the risk of normal tissue damage, such as skin burns, neurovascular damage and other complications [34]. Therefore, it is necessary to increase the efficacy of HIFU. Many studies have confirmed that both microbubbles and SDT can improve the efficacy of HIFU [15, 16, 35]. El N ₂ O-loaded microbubbles prepared in this study have a smaller particle size, but similar characteristics as ultrasonic microbubble contrast agents. Studies have shown that nano/microbubbles have the same imaging capability as microbubbles in vitro, but have greater capability than microbubbles in vivo [36]. So, N₂ O-mbs not only could be used for ultrasound guidance and localization for HIFU treatment, but also could be used as exogenous microbubbles to enhance the efficacy of HIFU (Additional file 6:Figure S6). At the same time, the sonodynamic effect of N₂ O-mbs could effectively improve the efficacy of HIFU. The generation of ROS after ultrasonic excitation is one of the most important factors for sonosensitizers [16]. To verify the sonosensitivity of N₂ O-mbs, the production of ROS in both extracellular and intracellular environments was detected in this study. The consistent result of both tests showed that N₂ O-mbs can generate ROS in both aqueous solution and intracellularly. Studies have also shown that gases (N₂ y O ₂ ) trapped in cavitation nuclei in solution can undergo cleavage reactions and produce N and O free radicals [37, 38], as follows:

$$ {N}_2O\to {N}_2+{O}_2\kern0.50em {O}_2\to 2\bullet O\ \ \ {N}_2\to 2N.N.+ HO.\to NO+H. NO+ HO.\to HNO $$

The cavitation effect and the advantage of microbubble packaging reduce the difficulty of the N₂ O reaction [39]. When incubated with cells, N₂ O-mbs exhibit good biocompatibility. The high selectivity, high affinity and high drug loading of nanoparticles [40], as well as the active phagocytosis by cells, promote efficient N₂ O-mbs binding to cancer cells. The nanobubbles display increased penetration, stability and ease of cell entry or aggregation around the cells [36]. In addition, the sonoporation effect of ultrasound can effectively promote the transfer of microbubbles into cells [41].

In contrast to the traditional microbubble contrast agent C₃ F ₈ -mbs, N₂ O-mbs have a greater inhibitory effect on cell growth after ultrasonic irradiation, which is characterized by increased intracellular ROS, decreased cell viability, and apoptosis and necrosis. These results preliminarily suggested the sonodynamic toxic effect of N₂ O-mbs.

In the HIFU synergy experiment, the treatment parameters in the experimental group were set to 125 W for 5 s by analyzing and comparing the experimental results and consulting the literature, which validated a low HIFU power could induce sufficient ablation effect and reduce adverse effects. The results showed that N₂ O-mbs increased the necrosis and advanced apoptosis of more tumor cells. N ₂ O-mbs acted as a nanoscale microbubble synergizer and its sonodynamic effect in response to HIFU may be the reason for the different experiment results. As a microbubble, N₂ O-mbs increased the deposition of HIFU energy in the target area and increased the temperature of the target area and increased the thermal effect of HIFU treatment [11]. The generation of the cavitation effect is closely related to the cavitation threshold and cavitation nucleus concentration [42]. N ₂ O-mbs were cavitation nucleus that reduce the cavitation threshold of HIFU and facilitate the cavitation effect. Therefore, N₂ O-mbs effectively promoted cell necrosis. As a nanoscale microbubble synergizer, N₂ O-mbs were lysed and generate free radicals and nitrogen oxide in response to ultrasound. Studies have confirmed that ROS are important factors in apoptosis induction [43]. It is worth noting that many kinds of free radicals can cause damage to cells. In addition to the generation of oxygen radicals, N₂ O can generate other types of free radicals in cleavage reactions, such as nitrogen free radicals, which contribute to the killing of tumor cells. A small amount of nitric oxide (NO) production was detected in the cell supernatant after HIFU treatment, further indicating that the N₂ O cleavage reaction occurred. An et al. [44] reported that NO may have an anti-tumor function, the mechanism of which involves NO attacking suspected iron enzymes that cause cells to fail to grow and divide when they are trapped. In addition, unstable NO can interact with oxygen molecules to form hydroxyl radicals (HO ^· ) and NO₂ . Hydroxyl radicals are extremely cytotoxic and promote tumor cell apoptosis. NO is also an endothelium-derived relaxing factor. The generation of NO may be the reason for hyperaemia and abnormal swelling in patients during HIFU operation. In an excised bovine liver experiment, we carefully compared the echo intensity of B-mode ultrasound images, pathological changes and coagulative necrotic volume of the target area after HIFU ablation in the presence of N₂ O-mbs, C₃ F ₈ -mbs and PBS. All of these results were consistent. Compared with PBS, N₂ O-mbs effectively enhanced the ablation effect of HIFU. This synergistic effect was also better demonstrated in the ablation of solid tumor in vivo, manifested by tumor cell apoptosis increased, tumor volume reduced and tumor growth inhibition. This finding further indicates that N₂ O-mbs may be a novel auxiliary agent for ultrasound that can be used to promote HIFU thermal tumor ablation. The synergistic effect of N₂ O-mbs in HIFU and the synergistic mechanism provide new ideas and theoretical practice for HIFU synergist research. But, the other related mechanisms of the synergy should be further explored. The effect of tumor ablation by HIFU combined with N₂ O-mbs should be further addressed.

Conclusión

In summary, we have developed N₂ O-mb nanoparticles. The characterization and biocompatibility of the N₂ O-mbs were determined. The sonosensitivity of N₂ O-mbs was examined by detecting the production of ROS in aqueous solution and intracellularly. Compared with C₃ F ₈ -mbs, N₂ O-mbs generated ROS and promoted the apoptosis and necrosis of tumor cells, which exhibited extraordinary sonosensitivity. In the HIFU synergy experiments, the sonodynamic effects of N₂ O-mbs significantly increased the apoptosis and necrosis of tumor cells in vitro, and increased the coagulative necrotic volume and echo intensity in the ex vivo isolated bovine liver target area, and effectively inhibited tumor growth in vivo. These results suggested that N₂ O-mbs could be a new kind of sonosensitizer and a novel auxiliary agent for ultrasound therapy that can be used for the ablation of tumors by HIFU.

Disponibilidad de datos y materiales

The conclusions made in this manuscript are based on the data which are all presented and shown in this paper.

Abreviaturas

N₂ O-mbs:

N ₂ O microbubbles

C ₃ F ₈ -mbs:

C₃ F ₈ microbubbles

HIFU:

high-intensity focused ultrasound

LIFU:

low-intensity focused ultrasound

SOSG:

singlet oxygen sensor green

SDT:

sonodynamic therapy

DPPC:

1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine

DSPE-mPEG2000:

1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamine-N -[methoxy(polyethylene glycol)-2000

DAPI:

4 ', 6-diamidino-2-fenilindol

DiI:

1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

DCFH-DA:

2′,7′-dichlorofluorescin diacetate

DAF-FM:

3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate

CAM:

Calcein-AM

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

confocal laser scanning microscopy

TEM:

transmission electron microscope

DMEM:

Medio Eagle modificado de Dulbecco

FBS:

fetal bovine serum

PBS:

phosphate-buffered saline

DI:

deionized water

ROI:

regions of interest

ROS:

reactive oxygen species

NO:

nitric oxide

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