La regulación de miR-410/Wnt-11 promueve la formación ósea e inhibe osteoclastos para tratar la osteonecrosis de cabeza femoral

Resumen

Antecedentes

Se desconoce el papel funcional del microARN-410 (miR-410) en la osteonecrosis de cabeza femoral (ONCF); por ello, este estudio investiga la modulación del eje miR-410/Wnt-11 sobre los mecanismos osteogénicos y osteoclásticos en la prevención de la ONCF.

Métodos

Se recolectaron 15 muestras de ONCF y 15 normales. Se observaron cambios patológicos en cabeza femoral, osteoblastos y osteoclastos. En modelo de rata de ONCF se inyectaron agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA u oe-Wnt-11. Se evaluaron miR-410, Wnt-11; factores osteoblásticos: fosfatasa alcalina (ALP), proteína gamma-carboxiglutámica ósea (BGLAP), Colágeno tipo I alfa 1 (Collα1); factores osteoclásticos: fosfatasa ácida 5 (ACP5), catapsina K (CTSK), MMP9, Bcl-2 y Bax mediante RT-qPCR y western blot. Índices de función osteogénica (ALP, OCN) y osteoclástica (NTX-1, CTX-1) en suero mediante ELISA.

Resultados

En tejidos ONCF de muestras clínicas, miR-410, ALP, BGLAP y Collα1 disminuyeron, mientras Wnt-11, ACP5, CTSK y MMP9 aumentaron. La upregulación de miR-410 y downregulación de Wnt-11 elevaron densidad mineral ósea (DMO) y BV/TV en ratas, aumentaron DMO en fémur, cabeza femoral y columna vertebral, elevaron calcio y fósforo sérico, inhibieron apoptosis de osteocitos, incrementaron OCN, ALP, BGLAP, Collα1 y redujeron ACP5, CTSK, NTX-1, CTX-1, MMP9.

Conclusión

La upregulación de miR-410 o downregulación de Wnt-11 aumenta osteoblastos y reduce osteoclastos, aliviando la ONCF. miR-410 puede ser diana terapéutica potencial para ONCF.

Introducción

La osteonecrosis de cabeza femoral (ONCF), una de las enfermedades más frecuentes de la cadera, causa dolor severo o discapacidad articular, afectando principalmente a personas de mediana edad [1]. El tratamiento de ONCF en adultos, con 8,12 millones de pacientes en China, sigue siendo un desafío [2]. Factores de riesgo: hiperlipidemia, enfermedades autoinmunes, trastornos de coagulación, alcoholismo, hipercortisolismo [3]. Tratamiento quirúrgico: descompresión nuclear con o sin adyuvantes (médula ósea autónoma); artroplastia total de cadera (ATC) para ancianos o ONCF avanzada no tratable con preservación articular [4]. Sin embargo, ONCF tiene pronóstico insatisfactorio en pacientes que frecuentemente requieren ATC [5]. Urge explorar diana terapéutica precisa para ONCF.

Los microARN (miARN) son reguladores clave de función celular y expresión génica, con enorme función en homeostasis endotelial y potencial terapéutico [6]. Estudios reportan miR-410 expresado anómalamente en varios cánceres, actuando como supresor tumoral en endometrial, pulmón, mieloma, mama [7-10]. Otro estudio revela efecto neuroprotector de miR-410 en modelo celular de Parkinson inducido por 6-hidroxidopamina, suprimiendo vía PTEN/AKT/mTOR [11]. Además, miR-410 modula comportamientos malignos en leucemia linfoblástica aguda infantil vía FKBP5 y AKT [12]. Artículo demuestra efecto inhibitorio de miR-410 sobre receptor angiotensina II tipo 1 en cáncer pancreático [13]. La proteína Wnt es glicoproteína secretada rica en cisteína, crucial en desarrollo y enfermedad [14]. Wnt-11 pertenece a vía Wnt, regulador positivo con roles clave en carcinogénesis [15]. Estudios reportan significado clínico de expresión de antígeno carcinoma escamoso y Wnt11 en carcinoma cervical [16]. Además, señales TGF-β1 y Wnt11 sinérgicas impulsan expresión de sm-α-actina en músculo liso vía Rho quinasa-actina-MRTF-A [17]. Basado en lo anterior, este estudio investiga el papel de miR-410 regulando Wnt-11 en prevención de ONCF, hipotetizando que miR-410 dirigiéndose a Wnt-11 modula mecanismos osteogénicos y osteoclásticos en prevención de ONCF.

Materiales y Métodos

Declaración Ética

Estudio aprobado por Comité de Revisión Institucional del Hospital Beijing Shijitan, Universidad Capital Medical, siguiendo Declaración de Helsinki. Participantes dieron consentimiento informado por escrito. Experimentos animales siguieron Guía Cuidado y Uso Animales Laboratorio de NIH. Protocolo aprobado por Comité Ética Experimentos Animales del mismo hospital.

Sujetos de Estudio

30 pacientes del departamento ortopédico del Hospital Beijing Shijitan (enero 2017-septiembre 2018). 15 con ONCF tratados con ATC: edad media 50,6±4,3 años, peso 57,0±5,6 kg, 7 hombres, 8 mujeres (grupo ONCF). 15 con fractura cuello femoral tratados con ATC: edad 59,6±3,3 años, peso 50,0±5,6 kg, 9 hombres, 6 mujeres (grupo control). Sin diferencias significativas en género, edad, peso (P>0,05). Tejidos de área subcondral necrótica extraídos por escisión longitudinal de cabeza femoral, almacenados a -80°C. Cada grupo examinado por patología y biología molecular.

Tinción Hematoxilina-Eosina (HE)

Muestras fijadas con 4% paraformaldehído, descalcificadas con 10% EDTA, solución cambiada semanalmente. Tras descalcificación completa, incluidas en parafina, cortadas 4 μm. Secciones horneadas, desparafinadas en xileno I/II 10 min, rehidratadas en alcoholes descendentes 2 min cada uno. Teñidas hematoxilina 3 min, diferenciadas 1% alcohol ácido clorhídrico 2 min. Lavadas en alcoholes ascendentes 2 min, eosina 5 s. Deshidratadas en alcoholes 3 min, xileno I/II 5 min. Selladas con goma neutra, examinadas microscopio.

Tinción Fosfatasa Alcalina (ALP)

Una sección por muestra, horneada 60°C 60 min. Desparafinada xileno I/II 15 min, rehidratada alcoholes 5 min cada uno, lavada agua destilada triple 2 min. Gotas sustrato kit tinción ALP (Nanjing JianCheng), incubadas 37°C oscuridad 15 min. Descartado exceso, agente cromogénico A 5 min, lavado 30 s. Agente cromogénico B 30 s, contraste 30 s. Fotografía microscopio 200×, osteoblastos contados con sistema análisis imagen (Image-Pro Plus 6.0).

Tinción Fosfatasa Ácida Resistente Tartrato (TRAP)

Una sección por muestra, horneada 60°C 60 min. Desparafinada xileno I/II 15 min, rehidratada alcoholes 5 min. Fijadas solución fijadora 30 s. Portaobjetos en caja oscura con solución TRAP fresca (Sigma), cubriendo secciones, incubadas 37°C 1 h. Contrateñidas hematoxilina 2 min, secadas. TRAP decae con tiempo, examinadas directamente microscopio sin sellar. Fotografía 200×, osteoclastos contados Image-Pro Plus 6.0.

Inmunohistoquímica

Tras descalcificación, incluidas en parafina, cortadas 4 μm. Desparafinadas xileno convencional, deshidratadas alcohol gradiente, incubadas 3% H₂O₂ 7°C 30 min, hervidas citrato 0,01 M 95°C 20 min. Bloqueo suero oveja 10 min, anticuerpo primario Wnt-11 (1:100, Invitrogen) 4°C noche, secundario kit listo (PV-6000, ZSGB-Bio) 20 min, estreptavidina-peroxidasa (S-A/HRP, Beijing ComWin) 2 min. Revelado DAB (Sigma), contraste hematoxilina (Shanghai Bogoo), sellado. PBS sustituye primario como control negativo. Microscopio óptico: células positivas marrón en citoplasma, fuerte marrón oscuro, débil marrón claro, negativa sin color. 5 campos alta potencia (400×) por sección, 100 células/campo. Promedio = resultado sección. Según proporción/distribución células positivas: negativa (-), célula única <5%; débil (+), dispersa/pequeño grupo 5-24%; positiva (++), láminas/grupos 25-50%; fuerte (+++), difusa >50%. Evaluación doble ciego por dos observadores independientes.

RT-qPCR

ARN total extraído tejidos kit Trizol (Invitrogen). Concentración/pureza ARN determinadas. Cebadores diseñados/sintetizados Takara Bio Inc. (Otsu, Japón) (Archivo adicional 1: Tabla S1). ARN retrotranscrito a cDNA kit PrimeScript RT (Takara Biotechnology, Dalian). Reacción PCR cuantitativa fluorescente SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara). Sistema ABI PRISM® 7300 (Applied Biosystems). U6 control carga miR-410; GAPDH parámetro interno Wnt-11, ALP, BGLAP, Collα1, ACP5, CTSK, MMP9, Bcl-2, Bax. Niveles transcripcionales relativos método 2^{-ΔΔCt} [18].

Western Blot

Proteína total extraída tejidos cabeza femoral. Concentración medida, carga ajustada agua desionizada. Gel separación SDS y espaciador 10% preparados. Tras baño hielo y centrifugación, electroforesis misma cantidad, transferencia membrana nitrocelulosa. Membrana bloqueada 5% leche descremada 4°C noche, anticuerpos primarios: Wnt-11 (1:150, Santa Cruz), ALP (1:100, Sigma), BGLAP, Collα1, MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam), Bcl-2, Bax (1:500, Proteintech) noche. Anticuerpo secundario IgG-HRP (1:1000, Wuhan Boster) 1 h. Membrana inmersa quimioluminiscencia mejorada (Pierce) 1 min. Tras revelado/fixado, observación. GAPDH parámetro interno, imagen analizada ImageJ2x.

Establecimiento Modelo Rata ONCF

90 ratas Sprague-Dawley macho (Shanghai SLAC), 300-350 g. Ambiente 18-25°C, humedad 45-70%. Jaulas separadas, sin ruido. Tras 1 semana adaptación, experimentos.

Modelo ONCF traumático: anestesia intraperitoneale, depilación, preparación piel. Incisión, separación tejidos, sección ligamento redondo tras exposición cabeza femoral. Periostio cuello femoral raspado, irrigación sanguínea cabeza femoral destruida. Cápsula articular, músculo, piel suturados capa a capa, esterilización.

Agrupamiento Animales

70 ratas modeladas exitosamente en 7 grupos (n=10): ONCF; agomir-NC (0,5 mL agonista NC miR-410 200 nM, Guangzhou RiboBio, semana post-modelado); agomir-miR-410 (0,5 mL agonista miR-410 200 nM); siRNA-NC (0,4 mL vector NC silenciado Wnt-11 1×10⁹ PFU, Shanghai GenePharma); Wnt-11-siRNA (0,4 mL vector silenciado Wnt-11 1×10⁹ PFU); agomir-miR-410+OE-NC (0,5 mL agonista miR-410 + 0,4 mL NC upregulado Wnt-11 1×10⁹ PFU); agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (0,5 mL agonista miR-410 + 0,4 mL upregulado Wnt-11 1×10⁹ PFU). Grupo normal (solo salina intraperitoneale, n=10) control. Tras 4 semanas ONCF: micro-TC, osteometría, rayos X, densitometría ósea, calcio/fósforo sérico.

Micro-TC y Osteometría

Cabeza femoral derecha en micro-TC (GE Healthcare), fantasma estándar escaneado. Parámetros: resolución 27×27×27 μm, corriente 450 mA, voltaje 80 kV, tiempo 88 min. Microestructura observada. Tras calibración, 3 regiones interés (ROI) cuboides 0,5×0,5×0,5 cm³ seleccionadas aleatoriamente por grupo para reconstrucción. Procesamiento software GE Microview, ROI reconstruida/analizada osteometría. Parámetros: DMO y fracción volumen óseo (BV/TV).

Rayos X, DMO, Calcio/Fósforo Sérico

4 semanas post-operatorio, ratas anestesiadas cloral hidrato 10% intraperitoneale. Posición supina, extremidades fijadas, radiografía. Cambios forma/densidad cabeza femoral. Densidad fémur, cabeza femoral, columna: densitómetro dual energía. 4 semanas, ayuno 12 h, sangre 5 mL punción cardíaca mañana, tubos coagulación vacío. Suero separado 3000 rpm 15 min. Calcio/fósforo sérico: analizador bioquímico automático.

Microscopía Electrónica

Tejido óseo fijado 3,5% glutaraldehído, descalcificado 5% HCl y 1% OsO₄, deshidratado acetona gradiente, doble tinción acetato uranilo/ácido cítrico, incluido Epon-61. Tras sección semifina, ultra-fina observada microscopio electrónico transmisión.

Ensayo TUNEL

Secciones parafina pretratadas desparafinado/deshidratación convencional. Incubadas pepsina (0,25-0,5% HCl) 25 min, 50 μL mezcla reacción TUNEL, caja húmeda 60 min, 50 μL agente-peroxidasa, caja húmeda 30 min. Revelado DAB, observación coloración microscopio. Agua detiene revelado, hematoxilina 2 min. Deshidratación etanol 95% I-II, absoluto I-II 3-5 min, xileno I-II 3-5 min, sellado goma neutra. Análisis microscopio óptico.

ELISA

Tras anestesia, sangre arteria femoral, suero centrifugado tras 1 h reposo. Según kit ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology): 7 pozos estándar concentraciones varias (100 μL), blancos 100 μL diluyente, restantes 100 μL muestra. Placa film 1 h, descartar líquido. Solución A 100 μL todos pozos, film 1 h. Lavado, solución B 100 μL, film 30 min. Sustrato tetrametilbencidina 90 μL, film 10-20 min, solución parada 50 μL. OD lector microplacas, concentración real enumerada.

Ensayo Reportero Luciferasa Dual

Sitios unión y relación diana miR-410/Wnt-11 3' UTR predichos software bioinformático https://www.targetscan.org. Secuencia región promotora Wnt-11 3'UTR con sitio unión miR-410 clonada en plásmido pMIR-REPORT™ Luciferase (Ambion) = plásmido Wnt-11-WT (tipo salvaje). Plásmido Wnt-11-MUT (mutante) construido mutando sitio unión. Kit extracción plásmido (Promega), células logarítmicas sembradas placas 96 pozos. Confluencia ~70%, transfección Lipofectamine 2000. Wnt-11-WT y Wnt-11-MUT mezclados con mimics NC y miR-410 mimics (Shanghai GenePharma), co-transfectados células 293T. Células recolectadas/lisadas 48 h post-transfección, actividad luciferasa kit detección (BioVision) y luminómetro Glomax 20/20 (Promega).

Análisis Estadístico

Datos procesados SPSS 21.0 (IBM). Datos media ± DE. ANOVA un sentido comparaciones múltiples, t-test dos grupos, LSD-t post-ANOVA. P<0,05 diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

Cambios Patológicos en Tejidos ONCF de Muestras Clínicas

Tinción HE observó cambios patológicos cabeza femoral en grupo fractura cuello femoral (control) y ONCF. Control: densidad trabéculas bien distribuida, estructura íntegra. ONCF: muchas lagunas óseas vacías en cerebelo óseo, osteocitos disminuidos, trabéculas alteradas continuamente, hiperplasia tisular alrededor cerebelo (Fig. 1a).

TRAP reveló TRAP principalmente en osteoclastos, identifica osteoclastos maduros en amaranto. Vs control: osteoclastos TRAP+ aumentaron en ONCF, morfología diversa, grandes multinucleados. Defectos óseos obvios en cerebelo adyacente a osteoclastos, mostrando reabsorción (Fig. 1b).

ALP: enzima marcadora diferenciación/maduración osteoblastos, regula maduración/calcificación matriz ósea. Expresión ALP identifica osteoblastos. Gránulos marrón/café en citoplasma osteoblastos maduros. Vs control: osteoblastos ALP+ reducidos en ONCF (Fig. 1c).

miR-410, ALP, BGLAP, Collα1 Disminuyen y Wnt-11, ACP5, CTSK, MMP9 Aumentan en Tejidos ONCF

Western blot y RT-qPCR: miR-410 disminuyó en ONCF vs control, Wnt-11 aumentó; factores osteoblásticos ALP, BGLAP, Collα1 degradados; factores osteoclásticos ACP5, CTSK, MMP9 ascendieron (todos P<0,05) (Fig. 2a-c).

Inmunohistoquímica Wnt-11: proteína citoplasmática, positiva marrón/amarronado. Vs control: tasa positividad Wnt-11 aumentada en ONCF (P<0,05) (Fig. 2d).

miR-410 Upregulado y Wnt-11 Downregulado Elevan DMO y BV/TV en Ratas

Micro-TC: grupo normal: cabeza femoral redonda, cuello grosor uniforme, trabéculas continuas/distribuidas uniformemente. ONCF, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11: cabeza femoral colapsó gradualmente, área reabsorción apareció, cuello femoral adelgazó, trabéculas rotas/continuidad destruida. agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC: apariencia intacta, sin colapso, sin reabsorción obvia, trabéculas normales, estructura completa (Fig. 3a).

Osteometría: vs normal, DMO y BV/TV deprimidos en ONCF (P<0,05). Vs agomir-NC y siRNA-NC, DMO y BV/TV elevados en agomir-miR-410 y Wnt-11-siRNA (P<0,05). Vs agomir-miR-410+OE-NC, DMO y BV/TV disminuyeron en agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P<0,05) (Fig. 3b,c).

Sobreexpresión miR-410 y Baja Expresión Wnt-11 Aumentan DMO en Fémur, Cabeza Femoral, Columna y Calcio/Fósforo Sérico

Rayos X: normal: cabeza femoral redonda, densidad uniforme, estructura completa. ONCF, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11: cabeza femoral adelgazada, área reabsorción. agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC: apariencia uniforme, grosor completo (Fig. 4a).

DMO y calcio/fósforo sérico: vs normal, DMO fémur, cabeza femoral, columna y calcio/fósforo cayeron en ONCF (P<0,05). Vs agomir-NC y siRNA-NC, DMO y calcio/fósforo ascendieron en agomir-miR-410 y Wnt-11-siRNA (P<0,05). Vs agomir-miR-410+OE-NC, DMO y calcio/fósforo disminuyeron en agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P<0,05) (Fig. 4b,c).

Silenciamiento Wnt-11 y Upregulación miR-410 Alivian Cambios Patológicos e Inhiben Apoptosis Osteocitos

HE: normal: trabéculas limpias/claras, dispuestas regular/apretado. Osteocitos llenan lagunas, zona calcificada bien conectada trabéculas subcondrales. ONCF, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11: trabéculas dispersas, adelgazadas, rotas; estructura desordenada, fragmentos. Osteocitos necróticos, muchas lagunas vacías, proliferación tejido granuloma envolviendo trabéculas necróticas. agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC: apariencia intacta, sin reabsorción obvia, trabéculas normales, estructura completa (Fig. 5a).

Microscopía electrónica: normal: forma osteocitos consistente lagunas, pequeño espacio célula-pared. Orgánulos abundantes, núcleo ovoide, membrana nuclear intacta, cromatina no aglutinada, pseudópodos citoplasmáticos conectados osteocitos adyacentes. Osteoblastos superficie trabécula, alargados, muchos orgánulos. ONCF, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11: depósitos lipídicos citoplasma osteoblastos, espacio cápsula-laguna ensanchado, bandas brillantes edema entre membrana nuclear-citoplasma, marginación nuclear, membrana intacta, mitocondrias hinchadas, retículo endoplásmico/aparato Golgi desaparecidos. agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC: morfología osteoblastos normal, agregación cromatina en algunas células, sin gotas lipídicas citoplasma, membrana nuclear intacta (Fig. 5b).

TUNEL: vs normal, apoptosis osteocitos aumentada en ONCF (P<0,05). Vs agomir-NC y siRNA-NC, apoptosis disminuyó en agomir-miR-410 y Wnt-11-siRNA (P<0,05). Vs agomir-miR-410+OE-NC, apoptosis aumentó en agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P<0,05) (Fig. 5c,d).

Western blot y RT-qPCR: Bcl-2 reducido, Bax aumentado en ONCF vs normal (P<0,05). Vs agomir-NC y siRNA-NC, Bcl-2 ascendió, Bax descendió en agomir-miR-410 y Wnt-11-siRNA (P<0,05). Vs agomir-miR-410+OE-NC, Bcl-2 declinó, Bax aumentó en agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P<0,05) (Fig. 5e-g).

Sobreexpresión miR-410 y Baja Expresión Wnt-11 Aumentan Osteoblastos y Disminuyen Osteoclastos

TRAP: normal: osteoclastos TRAP+ morfología diversa, mayoría fusiformes, pocos polígonos grandes, distribuidos alrededor cerebelo. ONCF, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11: células TRAP+ aumentadas, morfología diversa polígonos grandes/policariotas, reabsorción trabéculas adyacentes, lagunas reabsorción típicas. agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC: células TRAP+ reducidas, forma alargada regular, osteoclastos polinucleares poligonales raros, estructura trabéculas adyacentes relativamente completa (Fig. 6a).

ALP: normal: osteoblastos ALP+ pequeños/redondos, agregados, mayoría espacio trabecular médula ósea y superficie algunas trabéculas. ONCF, agomir-NC, siRNA-NC, agomir-miR-410+OE-Wnt-11: osteoblastos ALP+ dispersos espacio trabecular médula. agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA, agomir-miR-410+OE-NC: osteoblastos+ aumentados, distribuidos espacio trabecular y superficie parte trabéculas (Fig. 6c).

Vs normal: osteoblastos/área suprimidos, osteoclastos aumentados en ONCF (P<0,05). Vs agomir-NC y siRNA-NC: osteoblastos/área aumentados, osteoclastos disminuyeron en agomir-miR-410 y Wnt-11-siRNA (P<0,05). Vs agomir-miR-410+OE-NC: osteoblastos/área disminuyeron, osteoclastos aumentaron en agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P<0,05) (Fig. 6b,d).

Alta Expresión miR-410 y Baja Wnt-11 Elevan OCN, ALP, BGLAP, Collα1 y Reducen NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, MMP9 en Ratas ONCF

ELISA: vs normal, índices función osteogénica ALP y OCN degradados, índices función osteoclástica NTX-1 y CTX-1 aumentaron en ONCF (P<0,05). Vs agomir-NC y siRNA-NC: ALP y OCN ascendieron, NTX-1 y CTX-1 descendieron en agomir-miR-410 y Wnt-11-siRNA (P<0,05). Vs agomir-miR-410+OE-NC: ALP y OCN cayeron, NTX-1 y CTX-1 aumentaron en agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P<0,05) (Fig. 7a).

Western blot y RT-qPCR: vs normal, factores osteoblásticos ALP, BGLAP, Collα1 degradados, osteoclásticos ACP5, CTSK, MMP9 ascendieron (P<0,05). Vs agomir-NC y siRNA-NC: ALP, BGLAP, Collα1 elevados, ACP5, CTSK, MMP9 reducidos en agomir-miR-410 y Wnt-11-siRNA (P<0,05). Vs agomir-miR-410+OE-NC: ALP, BGLAP, Collα1 deprimidos, ACP5, CTSK, MMP9 aumentaron en agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P<0,05) (Fig. 7b-d).

Wnt-11 Elevado y miR-410 Disminuido en Tejidos ONCF de Ratas; Wnt-11 Gen Dianas de miR-410

Análisis bioinformático (TargetScan): región unión específica entre secuencia Wnt-11 y miR-410, implicando Wnt-11 gen diana de miR-410 (Fig. 8a). Ensayo actividad luciferasa verifica relación (Fig. 8b). Vs grupo NC, actividad luciferasa disminuyó en grupo mimics miR-410 (P<0,05), sin diferencia significativa en MUT 3'UTR (P>0,05), indicando unión específica miR-410 a Wnt-11.

Western blot y RT-qPCR: vs normal, miR-410 declinó, Wnt-11 aumentó en ONCF (P<0,05). Vs agomir-NC, miR-410 aumentó, Wnt-11 redujo en agomir-miR-410 (P<0,05). Vs siRNA-NC, Wnt-11 declinó en Wnt-11-siRNA (P<0,05). Wnt-11 aumentó en agomir-miR-410+OE-Wnt-11 vs agomir-miR-410+OE-NC (P<0,05) (Fig. 8c-e).

Inmunohistoquímica Wnt-11: proteína citoplasmática, positiva marrón/amarronado. Vs normal, tasa positividad Wnt-11 aumentada en ONCF (P<0,05). Vs agomir-NC y siRNA-NC, tasa positividad descendió en agomir-miR-410 y Wnt-11-siRNA (P<0,05). Vs agomir-miR-410+OE-NC, tasa positividad aumentó en agomir-miR-410+OE-Wnt-11 (P<0,05) (Fig. 8f,g).

Discusión

ONCF, enfermedad destrucción ósea, causada por fallo suministro sanguíneo y trastornos coagulación/fibrinólisis, colapso final cabeza femoral [19]. Estudios previos: expresión miARN en células madre mesenquimales médula ósea inducidas por hormonas en ratones ONCF [20]; perfil expresión miARN células madre mesenquimales médula ósea en osteogénesis relacionada ONCF inducida esteroides [21]; stents Li-nHA/GM/rhEPO elevan vías Wnt e HIF-1/VEGF, promueven osteogénesis/angiogénesis, beneficiosos reparación ONCF inducida glucocorticoides [22]. Basado en esto, estudio explora efectos miR-410 en prevención ONCF dirigiéndose a Wnt-11.

Nuestro estudio aporta evidencia sustancial: miR-410, ALP, BGLAP, Collα1 degradados y Wnt-11, ACP5, CTSK, MMP9 aumentados en tejidos ONCF. Estudio reciente: expresión miR-410 en osteosarcoma disminuida, efecto antitumoral [23]. Otro: miR-410 reducido en tejidos cáncer mama receptor estrógeno positivo [24]. Factor secretado Wnt-11 aumentado en varios cánceres (colorrectal), promueve migración/invasión células cancerosas [25]. Similarmente, Wnt-11 aumentado en cáncer próstata independiente hormonas [26]. ALP índice útil diagnóstico/pronóstico [27]. OCN (BGLAP) molécula conservada relacionada mineralización matriz ósea [28]. ACP5 necesario diferenciación osteoclastos/reabsorción, promueve movimiento celular regulando fosforilación quinasa adhesión [29]. CTSK proteasa crítica degradación osteopontina, colágeno tipo I, otras proteínas matriz ósea [30]. MMPs degradan/modifican componentes matriz extracelular/membrana basal, influencia inmensa invasión/metástasis cáncer [31]. Nuestro estudio revela Wnt-11 gen diana miR-410. Similarmente, Zhang et al. hallaron miR-410 dirige sitio inferido en Wnt3a 3'-UTR modulando vía Wnt [32].

Además, miR-410 upregulado y Wnt-11 downregulado aumentaron DMO y BV/TV en ratas ONCF. Previamente sugerido: disminución DMO espinal y aumento ratio DPD/Cr urinario en ONCF no traumático [33]. Otro estudio: DMO cabeza femoral y vértebras lumbares degradadas en ONCF vs control [34]. Análisis imagen: muscona restaura DMO y ratio BV/TV cabeza femoral necrótica, examen histológico confirma efecto protector muscona en ONCF inducida alcohol [35]. Nuestros datos: alta miR-410 y baja Wnt-11 inhiben apoptosis osteocitos. Estudio: silenciamiento miR-410 induce proliferación y reduce apoptosis células endoteliales vena umbilical inducida LDL oxidada [36]. Descenso miR-410 y ascenso SOCS3 reducen factor antiapoptótico Bcl-2 y promueven apoptosis [37]. En células LNCaP deficientes andrógenos, downregulación Wnt-11 previene diferenciación neuroendocrina y induce apoptosis cáncer próstata [26]. Estudio también mostró downregulación Wnt-11 y upregulación miR-410 aumentaron ALP, BGLAP, Collα1 y redujeron ACP5, CTSK, MMP9. Estudio: Wnt-11 aumentado en células cáncer cervical activa/fosforila JNK-1 vía Wnt/JNK, impulsa proliferación/migración/invasión tumoral [15]. Silenciamiento gen Wnt-11 en líneas celulares cáncer colorrectal reduce capacidad invasiva [25]. Sobreexpresión miR-410 inhibe invasión/migración/proliferación/transición mesenquimal epitelial osteosarcoma vía blanco directo TRIM44 [23]. Estudio previo: miR-410 upregulado inhibe crecimiento colangiocarcinoma en modelo xenoinjerto ratón induciendo apoptosis [38].

Conclusión

En resumen, nuestra investigación revela que miR-410 se expresa bajamente y Wnt-11 altamente en ONCF, y upregular miR-410 o downregular Wnt-11 aumenta osteoblastos y reduce osteoclastos aliviando ONCF. Sin embargo, investigaciones clínicas adicionales podrían detectar eficacia de miR-410 y Wnt-11 para tratamiento ONCF.

Disponibilidad de Datos y Materiales

No aplica

Historial de Cambios

Abreviaturas

ALP:

Fosfatasa alcalina

ANOVA:

Análisis de varianza

BMD:

Densidad mineral ósea

EDTA:

Ácido etilendiaminotetraacético

ELISA:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima

GAPDH:

Gliceraldehído fosfato deshidrogenasa

GE:

General Electric

HE:

Hematoxilina-eosina

LSD-t:

Test t diferencia mínima significativa

miR-410:

MicroARN-410

miARNs:

MicroARNs

NC:

Control negativo

OD:

Densidad óptica

ONCF:

Osteonecrosis de cabeza femoral

PBS:

Salina fosfatada tamponada

ROI:

Regiones de interés

RT-qPCR:

Reacción en cadena de polimerasa con transcripción reversa cuantitativa

SD:

Sprague-Dawley

SDS:

Dodecilsulfato sódico

THR:

Artroplastia total de cadera

TRAP:

Fosfatasa ácida resistente al tartrato

TUNEL:

Marcado de extremos nick por transferasa terminal desoxinucleotidil