Optimización del Pretratamiento para sp-ICP-MS: Revelando la Distribución de Nanopartículas de Plata en Tejidos Biológicos

Resumen

La rápida proliferación de nanopartículas diseñadas (ENPs) ha aumentado la exposición humana, sin embargo las herramientas analíticas actuales no pueden cuantificar y caracterizar simultáneamente ENPs dentro de matrices biológicas. La espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente de partícula única (sp-ICP-MS) ofrece cuantificación simultánea y evaluación de propiedades físicas, pero su aplicación a tejidos está limitada por protocolos de pretratamiento inadecuados que pueden alterar la integridad de las partículas o reducir la recuperación. En este estudio, evaluamos sistemáticamente cinco agentes solubilizantes —hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de tetrametilamonio (TMAH), ácido nítrico (HNO₃), ácido clorhídrico (HCl) y proteinasa K— usando nanopartículas de plata (nAg) como sistema modelo. El tratamiento con NaOH logró >90% de disolución del tejido mientras preservaba el tamaño de partícula y minimizaba la ionización, superando a los otros reactivos. La extensión del protocolo NaOH a homogenados de corazón, pulmón, bazo y riñón confirmó su amplia aplicabilidad. Finalmente, aplicamos el pretratamiento optimizado para evaluar el destino de nAg administrado intravenosamente versus Ag⁺ en sangre e hígado de ratón. El sp-ICP-MS reveló que nAg permaneció mayormente particulado (~80%) en el hígado pero se ionizó (~95%) en el torrente sanguíneo, mientras que Ag⁺ permaneció iónico en ambos compartimentos. Estos hallazgos demuestran que el pretratamiento con NaOH permite análisis preciso de sp-ICP-MS de ENPs in vivo y destaca la importancia de la conversión partícula-ión en la determinación de biodistribución y cinética.

Introducción

Los avances en nanotecnología han acelerado la producción de nanopartículas diseñadas (ENPs) menores de 100 nm, ofreciendo ventajas únicas como penetración tisular mejorada y superficies reactivas. Las nanopartículas de plata (nAg) se despliegan ampliamente en bienes de consumo y fármacos, valoradas por su liberación sostenida de Ag⁺ y propiedades conductoras. Sin embargo, los mismos atributos nanoescala que confieren funcionalidad también pueden plantear riesgos para la salud, incluyendo disrupción de la barrera hematoencefálica y respuestas inflamatorias. Dada la ubicuidad de ENPs, una evaluación rigurosa tanto de peligro como de exposición —colectivamente definiendo el riesgo de ENP— sigue siendo esencial.

Mientras la investigación extensa se ha centrado en toxicidad de ENP, menos estudios han cuantificado escenarios reales de exposición. Trabajos recientes han mostrado distribuciones intracelulares distintas para nAg versus Ag⁺ en células cultivadas, subrayando la necesidad de diferenciar partículas de iones dentro de tejidos. El ICP-MS convencional cuantifica contenido total de metal pero no puede resolver especies partícula versus iónicas, mientras que TEM proporciona información de tamaño pero carece de capacidad cuantitativa. Así, un método que acople cuantificación precisa con análisis de propiedades físicas es crítico para elucidar la biotransformación de ENP.

El sp-ICP-MS de partícula única puede detectar partículas individuales, proporcionando estimaciones de tamaño desde intensidad de pico y concentración desde frecuencia de pico, mientras distingue iones vía análisis de señal de fondo. Estudios previos han aplicado sp-ICP-MS a muestras ambientales y comerciales, pero su uso en tejidos biológicos ha sido limitado, largely due to inadequate pretreatment that can degrade or alter ENPs. Diferentes reactivos solubilizantes varían en su capacidad para lisar tejidos, recuperar ENPs y preservar la integridad de partículas. Este estudio por tanto evalúa y optimiza estrategias de pretratamiento para análisis sp-ICP-MS de nAg en tejidos de ratón, apuntando a establecer un flujo de trabajo confiable para cuantificación simultánea y evaluación de propiedades físicas de ENPs in vivo.

Materiales y Métodos

ENPs

Los nAg Biopure de 30, 70 y 100 nm (nAg30, nAg70, nAg100) se obtuvieron de nanoComposix (San Diego, CA, USA). RM8013, un estándar para calibración de eficiencia de transporte, se obtuvo del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (Gaithersburg, MD, USA). Todas las suspensiones de ENP se sonicaron 10 min antes de uso.

Reactivos

Soluciones de 0.1 mol L⁻¹ NaOH, 25% TMAH, 30% HCl y proteinasa K se compraron de Wako (Osaka, Japón). Una solución de 70% HNO₃ se obtuvo de Kanto Kagaku (Tokyo, Japón).

Animales

Ratones hembra BALB/c (6 semanas) se obtuvieron de Japan SLC (Shizuoka, Japón). Los ratones se alojaron bajo ciclo luz/oscuridad 12-h con acceso ad libitum a comida y agua. Todos los procedimientos cumplieron directrices éticas de la Universidad de Osaka, Japón.

Medición de Distribuciones de Tamaño de Partícula por Dispersión Dinámica de Luz

nAg se diluyó en agua MilliQ a 10 µg mL⁻¹ Ag. Un alícuota de 1 mL se colocó en una celda capilar zeta (Malvern Instruments) y se analizó en un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments) para determinar diámetro medio y potencial zeta.

Medición de Masa Total de Ag

Las concentraciones totales de Ag se midieron en un ICP-MS Agilent 7700x (Agilent Technologies). Condiciones de operación: potencia RF 1550 W, flujo Ar 1.05 L min⁻¹, tiempo de permanencia 100 ms. Rodio sirvió como estándar interno. Las mediciones se realizaron en triplicado.

Análisis sp-ICP-MS y su Cálculo

El análisis sp-ICP-MS usó el mismo instrumento con potencia RF 1550 W, flujo Ar 1.05 L min⁻¹, tiempo de permanencia 10 ms, y tiempo total de corrida 30 s. Los cálculos de tamaño de partícula emplearon la herramienta de partícula única desarrollada por RIKILT.

Concentración Crítica de Partícula para sp-ICP-MS

Soluciones stock de nAg (1.0 mg mL⁻¹) se diluyeron serialmente para producir soluciones de 2000, 800, 700 y 600 pg mL⁻¹, que se diluyeron luego diez veces para generar 40 concentraciones distintas para evaluación sp-ICP-MS.

Optimización de Métodos de Pretratamiento para Hígado de Ratón

Homogenados de hígado se prepararon mezclando tejido con solución salina fosfatada (PBS, p/v = 1:10) y homogeneizando. Cada homogenado se espicó con 100 ng mL⁻¹ nAg y luego se trató con uno de los siguientes reactivos a ratio 1:1 v/v: 0.1 mol L⁻¹ NaOH, 25% TMAH, 30% HCl, o proteinasa K (10 U mL⁻¹ en 0.01 M Tris-HCl, 0.01 M EDTA, 0.5% SDS). Las muestras se incubaron 3 h a 37 °C, residuos se recogieron, pesaron, y sobrenadantes se diluyeron 500 veces para sp-ICP-MS.

Evaluación de Versatilidad del Pretratamiento NaOH en Varios Órganos

Tejidos de corazón, pulmón, bazo y riñón se homogeneizaron en PBS (p/v = 1:10) y se espicaron con 100 ng mL⁻¹ nAg. Una solución de 1 mol L⁻¹ NaOH se añadió a ratio 1:1 v/v, y las muestras se incubaron 3 h a 37 °C. Los residuos se pesaron y los sobrenadantes se diluyeron 500 veces para sp-ICP-MS.

Evaluación de Cantidad y Propiedades Físicas de nAg₁₀₀ y Ag⁺ en Ratones tras Administración Intravenosa Única

nAg₁₀₀ y AgNO₃ se diluyeron a 0.25 mg mL⁻¹ (Ag⁺) en 5% glucosa. Los ratones recibieron inyecciones intravenosas de nAg₁₀₀ (1.5 o 0.75 mg kg⁻¹), AgNO₃ (1.5 o 0.75 mg kg⁻¹ como Ag⁺), o 5% glucosa (control). Veinticuatro horas post-inyección, se recolectaron muestras de sangre e hígado. Los homogenados de hígado se prepararon en PBS (p/v = 1:10) y luego se trataron con TMAH o NaOH (1:1 v/v) para análisis ICP-MS y sp-ICP-MS.

Resultados y Discusión

Optimización de Detección de Partículas por sp-ICP-MS

El sp-ICP-MS preciso requiere que no más de una partícula entre al plasma durante cada tiempo de permanencia; de lo contrario, múltiples partículas se suman erróneamente como un solo evento, inflando estimaciones de tamaño. Diluimos serialmente nAg₁₀₀ y graficamos conteos de partículas detectados versus teóricos. Mientras concentraciones bajas produjeron relación lineal, concentraciones más altas rindieron menos eventos detectados que lo esperado, indicando interferencia multi-partícula. Restando detectados de teóricos reveló que las desviaciones se volvieron significativas cuando los eventos detectados excedieron 500, estableciendo un umbral práctico para análisis confiable.

La validación con nAg de diámetros variables confirmó que la configuración sp-ICP-MS rindió estimaciones de tamaño precisas: diámetros medidos de 30.0 ± 1.2 nm, 65.1 ± 0.6 nm y 97.4 ± 0.6 nm para nAg30, nAg70 y nAg100, respectivamente. Mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS) (36.4 ± 1.6 nm, 70.6 ± 1.7 nm, 101 ± 1.0 nm) coincidieron estrechamente con resultados sp-ICP-MS, validando el protocolo analítico.

Optimización de Métodos de Pretratamiento para Detectar nAg en Tejido Hepático de Ratón

Un pretratamiento efectivo debe lisar tejido, recuperar ENPs sin alterar su estado físico o químico, y evitar ionización o agregación. Comparamos cinco agentes solubilizantes —NaOH, TMAH, HNO₃, HCl y proteinasa K— usando homogenados hepáticos espicados con 100 ng mL⁻¹ nAg.

El análisis de residuos reveló que NaOH, TMAH y proteinasa K disolvieron >90% de la matriz hepática, mientras que HNO₃ y HCl disolvieron solo ~75%. Dado que ~80% del tejido es agua, la menor disolución por reactivos ácidos indica remoción incompleta de matriz.

Los datos de recuperación sp-ICP-MS mostraron que los tratamientos ácidos ionizaron completamente nAg, mientras que proteinasa K lo ionizó parcialmente. En contraste, NaOH y TMAH preservaron nAg como partículas intactas con detección de iones despreciable. El análisis de distribución de tamaño indicó que el tratamiento TMAH causó un desplazamiento de 100 nm a 120 nm y ensanchó la distribución, sugiriendo agregación. El tratamiento NaOH mantuvo el tamaño original de 100 nm, confirmando su idoneidad.

La tendencia de TMAH a aumentar la constante dieléctrica mediante descomposición en trimetilamina y metanol puede disminuir el potencial zeta de nAg, promoviendo agregación. La exposición corta (1 min) a TMAH, sin embargo, preservó el tamaño de partícula (~100 nm), confirmando que el tratamiento prolongado es responsable de la agregación.

Evaluación de Versatilidad del Pretratamiento NaOH en Varios Órganos

Para confirmar la amplia aplicabilidad de NaOH, aplicamos el protocolo a homogenados de corazón, pulmón, bazo y riñón espicados con nAg. El análisis de residuos mostró >95% de disolución. El sp-ICP-MS detectó el Ag añadido como partículas en todos los tejidos, con tasas de recuperación dentro del rango 80-120% aceptable por estándares FDA. Los diámetros de partícula permanecieron cercanos a 100 nm en todos los órganos, subrayando la consistencia del método.

Estos datos colectivamente confirman que el pretratamiento NaOH proporciona una plataforma robusta y reproducible para cuantificar y caracterizar nAg en diversos tejidos animales vía sp-ICP-MS.

Evaluación de sp-ICP-MS para Análisis Cuantitativo y de Propiedades Físicas de nAg y Ag⁺ en Tejidos Biológicos

Para demostrar relevancia práctica, comparamos el destino de nAg₁₀₀ versus Ag⁺ administrados intravenosamente en sangre e hígado de ratón. El ICP-MS confirmó presencia de Ag en ambos compartimentos para ambos tratamientos. Sin embargo, sp-ICP-MS reveló especiación distinta: en sangre, Ag existió predominantemente como iones (>95%) independientemente de la forma administrada, mientras que en hígado, ~80% de Ag de nAg₁₀₀ permaneció como partículas, con presencia mínima de partículas tras administración de Ag⁺. El análisis de tamaño de partícula de nAg₁₀₀ hepático mostró diámetro medio de ~80 nm, menor que los 100 nm administrados, reflejando ionización parcial y posible transformación dentro del tejido hepático.

Conclusiones

Hemos establecido un protocolo optimizado de pretratamiento NaOH que permite análisis preciso de sp-ICP-MS de nanopartículas de plata en tejidos de ratón, proporcionando cuantificación simultánea y caracterización de tamaño de partícula. La aplicación de este flujo de trabajo a nAg₁₀₀ y Ag⁺ administrados intravenosamente reveló que nAg se ioniza parcialmente in vivo, con ~80% permaneciendo particulado en hígado y ~95% ionizado en el torrente sanguíneo. Estos hallazgos subrayan la importancia de considerar la conversión partícula-ión al evaluar biodistribución y cinética de ENP. El método es ampliamente aplicable a diversos tejidos y puede emplearse en estudios de evaluación de riesgo para elucidar dinámicas de exposición y respuestas biológicas a ENPs.

Abreviaturas

Ag

Plata

Ag⁺

Ión plata

DLS

Dispersión dinámica de luz (Dynamic light scattering)

ENPs

Nanopartículas diseñadas (Engineered nanoparticles)

HCl

Ácido clorhídrico

HNO₃

Ácido nítrico

ICP-MS

Espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (Inductively coupled plasma-mass spectrometry)

nAg

Nanopartículas de plata (Silver nanoparticles)

nAg₁₀₀

nAg de 100 nm

nAg₃₀

nAg de 30 nm

nAg₇₀

nAg de 70 nm

NaOH

Hidróxido de sodio

PBS

Solución salina fosfatada (Phosphate-buffered saline)

sp-ICP-MS

ICP-MS de partícula única (Single particle ICP-MS)

TEM

Microscopio electrónico de transmisión (Transmission electron microscope)

TMAH

Hidróxido de tetrametilamonio (Tetramethylammonium hydroxide)