Las nanopartículas modificadas con hGC33 y cargadas con sorafenib tienen un efecto antihepatoma sinérgico al inhibir la vía de señalización Wnt

Caracterización de NP. un Caracterización TEM de NP, la barra de escala indica 100 nM; b el ¹ Espectros de H RMN de hGC33-PLGA- b sintético -PEG en CDCl3; c Espectros FTIR de hGC33-PEG- b -PLGA y PEG- b - PLGA; d perfiles de liberación acumulativa de SFB-NP y hGC33-SFB-NP en PBS (pH =7,4) a 37 ° C; e cambios de tamaño de las NP incubadas en medio DMEM que contenía FBS al 10% durante 14 d; f cambios de tamaño de las NP incubadas en PBS durante 14 d. SFB, sorafenib; TEM, microscopía electrónica de transmisión; NP, nanopartículas; ¹ H NMR, ¹ Espectroscopia de resonancia magnética nuclear H; FTIR, espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

Expresión de GPC3 y captación de hGC33-cumarina6-NP en células Li-7 y HepG2. Las células, inoculadas en la placa de cultivo, se lavaron con PBS y se incubaron con 100 µg / ml de hGC33-cumarina6-NP en DMEM durante 2, 4 y 8 h. Los núcleos se tiñeron con DAPI y las células se fijaron y detectaron mediante microscopía de barrido láser confocal. No se detectó GPC3 en las células Li-7, pero se expresó en gran medida en las células HepG2 según se detectó mediante inmunocitoquímica. La barra de escala indica 50 μM

Curiosamente, las nanopartículas de hGC33-SFB-NP y SFB-NP en medio DMEM que contenía FBS al 10% (pH =7,4) tuvieron una liberación de fármaco rápida hasta aproximadamente 4 días, luego una liberación de fármaco relativamente lenta y estable; la liberación acumulada de SFB de hGC33-SFB-NP y SFB-NP durante 20 días fue de aproximadamente 77% y 65%, respectivamente (Fig. 1d). La diferencia puede deberse a la molécula hidrófila en la superficie del PEG- b -Matriz de PLGA, que puede acelerar la degradación de las nanopartículas aumentando la hidratación y promoviendo así la hidrólisis. Para determinar la estabilidad de los NP preparados, se colocaron hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP y SFB-NP en medio DMEM que contenía FBS al 10% (pH =7,4) y en PBS (pH =7,4). ). Los tamaños de los distintos NP se mantuvieron estables durante más de 2 semanas. Se liberó SFB de hGC33-SFB-NP de manera sostenida y estable durante 14 días, pero hubo un cambio modesto en el tamaño de las partículas en medio DMEM en comparación con el de FBS al 10% (Fig. 1e, f). La estabilidad de hGC33-SFB-NP sería apropiada para que SFB tenga una función biológica sostenida.

Un gran potencial zeta puede causar una fuerte interacción repulsiva electrostática entre NP y mantener la estabilidad del sistema de dispersión NP [23, 24]. Como se muestra en la Tabla 1, los potenciales zeta de hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP y SFB-NP son - 18,2 ± 2,2 mv, - 18,5 ± 1,8 mv y - 15,9 ± 2,1 mv, respectivamente, que pueden ser causada por las cargas negativas generadas por el grupo aldehído, el grupo carboxilo y el grupo fosfato en la glicoproteína hGC33 del anticuerpo. Los NP cargados negativamente pueden conducir a la alta estabilidad de la suspensión NP. Además, debido a que la superficie de las células está cargada negativamente en entornos fisiológicos normales, las NP preparadas repelen las células con baja carga y son menos tóxicas para los tejidos y las células. Además, la distribución de tamaño de nulo-NP y SFB-NP (índice de polidispersidad [PDI] 0,18 y 0,19, respectivamente) fue leve pero no significativamente menor que la de hGC33-null-NP (PDI =0,21) y hGC33-SFB- NP (PDI =0,23) Por lo tanto, el tamaño de las nanopartículas tiene una buena uniformidad. El tamaño de partícula, la distribución del tamaño de partícula y el potencial zeta de NP se muestran en la Tabla 1 de acuerdo con los resultados de la eficiencia de encapsulación de SFB y el contenido de carga. El anticuerpo GPC3 no conjugado hGC33 se eliminó mediante ultracentrifugación y se evaluó la eficacia de unión del anticuerpo hGC33 a las NP. El análisis de la proteína BCA mostró que la eficiencia de unión del anticuerpo hGC33 a las NP fue del 79,5% ± 2,9%.

hGC33-Coumarin 6-NP se dirige eficazmente a GPC3 ⁺ Células HepG2 de la línea celular HCC

Para averiguar si el anticuerpo hGC33 de las nanopartículas todavía tiene la capacidad de dirigirse específicamente a GPC3, usamos GPC3 ⁺ HepG2 y GPC3 ^- Células Li-7 como células diana y hGC33-cumarina 6-NP como nanopartículas trazadoras, y se incubaron las diferentes células durante 2 h, 4 hy 8 h. Las células se lavaron con PBS 3 veces y se hicieron reaccionar con DAPI para teñir el núcleo. Las células se fijaron y fotografiaron con un microscopio de fluorescencia Leica (DMi8, Alemania). Se encontró que la fluorescencia verde en las células HepG2 era significativamente mayor que la de las células Li-7 en el mismo tiempo de incubación (Fig.2), lo que indica que la cantidad de hGC33-cumarina 6-NP que entra en las células HepG2 fue significativamente mayor que la en celdas Li-7. Los resultados documentaron que el anticuerpo hGC33 en hGC33-Coumarin6-NP todavía tenía la capacidad de apuntar a GPC3 y mediar en la internalización de nanopartículas. La expresión de GPC3 en células HepG2 y células Li-7 se examinó con fluorescencia indirecta y tinción citoquímica. Los resultados mostraron que las células HepG2 sobreexpresaban GPC3, mientras que las células Li-7 no expresaban GPC3 (Fig. 2).

hGC33-Null-NP inhibe la proliferación de células HepG2

Para determinar si la NP modificada con hGC33 (hGC33-null-NP) podría inhibir el crecimiento de HCC, medimos la inhibición del crecimiento celular de la línea celular de HCC positiva para GPC3 HepG2 y la línea celular negativa para GPC3 Li-7. Encontramos que tanto hGC33-null-NP como hGC33 inhibieron el crecimiento de la línea celular de HCC positiva para GPC3 HepG2 después de 24 h de tratamiento, pero hGC33 tuvo un efecto inhibidor más significativo sobre las células HepG2 que hGC33-null-NP (Fig. 3a); por el contrario, hGC33-null-NP y hGC33 no afectaron al crecimiento de la línea celular Li-7 negativa para GPC3 (Fig. 3b). La evolución temporal representativa de hGC33-null-NP (equivalente a 0,1 µm de hgc33) y hGC33 (0,1 µm) en la proliferación de células HepG2 se ilustra en la Fig. 3c. Debido a que hGC33 es un péptido C-terminal que reconoce GPC3, hGC33 es superior a hGC33-null-NP en la inhibición de HepG2. Los resultados sugieren que la molécula hGC33 en hGC33-null-NP puede tener un efecto de bloqueo del espacio, lo que puede afectar la capacidad de unión de hGC33 a los epítopos.

La proliferación de células HepG2 y Li-7 fue inhibida por hGC33, null-NP y hGC33-null-NP. un La prueba de proliferación celular se realizó en células HepG2 positivas para GPC3 tratadas con hGC33, nulo-NP o hGC33-nulo-NP; b Las pruebas de proliferación celular se realizaron en células Li-7 negativas para GPC3 tratadas con hGC33, nulo-NP y hGC33-nulo-NP. Las células se incubaron con hGC33 0-2,5 μM, nulo-NP o hGC33-nulo-NP durante 1 día. La proliferación de las células se midió con el método MTT y se estandarizó como células no tratadas. Todos los valores representan la media ± DE. En comparación con el grupo de control (0 μM) sin tratamiento con anticuerpos, * P <0,01; c los resultados representativos de la respuesta de HepG2 a hGC33, null-NP y hGC33-null-NP en el tratamiento con hGC33 (1.0 μM)

hGC33-Null-NP inhibe el ciclo celular de las células HepG2

Para comprender el mecanismo de la actividad molecular del anticuerpo hGC33 modificado en nanopartículas de hGC33-null-NP, estudiamos la progresión del ciclo celular de HepG2 tratada con hGC33-null-NP. En la línea celular HepG2, hGC33-null-NP y hGC33 aumentaron significativamente la proporción de células en G1 (Fig. 4a, b), lo que indica que tanto hGC33-null-NP como hGC33 podrían inducir la detención del ciclo celular en la fase G1. Además, hGC33-null-NP y hGC33 podrían regular significativamente la expresión de ciclinaD1 en células HepG2 (Fig. 4c, d).

La detención del ciclo celular inducida por hGC33-null-NP y hGC33 en la fase G1 e inhibió la expresión de ciclinaD1 en células HepG2. un Diagrama representativo del ciclo celular de varios grupos tratados con hGC33-null-NP y hGC33. b Análisis del ciclo celular de varios grupos tratados con hGC33-null-NP y hGC33. Las células de HCC se incubaron con 0,5 µm de hGC33 o hGC33-null-NP (con la concentración molar de hGC33 como referencia). * P <0,05, la fase G1 de las células hGC33-null-NP o hGC33 se comparó con la de las células 0 h. c , d Después del tratamiento con hGC33-null-NP o hGC33, la ciclinaD1 se redujo significativamente en las células HepG2 en comparación con la del grupo de control

Activación de Wnt en celdas HepG2, Huh-7 y Li-7

Para comprender la activación de la señal clásica de Wnt / β-catenina en las células de HCC, primero detectamos la expresión del ligando de Wnt y la proteína de rizado del receptor (frizzled, FZD o Frz) en varias líneas celulares de HCC:HepG2 (GPC3 ⁺⁺ ), Huh-7 (GPC ⁺ ) y Li-7 (GPC3 ^- ). Los resultados mostraron que el receptor Wnt3a y FZD de transducir la vía de la β-catenina se expresaron en todas las líneas celulares, especialmente en las células HepG2 y Huh-7 (Fig. 5).

Expresión de Wnt3a, FZD1 y FZD3 en líneas celulares de HCC

hGC33-Null-NP inhibe la proliferación de células dependientes de la transducción de señales de Wnt inducida por Wnt3a

Algunos estudios han demostrado que la parte extracelular de GPC3 puede ser un correceptor de Wnt, que promueve la activación y transducción de la señal de Wnt / β-catenina. Por lo tanto, cuando HepG2 (GPC3 ⁺ ), Huh-7 (GPC3 ⁺ ) y Li-7 (GPC3 ^- ) cells were co-incubated with hGC33 and hGC33-null-NP, the activation of Wnt/β-catenin signal was blocked by hGC33 and hGC33-null-NP, and proliferation of HepG2 and Huh-7, but not Li-7, in Wnt3a-conditioned medium was inhibited. That proliferation of Li-7 cells most likely is due to the absence of GPC3 on the surface of Li-7 cells (Fig. 6). Our results indicate hGC33 and hGC33-null-NP nanoparticles specifically bind to GPC3 molecules on cell membrane. hGC33 and hGC33-null-NP partially neutralize the mitogenic activity of Wnt3a and inhibit the Wnt/β-catenin signaling pathway. However, the inhibition of proliferation by hGC33-null-NP nanoparticles was less than that of hGC33. Perhaps the spatial structure of the nanoparticles interferes with hGC33-null-NP and limits the function of the hGC33 molecule on the nanoparticles so they cannot completely block the interaction between GPC3 and Wnt3a.

GPC3-activated Wnt signal transduction in HCC. Fifty percent Wnt3a DMEM medium was added with anti-wnt3a antibody, hGC33, or hGC33-null-NP. HepG2 (GPC3 ⁺⁺ ), Huh-7 (GPC3 ⁺ ) and Li-7 (GPC3 ⁻ ) cells were co-incubated for 48 h, and cell proliferation was measured by MTT assay. The data were expressed as mean ± SD (*P  < 0.01)

hGC33-Null-NP Inhibits Wnt3a-Induced Signal Transduction in HepG2 and Huh-7 Cells

To understand the effect of hGC33-null-NP on Wnt/β-catenin signaling in HCC cells, we extracted the proteins of HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33 or hGC33-null-NP. The results of western blot showed that after hGC33-null-NP treatment, the levels of pYAP and pβ-catenin were increased, but the levels of YAP and β-catenin were decreased. Furthermore, the levels of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC in the hGC33-null-NP group were lower than those in the control group, but the level was less than with hGC33 treatment. Similar effects were observed in HepG2 and Huh-7 cells, as shown in Fig. 7.

Inhibition of Wnt3a-induced β-catenin signaling by hGC33-null-NP or hGC33. un Compared with the control group, Wnt/β-catenin signaling pathway in HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33-null-NP or hGC33 was inhibited, and the levels of β-catenin and YAP were decreased, while the increased phosphorylated β-catenin and phosphorylated YAP molecules were unstable, and degraded in cytoplasm. The decreased β-catenin was difficult to maintain in the nucleus and drive the expression of CyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC, which resulted in the decrease of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-myc protein levels. b The mechanism pattern of Wnt/β-catenin signaling pathway inhibited by hGC33-null-NP or hGC33

hGC33-SFB-NP or hGC33 Attenuates HCC Cell Migration by Inhibiting Epithelial Mesenchymal Transition (EMT)

HCC is one of the deadliest cancers in the world, and its incidence is steadily increasing. Sorafenib is the only approved standard treatment for patients with advanced HCC, as it has been shown to improve the survival rate of these patients. However, clinical and preclinical observations suggest that sorafenib therapy has limited efficacy due to the rapid development of drug resistance. Therefore, elucidating the mechanism of escape resistance to sorafenib is a major emphasis in HCC research. In recent years, more and more attention has been paid to the role of epithelial mesenchymal transition (EMT) in the progress of HCC and the development of drug resistance. EMT refers to the transformation of epithelial to mesenchymal cells, which endows cells with the ability metastasize and invade, including acquisition of stem cell characteristics, reducing apoptosis and aging, promoting immunosuppression, and participating in the occurrence and development of cancer. The loss of E-cadherin expression is considered a key step in the carcinogenesis and EMT. EMT is a developmental multi-step molecular and cellular reprogramming process that cancer cells use to achieve aggression. This is mainly through down regulating the expression of E-cadherin, keratin, mucin, ZO-1 (tight junction protein); up regulating the expression of vimentin, alpha-smooth muscle actin (α-SMA), FN fibronectin, MMPs (degradation matrix), N-cadherin, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, type I collagen, and type II collagen to achieve the invasion, metastasis, and anti-apoptosis of EMT characteristic tumor. The changes of these protein expressions mainly involve the activation of Wnt/β-catenin and Ras/Raf/MAPK signaling pathways.

Our experiments have shown that hGC33 antibody on the surface of NP vector can inhibit Wnt3a-induced β-catenin signal transduction, and then down regulate the expression of β—catenin, CD44, vascular endothelial growth factor (VEGF), cyclin D1, and c-MYC. Furthermore, hGC33-SFB-NP inhibits the activation of Ras/Raf/MAPK signal pathway and inhibits proliferation and apoptosis of HCC cells. hGC33 and SFB have a synergistic effect, inhibiting EMT and decreasing the migration of HCC cells (Fig. 8).

Effect of hGC33-SFB-NP on EMT inhibition. un Compared with the control group, the hGC33-SFB-NP treatment group had less cell migration. Photographs were taken under an optical microscope (magnification, × 200). The error value represents the standard deviation of three independent experiments. *Compared with the control group, p <0,01. b Compared with the control group, the EMT-related proteins snail, vimentin, and MMP-2 in HCCs treated with hGC33-SFB-NP decreased, whereas E-cadherin increased. c Molecular mechanism of EMT. EMT, epithelial–mesenchymal transition; MMP-2, matrix metalloproteinase-2; SFB, sorafenib; NP, nanoparticle

hGC33-SFB-NP Inhibits the Growth of Hepatocellular Carcinoma In Vivo and Improves the Survival Rate of Tumor-Bearing Mice

To evaluate the anti-tumor activity of hGC33-SFB-NP in vivo, HepG2 and Huh-7 cells were inoculated subcutaneously into the right abdomen and dorsal side of female BALB/c nude mice, respectively. When the tumor xenograft growth reached about 30 mm ³ , the mice were randomly divided into groups to further evaluate the inhibition of each group (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, free SFB, and control group) HCC effect (n  = 5 per group). It can be seen from Fig. 9a, b that hGC33-SFB-NP significantly slowed tumor growth in mice compared with the PBS control and other treatments. Compared with the PBS control, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, and free SFB also had some inhibition of HCC, which is because free hGC33 and free SFB directly inhibit Wnt signal and Ras/Raf/MAPK, respectively. Such pathways can inhibit the proliferation of HCC cells to a certain extent. Although the nanoparticle-modified hGC33 (hGC33-null-NP) is connected to the nanosurface through chemical bonds, it did not affect hGC33′s targeting of GPC3 molecules and inhibition of Wnt activity. Nanoparticle-loaded SFB (SFB-NP), after being endocytosed by cells, was degraded to release SFB from the copolymer to inhibit the growth of HCC. In all, the inhibitory effect of hGC33-SFB-NP on HepG2 cell grafts was, as expected, more than on Huh-7 cell grafts, probably because HepG2 expresses GPC3 molecules.

The effect of hGC33-SFB-NP on xenotransplantation of HCC in nude mice and the changes of mice weight. Liver cancer cells were inoculated subcutaneously on the back of each nude mouse (n =10). After 10 days, the tumor bearing mice were treated with PBS (control), free hGC33, free SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP, and hGC33-SFB-NP. Tumor size (a , b ) and body weight (c , d ) of mice were monitored at designated time points

The body weight of nude mice in each treatment group also was measured, as shown in Fig. 9c, d. The body weight of the control group decreased gradually. The weight of mice in free hGC33, free SFB, SFB-NP, and hGC33-null-NP treatment groups also decreased progressively and not significantly less than in the control group. However, the weight of nude mice bearing HepG2 and Huh-7 treated with hGC33-SFB-NP only slightly decreased, and the weight remained relatively stable during the treatment cycle. These results support that the novel hGC33-SFB-NP nanodrug has no significant toxicity in nude mice, and the SFB loaded on the nanocarrier and the surface modified hGC33 can produce additive or even synergistic anti-tumor effect.