Nanopartículas de óxido de gadolinio funcionalizadas con ácido hialurónico para radioterapia de tumores guiada por resonancia magnética

Resumen

La localización inexacta y la radiorresistencia intrínseca de los tumores sólidos obstaculizaron seriamente la implementación clínica de la radioterapia. En este estudio, fabricamos nanopartículas de óxido de gadolinio funcionalizadas con ácido hialurónico (HA-Gd ₂ O ₃ NP) a través de un proceso hidrotermal en un solo recipiente para obtener imágenes de resonancia magnética (MR) y radiosensibilización de tumores efectivas. En virtud de la funcionalización de HA, el HA-Gd ₂ preparado O ₃ Las NP con un diámetro de 105 nm mostraron una dispersabilidad favorable en agua, una citotoxicidad baja y una biocompatibilidad excelente y entraron fácilmente en el citoplasma de las células cancerosas mediante endocitosis mediada por el receptor de HA. Es importante destacar que HA-Gd ₂ O ₃ Los NP exhibieron una alta relajación longitudinal ( r ₁ ) 6,0 mM ⁻¹ S ⁻¹ como agentes de contraste de resonancia magnética y mejora de la radiosensibilización de una manera dependiente de la dosis. Estos hallazgos demostraron que HA-Gd ₂ sintetizado O ₃ Los NP como agentes teranósticos bifuncionales tienen un gran potencial en el diagnóstico de tumores y la radioterapia.

Introducción

La radioterapia se ha aplicado ampliamente en el cáncer, lo que implica rayos X de alta energía y el depósito de dosis de irradiación en los sitios del tumor causando daño de los radicales libres o daño del ADN [1, 2, 3, 4]. Sin embargo, la escasa radiosensibilidad, la inexactitud de la localización del tumor y la escasa discriminación entre las lesiones y los tejidos normales que causan efectos secundarios de la irradiación limitan la implementación clínica de la radioterapia [5]. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos para mejorar la radiosensibilidad del tumor mientras se minimizan los efectos secundarios sistémicos. Una combinación de nanotecnología y radioterapia es una prioridad bien establecida para la radiosensibilización.

En los últimos años, la nanotecnología se ha considerado una estrategia atractiva para el diagnóstico y la terapia del cáncer [6,7,8,9,10,11]. Una de las funciones principales de las nanopartículas (NP) es la focalización precisa del tumor basada en la acumulación selectiva de NP en los tejidos tumorales mediante la focalización pasiva, el efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR), la focalización activa y el tiempo de circulación prolongado [12, 13,14]. Nuestro trabajo anterior demostró que el dopaje de NP de carbono con heteroátomos sintoniza eficazmente sus propiedades intrínsecas e introduce características beneficiosas [15, 16, 17]. Curiosamente, los NP se pueden utilizar como radiosensibilizadores [18]. Los NP de metales pesados (con elementos Z altos) (p. Ej., Au, Bi, Gd) como radiosensibilizadores prometedores se pueden utilizar en la terapia de radiosensibilización debido a su alta sección transversal de captura de fotones de rayos X y al efecto de dispersión de Compton [19]. Cuando los rayos X interactúan con nanopartículas de alta Z, electrones Auger y fotoelectrones, la liberación de electrones secundarios daña las células cancerosas, lo que aumenta la dosis durante la radioterapia [20]. Hasta la fecha, se ha demostrado que los NP basados en gadolinio (GdNP) son agentes de contraste (CA) eficaces para la resonancia magnética [21, 22] y diferencian el tejido normal del tejido enfermo y las lesiones de forma no invasiva y en tiempo real. Estos agentes acortan el tiempo de relajación longitudinal para afectar la relajación longitudinal r ₁ [23], y su orientación inexacta con frecuencia resulta en efectos secundarios. Es bien sabido que el ácido hialurónico (HA) es un ligando importante y un portador de administración de fármacos a los sitios diana con receptores HA como el determinante de agrupamiento 44 (CD44) [24, 25, 26].

Basándonos en los resultados de estudios previos, usamos HA como ligando de focalización para funcionalizar Gd ₂ O ₃ NP con funciones duales:CA de resonancia magnética y radiosensibilizadores eficaces que se dirigen a tumores para superar la radiorresistencia inherente y la inexactitud de la localización del tumor. Además, HA-Gd ₂ O ₃ Los NP muestran una alta relajación longitudinal ( r ₁ ) como agentes prometedores de imágenes de resonancia magnética con mejor calidad de imágenes de resonancia magnética. En comparación con las CA actualmente disponibles [27, 28], el HA-Gd ₂ resultante O ₃ Los NP muestran tres ventajas significativas:en primer lugar, el HA-Gd ₂ O ₃ Las NP exhiben una biocompatibilidad favorable debido al uso de la matriz extracelular natural como precursores. En segundo lugar, la funcionalización de HA mejora significativamente la focalización del tumor y reduce los efectos secundarios. Finalmente, el HA-Gd ₂ O ₃ Los NP poseen capacidad bifuncional en diagnóstico y terapia. Para verificar la efectividad y explorar el mecanismo de mejoras de radiosensibilización, evaluamos el efecto radiosensibilizador de HA-Gd ₂ O ₃ NP sobre la viabilidad de las células tumorales, el ciclo celular y la apoptosis.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de HA-Gd ₂ O ₃ NP

En este estudio, HA-Gd ₂ O ₃ Las NP se prepararon con éxito utilizando un proceso hidrotermal simple como se muestra en el Esquema 1. Los tamaños de partículas se analizaron mediante dispersión dinámica de luz, mientras que el examen morfológico se realizó mediante microscopía electrónica de transmisión. Como se muestra en la Fig. 1a, HA-Gd ₂ O ₃ Los NP exhibieron una dispersión uniforme y formas cuasi esféricas discretas sin agregación aparente. Los diámetros promedio de HA-Gd ₂ O ₃ Los NP fueron de 105 nm. En comparación con los tejidos normales, la permeabilidad endotelial capilar de los tejidos tumorales aumentó y la brecha endotelial fue de 100-600 nm [29]. Por lo tanto, los NP con tamaños deseables se sumergieron fácilmente en los tejidos tumorales y pueden aumentar drásticamente la eficiencia de la administración de fármacos dirigidos pasivamente.

Síntesis esquemática de HA-Gd ₂ O ₃ NP del método hidrotermal (A) y las siguientes aplicaciones biomédicas (B)

Caracterización de HA-Gd ₂ O ₃ NP. Bajo ( a ) y alto ( b ) magnificación de imágenes TEM. La distribución de diámetro ( c ) y patrones XRD ( d ) de HA-Gd ₂ O ₃ NP

La estructura de fase de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP se investigaron mediante XRD utilizando energía de óxido de grafito (GO) como control. Como se muestra en la Fig. 1d, un pico de difracción principal (2 θ =12.04 °) y dos picos menores (2 θ =29,6 °, 42,1 °) se observaron en HA-Gd ₂ O ₃ Patrón de difracción NP, que correspondía a los picos característicos de GO (plano 100) y grafito (plano 002), respectivamente. El espaciado de celosía principal de HA-Gd ₂ O ₃ Los NP mostraron un espaciado más pequeño (0,73 nm calculado mediante la fórmula de Bragg) que el espaciado GO de d ₀₀₁ =0.85 nm, donde el cambio hacia arriba en la posición del pico puede atribuirse a la disminución en el espacio entre el sp ³ capas. Todos los picos de difracción amplios demostraron que HA-Gd ₂ O ₃ Los NP tenían una estructura amorfa, que puede atribuirse al carbono altamente desordenado y la disminución de sp ² (C – C) espaciamiento de capas durante el proceso de carbonización. El resultado indicó además HA-Gd ₂ O ₃ Los NP con una naturaleza cristalina pobre poseían una estructura heterogénea de múltiples capas, que era consistente con nuestros informes anteriores sobre puntos de carbono [30, 31].

Estructura química y composición de la superficie de HA-Gd ₂ O ₃ NP

Grupos funcionales de superficie y composición de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP se investigaron utilizando el espectro infrarrojo por transformada de Fourier y la espectroscopia de fotoelectrones de rayos X. Como se muestra en la Fig. 2a, el espectro XPS mostró cuatro picos típicos a 284.0, 400.0, 530.6 y 1188.5 eV, lo que indica que HA-Gd ₂ O ₃ Las NP estaban compuestas principalmente por elementos gadolinio, carbono, oxígeno e hidrógeno. El espectro de alta resolución de Gd _{3 d} (Fig. 2b) reveló la presencia de dos picos fuertes a 1187.5 eV y 1221 eV, correspondientes a una división de espín-órbita de 32 eV, correspondientes respectivamente a los 3 d _5/2 y 3 d _3/2 niveles de energía de Di-s. Estas observaciones concuerdan bien con informes anteriores de HA-Gd ₂ O ₃ NP. La O (1 s ) El espectro que se muestra en la Fig. 2c estaba dominado por un pico principal posicionado en 531,4 eV, que correspondía al enlace entre O ²⁻ y Gd ³⁺ . La espectroscopía FITR se realizó tanto para desnudos como para HA-Gd ₂ O ₃ Muestras de NP (Fig. 2d). Para las muestras desnudas, como se muestra en la Fig. 2a, las bandas de absorción características de v _como O – C – O a 1580 y 1380 cm ⁻¹ reveló la presencia de un grupo carbonato. Los picos anchos a 3340 y 2900 cm ⁻¹ se atribuyeron a las vibraciones de estiramiento O – H y C – H, respectivamente, que correspondían al agua adsorbida en la superficie. Para HA-Gd ₂ O ₃ NP, las vibraciones de estiramiento del COO ^- a 1580 y 1380 cm ⁻¹ se mejoraron, lo que indica la introducción del grupo carboxílico del ácido hialurónico. Estos resultados revelaron que los grupos funcionales de HA-Gd ₂ O ₃ Los NP contenían principalmente ciertos numerosos grupos carbonilo, carboxilato e hidroxilo. La presencia de estos grupos funcionales ubicados en la superficie dotó a HA-Gd ₂ O ₃ NP con excelente dispersabilidad en agua. Es importante destacar que el ión Gd incrustado en la superficie de las NP puede ser útil para la obtención de imágenes por resonancia magnética y la radiosensibilización, lo que evitó drásticamente que el ión Gd se filtrara a los entornos circundantes.

La estructura química y composición de HA-Gd ₂ O ₃ NP. un El espectro XPS de escaneo completo de HA-Gd ₂ O ₃ NP. b Di _3d espectro. c O _1S espectro. d El espectro FTIR de HA-Gd ₂ O ₃ NP

Biocompatibilidad de HA-Gd ₂ O ₃ NP

Biocompatibilidad de HA-Gd ₂ O ₃ Los NP, como posibles agentes biomédicos, son fundamentales para su aplicación biomédica. Primero, la citotoxicidad inherente de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP se evaluaron en células HepG2 y VSMC usando el ensayo CCK-8. Como se muestra en la Fig. 3a y S. Fig. 1, el HA-Gd ₂ O ₃ Los NP no mostraron citotoxicidad obvia hasta los 3 días. Incluso a una concentración de 200 μg / mL después de un tiempo de exposición de 24 h, la viabilidad celular fue aproximadamente del 90%. En segundo lugar, la hemocompatibilidad de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP in vivo se estimaron mediante un ensayo de hemólisis. Como se muestra en la Fig. 3b, observamos hemólisis de glóbulos rojos en el agua (control positivo). Por el contrario, no se observó hemólisis obvia después de HA-Gd ₂ O ₃ Incubación de NP a diferentes concentraciones de 0 a 200 μg / mL durante 2 h, lo que fue similar a los resultados de la solución de PBS (control negativo). En comparación con el control negativo, el porcentaje de hemólisis a diferentes concentraciones de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP se evaluaron ligeramente basándose en la absorbancia del sobrenadante a 541 nm. Los resultados mostraron que los porcentajes de hemólisis de HA-Gd ₂ O ₃ Los NP fueron todos inferiores al 3% en la concentración estudiada, comprobando su hemocompatibilidad favorable. Para examinar la toxicidad potencial, HA-Gd ₂ O ₃ Se inyectaron NP por vía intravenosa en ratones Balb / c (como se ve en S. Fig. 2). Después de 1 semana, se ejecutaron estos ratones y se extrajeron la vejiga, el riñón y el bazo para el análisis de la sección patológica. Como se muestra en S. Fig. 2, el resultado de las secciones patológicas mostró que no había una lesión o respuesta inflamatoria observable en los órganos de HA-Gd ₂ O ₃ Ratones tratados con NP. Estos resultados indicaron claramente que el HA-Gd ₂ sintetizado O ₃ Los NP tenían una citocompatibilidad favorable y una buena hemocompatibilidad.

un Efecto de HA-Gd ₂ O ₃ NP sobre la viabilidad de las células HepG2 y VSMC utilizando el ensayo CCK-8. b Actividad hemolítica de HA-Gd ₂ O ₃ NP a diferentes concentraciones (50, 100, 200, 300 y 400 μg / mL). Se utilizaron PBS y agua como control negativo y positivo, respectivamente

Estudio fantasma de resonancia magnética

El longitudinal ( T ₁ ) tiempos de relajación de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP se investigaron in vitro junto con el contraste comercial Magnevist (Gd-DTPA) como control utilizando solución salina tamponada con fosfato (pH =7,4, 0,2 M). Con concentraciones crecientes de Gd, la intensidad de la señal de T ₁ -Las imágenes fantasma de peso aumentaron claramente, lo que indica que todas las muestras podrían generar una mejora del contraste de resonancia magnética en T ₁ -secuencias ponderadas (Fig. 4a). Además, los gráficos de la intensidad de la señal frente al tiempo de inversión dieron T ₁ -Tiempos de relajación de cada agente de contraste a concentraciones específicas. Como se muestra en la Fig. 4b, el r ₁ valor de HA-Gd ₂ O ₃ Se midió que el NP era de 6,0 mM ⁻¹ S ⁻¹ , que fue significativamente más alto que el de Magnevist (3,86 mM ⁻¹ S ⁻¹ ) en las mismas condiciones. La r mejorada ₁ puede atribuirse al radio hidrodinámico y al área de superficie mucho más altos de HA-Gd ₂ O ₃ NP; por lo tanto, más átomos de Gd dopados en la red de NP se volvieron accesibles a las moléculas de agua, acortando la relajación longitudinal y mejorando la r ₁ valor.

un T ₁ imágenes fantasma del HA-Gd ₂ O ₃ NP con diferentes concentraciones de iones Gd totales. b Los gráficos correspondientes de 1 / T ₁ contra concentraciones de iones totales de Gd. c In vivo T ₁ Imágenes por RM y análisis de ratones después de la inyección intravenosa de HA-Gd ₂ O ₃ NP como agentes de contraste. d Cuantificación de los cambios de señal (relación SNR) en la vejiga y el riñón en diferentes momentos después de la administración ( n =3). * p <0.05

Imágenes de RM en vivo

Con el fin de determinar las aplicaciones potenciales in vivo, el rendimiento de las imágenes de resonancia magnética y el destino de la circulación de HA-Gd ₂ O ₃ Se investigaron las NP (10 mg / kg) utilizando un escáner de resonancia magnética con ratones BALB / c normales como modelo. En comparación con las imágenes previas a la inyección (Fig. 4c), las regiones más brillantes del riñón y la vejiga, como lo indican los círculos punteados, se observaron claramente a los 10 minutos posteriores a la inyección, lo que demuestra que HA-Gd ₂ O ₃ Los NP podrían usarse como CA para mejorar T ₁ relajación en estos órganos principales in vivo. Es importante destacar que la mejora del contraste de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP se mantuvieron hasta 60 minutos después de la inyección, que fue mucho más prolongada que la de las moléculas pequeñas del complejo Gd (vida media de aproximadamente varios minutos en animales pequeños) [27], lo que indica que HA-Gd ₂ O ₃ Los NP poseían tiempos de retención in vivo más prolongados que el contraste comercial. Para analizar cuantitativamente el efecto de contraste de RM, calculamos la relación señal-ruido (SNR) analizando con precisión las regiones de interés de las imágenes de RM y calculamos los valores de SNR _post / SNR _pre para representar la mejora relativa de la señal (RSE) (Fig. 4d). Los valores RSE de HA-Gd ₂ O ₃ Los NP en el riñón fueron 1,35, 1,99 y 1,86. De manera similar, los valores RSE de HA-Gd ₂ O ₃ Los NP en la vejiga fueron más altos que los del riñón (1,29, 3,59 y 2,26). HA-Gd ₂ O ₃ Los NP de gran tamaño (más de 100 nm) presentan tiempos de circulación prolongados, por lo que pueden eliminarse por vía biliar-intestinal de acuerdo con resultados previos [32]. Además, el tiempo de circulación prolongado in vivo puede haber aumentado la focalización pasiva en los tumores al mejorar el efecto EPR.

Imágenes del tumor

HA-Gd ₂ O ₃ Los NP con un rendimiento de imagen de resonancia magnética excelente y un tiempo de circulación prolongado brindan una gran oportunidad para obtener imágenes de tumores a través de un efecto EPR. Por lo tanto, establecimos modelos de tumores hepáticos subcutáneos para investigar si los carcinomas hepatocelulares (CHC) pueden ser detectados por HA-Gd ₂ O ₃ Resonancia magnética mejorada con NP. Después de la inyección intravenosa de HA-Gd ₂ O ₃ NPs, observamos que la región del tumor subcutáneo se vuelve más brillante que el tejido circundante como se ve por la exploración coronal y transversal (Fig. 5a). El RES del tumor subcutáneo alcanzó dramáticamente 1,54 y 1,83 con escaneo transversal y coronal, respectivamente, lo que indica la acumulación efectiva de HA-Gd ₂ O ₃ NP en la región tumoral a través del efecto EPR. Estos hallazgos demuestran que HA-Gd ₂ O ₃ Los NP son muy sensibles para la visualización de tumores por resonancia magnética. Muchos estudios demostraron que el tiempo de circulación prolongado podría promover la eficacia de la focalización pasiva a través de la vasculatura con fugas de los tumores sólidos [33].

T ₁ RM ponderada ( a ) y el análisis cuantificativo correspondiente ( b ) de tumores de xenoinjerto de cáncer de hígado de ratón Heps después de la inyección intravenosa de HA-Gd ₂ O ₃ NP

Mejora de la radiosensibilización de HA-Gd ₂ O ₃ NP

El excelente rendimiento de HA-Gd ₂ O ₃ NP como T ₁ El agente de contraste nos impulsó a determinar su ubicación en la radiosensibilización de tumores con precisión. En primer lugar, se exploró si se produjo una mejora de la dosis con este tratamiento de combinación utilizando un ensayo CCK-8. Como se muestra en la Fig. 6a, un solo HA-Gd ₂ O ₃ Las NP (concentración 0-200 μg / mL) no influyeron significativamente en la viabilidad de HepG-2, pero la irradiación de rayos X (rango 0-9 Gy) disminuyó la viabilidad de las células HepG-2 a menos del 70% a 9 Gy. Es importante destacar que una combinación de irradiación de rayos X con HA-Gd ₂ O ₃ Las NP disminuyeron drásticamente la viabilidad de las células HepG-2 a menos del 50%, particularmente a una concentración de 200 μg / ml a 9 Gy. A continuación, se realizó un ensayo clonogénico para evaluar la viabilidad celular en células HepG-2 después de una combinación de irradiación de rayos X y HA-Gd ₂ O ₃ NP. Como se muestra en la Fig. 6b, solo HA-Gd ₂ O ₃ Las NP no tuvieron una influencia dramática en la formación de colonias de células HepG-2, pero la irradiación de rayos X disminuyó la formación de colonias de células HepG-2 al 46,7%. Sin embargo, el tratamiento con irradiación de rayos X y HA-Gd ₂ O ₃ Las NP inhibieron notablemente la viabilidad de la formación de colonias celulares hasta un 29,8%. Las imágenes correspondientes verificaron aún más la radiosensibilización de HA-Gd ₂ O ₃ NP contra células HepG-2.

El efecto de radiosensibilización de HA-Gd ₂ O ₃ NP in vitro. un El efecto sinérgico de HA-Gd ₂ O ₃ NP (0 μg / mL, 12.5 μg / mL, 25 μg / mL, 50 μg / mL, 100 μg / mL y 200 μg / mL) y radiación de rayos X (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy y 9 Gy) sobre la viabilidad de las células HepG2 utilizando el ensayo CCK-8. * p <0.05, ** p <0,01, la diferencia fue estadísticamente significativa. b Los ensayos de supervivencia de colonias de células HepG2 tratadas con HA-Gd ₂ O ₃ NP y radiación de rayos X y c el correspondiente análisis cuantitativo de las capacidades de clonegénesis. d Curvas de crecimiento del volumen tumoral de diferentes grupos de ratones después de diferentes tratamientos. Grupos: a control, b radiación, c HA-Gd ₂ O ₃ NP y d radiación + HA-Gd ₂ O ₃ NP. e Fotos de tumores recolectadas de diferentes grupos de ratones al final del tratamiento

La eficacia de la radioterapia in vitro nos animó a aplicar HA-Gd ₂ O ₃ NP combinadas con la irradiación para controlar el crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores. Los volúmenes de tumores en el control y solo HA-Gd ₂ O ₃ Los tratamientos con NP crecieron rápidamente y ambos aumentaron en un 180%. En comparación con los tratamientos de irradiación única 58%, HA-Gd ₂ O ₃ Las NP combinadas con radiación mostraron una inhibición tumoral eficaz en un 38% después de 10 días de irradiación (Fig. 6d). Se fotografió el tumor y los volúmenes tumorales promedio en cada grupo mostraron que el volumen tumoral promedio en el grupo (a) era el más alto mientras que el del grupo (d) era el más bajo entre todos los grupos (Fig. 6e). Estos resultados revelan que el HA-Gd ₂ preparado O ₃ Las NP son prometedoras para la inhibición del crecimiento de tumores bajo irradiación de rayos X.

Se llevaron a cabo un ensayo de citometría de flujo y un ensayo de tinción en vivo / muerto para comprender mejor el mecanismo de radiosensibilización en el tratamiento combinado de HA-Gd ₂ O ₃ NP y radiación de rayos X. Como se muestra en la Fig. 7a, se observó una fluorescencia verde intensa sin rojo en las células HepG-2 tratadas con una sola HA-Gd ₂ O ₃ NP, que verificó alta viabilidad celular. Se observó una pequeña cantidad de fluorescencia roja después de los tratamientos de radiación de rayos X, lo que indica un bajo nivel de apoptosis celular. Sin embargo, se observó una fuerte fluorescencia roja después del tratamiento combinado de HA-Gd ₂ O ₃ NP (200 μg / mL) y radiación, lo que demuestra que HA-Gd ₂ O ₃ Las NP podrían mejorar drásticamente la apoptosis celular inducida por radiación de rayos X. El mecanismo de radiosensibilización de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP se investigaron más a fondo mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 7b, radiación única y HA-Gd ₂ O ₃ Los NP indujeron el 27,55% y el 19,12% de la detención de la fase G2 / M, respectivamente. Sin embargo, el tratamiento combinado de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP y la radiación aumentaron notablemente la detención de la fase G2 / M, oscilando entre el 30,89 y el 33,27% de forma dependiente de la dosis. Mientras tanto, el tratamiento combinado indujo la muerte celular apoptótica del 10,63 al 22,67%, como se refleja en las proporciones sub-G1 cuando el único HA-Gd ₂ O ₃ NP y radiación inducida 3,02% y 13,87%. Para investigar más a fondo el posible mecanismo de muerte celular, se llevó a cabo un método de anexina V-EGFP / PI mediante la citometría de flujo. La señal de emisión de anexina V-EGFP se trazó en la x -eje, mientras que la señal de emisión de PI se trazó en el y -eje (Fig. 8). Las cantidades de células de necrosis, células de apoptosis temprana, células de apoptosis tardía y células vivas se determinaron mediante el porcentaje de anexina V ^- / PI ⁺ (Q3), anexina V ⁺ / PI ⁺ (Q2) y Annexin V ^- / PI ^- (Q4), respectivamente. El porcentaje apoptótico de las células en el grupo de control y HA-Gd ₂ individual O ₃ El grupo NP (100 μg / mL) fue menor al 5%, lo que resultó en una influencia sutil. En comparación con los grupos de tratamiento con radiación única (8,8%), la tasa de apoptosis de la combinación de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP y la radiación aumentaron con el aumento de la concentración en un rango de 50 a 200 μg / mL. Especialmente, la tasa de apoptosis temprana de las células aumentó obviamente al 33,2%, y la apoptosis temprana y tardía alcanzó el 44,3% cuando la concentración es de 200 μg / ml. Generalmente, la combinación de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP y la irradiación de rayos X tuvieron un efecto sinérgico sobre la formación de colonias celulares, la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis y el efecto de mejora de la radiosensibilización. Según estos resultados, HA-Gd ₂ O ₃ Los NP pueden ser una alternativa eficaz para mejorar la radiosensibilización para la radioterapia.

Mejora de la dosis de radiación de HA-Gd ₂ O ₃ NP. un Tinción viva-muerta de células HepG2. Verde (tinción de diacetato de fluoresceína) =células vivas, rojo (tinción de yoduro de propidio) =células muertas. Barras de escala =200 mm. b La distribución del ciclo celular después de diferentes tratamientos se analizó cuantificando el contenido de ADN mediante un ensayo de citometría de flujo

Los análisis de apoptosis de HA-Gd ₂ O ₃ NP. un Los niveles de apoptosis de las células HepG-2 a las 24 h del tratamiento con radiación de rayos X. b El análisis cuantitativo correspondiente

Conclusiones

En conclusión, desarrollamos un HA-Gd ₂ bifuncional O ₃ NP para una resonancia magnética eficaz y radiosensibilización de tumores en un proceso hidrotermal de un solo recipiente. Después de recubrir con HA, el HA-Gd ₂ sintetizado O ₃ Los NP exhibieron una dispersabilidad favorable en agua, excelente biocompatibilidad. El HA-Gd ₂ resultante O ₃ Las NP que encapsulan los átomos de Gd no solo exhibieron efectivamente una alta relajación longitudinal ( r ₁ ) para resonancia magnética como T ₁ agente de contraste, sino que también mejora la radiosensibilidad de los tumores al inducir la apoptosis celular y bloquear el ciclo celular como radiosensibilizador. Así, la novela HA-Gd ₂ O ₃ Los NP muestran un potencial prometedor para el diagnóstico de tumores y la radioterapia.

Materiales y métodos

Materiales

El diacetato de fluoresceína (FDA) y el yoduro de propidio (PI) se adquirieron de Sigma (Nueva York, NY, EE. UU.). GdCl ₃ · 6H ₂ O, etilenglicol (99%) se adquirió de Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, República Popular de China). El Cell Counting Kit-8 (CCK-8) se compró en Dojindo (Kumamoto, Japón). NaH ₂ PO ₄ , Na ₂ HPO ₄ y H ₂ SO ₄ se obtuvieron del Instituto de Investigaciones de Química Fina de Guangfu (Nankai, Tianjin, República Popular de China). El suero fetal bovino y el medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) se compraron a Invitrogen China Limited (Shanghai, República Popular de China). Todos los productos químicos eran de calidad analítica y se utilizaron sin purificación adicional.

Síntesis de HA-Gd ₂ O ₃ NP

El HA-Gd ₂ O ₃ Los NP se prepararon utilizando un enfoque hidrotermal de un solo recipiente de la siguiente manera:Primero, se disolvieron 0,1 g de HA en 20 ml de agua con agitación vigorosa a temperatura ambiente durante la noche. Posteriormente, 0,1 g de GdCl ₃ · 6H ₂ Se añadieron O y 0,5 ml de NaOH (1 M), respectivamente. Luego, la mezcla se agitó durante otros 5 min para formar una solución transparente homogénea y se transfirió a un autoclave de 50 ml, se selló y se trató hidrotermalmente a 120ºC durante 6 h. Después de enfriarse a temperatura ambiente de forma natural, la suspensión transparente se filtró con una membrana de 0,22 µm para eliminar cualquier aglomeración de gran tamaño. A continuación, la solución preparada se dializó frente a agua durante 3 días en una bolsa de diálisis con un límite de peso molecular de 14 kDa. La solución de diálisis se recogió y se liofilizó usando un liofilizador de vacío. El HA-Gd ₂ O ₃ Se obtuvieron así polvos de NP y se guardaron para su posterior caracterización.

Instrumentación y caracterizaciones

Las morfologías del HA-Gd ₂ O ₃ Los NP se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución en un microscopio JEM-2100 (JEOL, Tokio, Japón) bajo un voltaje de aceleración de 200 kV. La composición elemental de HA-Gd ₂ O ₃ Los NP se determinaron mediante mediciones de XPS en un espectrómetro de fotoelectrones MK II, utilizando Al-Ka (1486,6 eV) como fuente de rayos X y espectrómetro de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, EE. UU.). La estructura cristalina del HA-Gd ₂ O ₃ Las NP se caracterizaron mediante patrones de difracción de rayos X (XRD) en un difractómetro Rigaku-D / MAX2500 (Rigaku, Japón) equipado con Cu Kα ( λ =0,15405 nm) de radiación a una velocidad de exploración de 4 ° / min en el rango de 5 a 80 °.

Ensayo de viabilidad celular

La influencia de HA-Gd ₂ O ₃ Las NP sobre la viabilidad celular se estudiaron mediante el ensayo Cell Counting Kit CCK-8 (ensayo CCK-8). Se sembraron HepG2 (hepatocarcinoma humano, número ATCC:HB-8065) y VSMC (células de músculo liso vascular) en una placa de 96 pocillos a una densidad de 3 × 10 ³ células / pocillo y cultivado a 37 ° C en 5% CO ₂ incubadora durante 24 h, luego usando DMEM que contiene diferentes concentraciones de HA-Gd ₂ O ₃ NP (0 μg / mL, 25 μg / mL, 50 μg / mL, 100 μg / mL y 200 μg / mL) reemplazando el medio de crecimiento. Después de la incubación durante otras 4 h, agregando 10 μL de solución de CCK-8 a cada pocillo, las células se incubaron durante 4 h en un lugar oscuro. La absorbancia se midió a 490 nm usando el lector de microplacas multimodo Synergy HT (Bio Tek, Winooski, VT, EE. UU.). Se utilizaron células no tratadas (en DMEM) como control y la viabilidad celular relativa (media DE, n =5) se expresó como Abssample / Abscontrol × 100%.

Ensayo de hemólisis

Brevemente, las normas de manejo animal del Ministerio de Salud de la República Popular China prepararon amablemente ratones BALB / c hembra de 19 a 21 g de 6 semanas de edad. Se obtuvieron tres mililitros de sangre que se estabilizó con heparina sódica al extraer los globos oculares. Luego, se centrifugó para remover el sobrenadante a 1200 rpm, 15 min según la literatura. Después de eso, lavar la sedimentación con PBS cinco veces para obtener los glóbulos rojos de ratón (MRBC), luego tomar alrededor de 3 ml de sangre extrayendo el globo ocular, estabilizado con heparina sódica, centrifugado (1, 200 rpm, 15 min) para eliminar el sobrenadante de acuerdo con la literatura [27], se lavó con PBS cinco veces para obtener los glóbulos rojos de ratón (MRBC). Diluyendo diez veces con PBS, se transfirieron 0,1 ml de MRBC a tubos de 1,5 ml precargados con 0,9 ml de PBS que contenían diferentes concentraciones de partículas (50-200 μg / ml) de HA-Gd ₂ O ₃ NP, 0,9 ml de agua (como control positivo) y 0,9 ml de PBS (como control negativo), respectivamente. La mezcla se incubó durante 2 ha temperatura ambiente después de una suave agitación, luego se centrifugó a 12.000 rpm durante 1 min. Finalmente, se tomaron las fotografías de todas las muestras y se midió la absorbancia del sobrenadante (hemoglobina) mediante un espectrofotómetro UV-2450 UV-Vis. Los porcentajes de hemólisis de diferentes muestras se calcularon dividiendo la diferencia de absorbancia entre la muestra, el control positivo y negativo a 541 nm.

Estudio fantasma de RM in vitro e in vivo

In vitro and in vivo MR images were acquired on 3 Tesla MRI scanner (Magnetom Trio Tim, Siemens, Germany). To study the T ₁ phantom images in vitro, the solution of HA-Gd₂ O ₃ NPs with different concentrations ranging from 0 to 16 mM was added to a 96-well culture plate, using the Magnevist (commercial MR contrast agent, Gd-DTPA) as control. For MR imaging in vivo, we chose the normal BALB/c mice as the model (n =4). Animal experiments were strictly conformed to the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. Ten milligrams per kilogram of HA-Gd₂ O ₃ NPs filtering through sterilized membrane filters (pore size 0.22 μm) were intravenously injected into the animals, then immediately investigated with a MRI scanner. These samples for MR imaging in vitro and animals in vivo were imaged with the following parameters:TR/TE =300/10 ms, 256 × 256 matrices, slices =5, thickness =2 mm, averages =2, FOV =80 × 80.

Radiosensitization Effect In Vitro

CCK-8 assay was used to evaluate radiosensitizing activity of HA-Gd₂ O ₃ NPs in vitro. Cells were seeded in five 96-well plates at a density of 3 × 10³ cells/well, and each plate was treated at the same condition:cultured at 37 °C in 5% CO₂ incubator for 24 h, then using DMEM containing different concentrations of HA-Gd₂ O ₃ NPs (0 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, and 200 μg/mL) replacing the growth medium. After incubation for 4 h, five plates were irradiated at different X-ray doses (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, and 9 Gy), 300 cGy/min, respectively. After radiation, all the plates were incubated for 4 h, then measuring the absorbance under the same parameters.

Clonogenic survival assay was also conducted to study the radiosensitization effect in vitro. HepG2 cells were seeded in six-well plates at 4.0 × 10⁴ cells/well and allowed to grow for 16 h. The cells were incubated with HA-Gd₂ O ₃ NPs diluted in cell culture medium for 6 h. The cells were then irradiated at 6 Gy using a clinical linear accelerator (Oncor, Siemens, Germany) with 6 MeV irradiation using a 10 cm × 10 cm radiation field at a source-to-skin distance (SSD) of 100 cm to cover the entire cells. Then, these irradiated cells were allowed to grow for 14 days, fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 40 min, stained with a 1% crystal violet after washing the cells.

Live-Dead Staining Assay and Flow Cytometry

To study the radiosensitization effect of HA-Gd₂ O ₃ NPs, HepG2 cells were seeded in six-well plates at a density of 4.0 × 10⁴ cells/well and allowed to grow for 12 h and set six groups (control, HA-Gd₂ O ₃ NPs, radiation, radiation + 50 μg/mL HA-Gd₂ O ₃ NPs, radiation + 100 μg/mL HA-Gd₂ O ₃ NPs and radiation + 200 μg/mL HA-Gd₂ O ₃ NP). When cells were grown to 80% in plates, the first group had no treatment, the second group was incubated with 100 μg/mL HA-Gd₂ O ₃ NPs for 24 h, the third group was just irradiated, and the fourth group to the sixth group were irradiated and incubated with different concentrations of HA-Gd₂ O ₃ NPs (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h, respectively. After that, FDA and PI working buffer were added for cell staining. The fluorescence of stained cells was observed under a fluorescence microscope (×20), and live cells showed green color and dead ones exhibited red color. Furthermore, cells by different treatments were washed three times with PBS, digested, collected, and centrifuged at a speed of 2000 rpm for 5 min, then fixed with 70% ethanol at − 20 °C overnight followed by PI staining. DNA fragmentation was quantified by the fluorescence intensity of PI on a flow cytometer (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analyzed by software (FLOWJO 7. 6. 2) to make clear the cell cycle distribution.

Radiosensitization Effect In Vivo

Female BALB/c mice with body weights of 19–21 g and ages of 6 weeks were obtained from the Yangzhou University Laboratory Animal Center under the standard conditions. Animal experiments were compliant with the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. A subcutaneous tumor model was established as the following procedures:First, 1 × 10 ⁶ HepS cells were inoculated into mice intraperitoneal, and the ascites were collected after 5 days. Then, these ascites were injected into subcutaneous. When the tumor sizes reached approximately 100 mm³ , subcutaneous tumors models were established and applied to the following experiments.

Eight mice bearing subcutaneous tumors per group were treated with radiation at 3 Gy per fraction to a total dose of 9 Gy within 7 days. The radiotherapy was conducted after 3 h intravenous injection of HA-Gd₂ O ₃ NPs (10 mg/Kg), on a Siemens Primus clinical linear accelerator (6 MeV) using a self-made device to cover the entire tumor. These mice were anesthetized by 1% pentobarbital (50 mg/kg) to assure immobility during irradiation. The volume was measured and recorded every day, determined from caliper measurement, and calculated by the formulae:V =0.5 × a × b ² , donde V (mm ³ ) is the volume of the tumor, and a (mm) and b (mm) are the tumor length and tumor width, respectively. Relative tumor volumes were normalized to their initial sizes. Each group was conducted on eight mice, wherein statistical analysis was performed using Student’s two-tailed t test (*p <0.05, **p <0.001).