Plataformas de respuesta acústica y de pH basadas en nanopartículas de proteínas cargadas con perfluoropentano para terapia e imágenes de ultrasonido dirigidas a tumores de ovario

Resumen

En este estudio, desarrollamos un agente terapéutico de ultrasonido multifuncional (EE. UU.) Que encapsula el perfluoropentano (PFP) en ferritina (FRT) y conjuga la molécula de ácido fólico (FA) dirigida a tumores (FA-FRT-PFP). El FA-FRT-PFP preparado tenía un diámetro de partícula medio de 42,8 ± 2,5 nm, un potencial zeta de -41,1 ± 1,7 mV y muestra una buena estabilidad en solución fisiológica y temperaturas. FRT es una proteína de jaula sensible al pH que, a pH 5,0, se desmonta para formar poros que pueden cargar PFP. El ajuste a pH neutro cierra los poros y encapsula el PFP dentro del FRT para formar nanopartículas. A pH 5,0, 3 min de ultrasonido enfocado de baja intensidad (LIFU, 2 W / cm ² ) mejoraron significativamente la señal de EE. UU. de FA-FRT-PFP a través del efecto de vaporización de gotas acústicas (ADV). En condiciones idénticas, 4 min de irradiación LIFU provocaron la rotura de las burbujas generadas por FA-FRT-PFP. FA-FRT-PFP podría dirigirse de manera eficiente a las células de cáncer de ovario y mejorar significativamente el contraste estadounidense de FA-FRT-PFP después de 3 min de irradiación LIFU. Después de 4 min de irradiación LIFU, la viabilidad celular disminuyó significativamente debido a la necrosis, probablemente debido a la liberación de PFP mediada por FA-FRT-PFP en el ambiente ácido de los lisosomas después de ingresar a las células tumorales. Luego, la PFP se transforma en burbujas que estallan bajo la irradiación LIFU, formando ondas de choque físicas que conducen a la destrucción de la estructura celular y la necrosis, logrando el tratamiento del tumor. En conjunto, esto demuestra que FA-FRT-PFP es un agente teranóstico novedoso y prometedor de EE. UU. Para su futura aplicación clínica.

Introducción

El cáncer de ovario es uno de los cánceres femeninos más letales a nivel mundial [1, 2, 3]. El tratamiento del cáncer de ovario sigue siendo clínicamente dependiente de la radioterapia, la quimioterapia, la cirugía y otras terapias auxiliares [4, 5, 6]. Sin embargo, las deficiencias en estas estrategias continúan obstaculizando las mejoras en las tasas de supervivencia de los pacientes. Para superar estas deficiencias, se requieren métodos de diagnóstico más eficaces y seguros. En los últimos años, la integración de la imagenología y la terapéutica en una única plataforma de tratamiento se ha convertido en un tema candente [7, 8, 9].

La tecnología de ultrasonido (EE. UU.), Debido a sus características no invasivas, no radiativas, de bajo costo y específicas, se utiliza ampliamente en el diagnóstico clínico y el tratamiento de tumores [10,11,12]. En las últimas décadas, se ha desarrollado una plataforma de respuesta acústica (ARP) con imágenes estadounidenses y capacidades terapéuticas para el diagnóstico y tratamiento de tumores eficaces [13,14,15,16]. ARP incluye principalmente microburbujas o nanoburbujas (MB o NB) y plataformas basadas en nanopartículas (NP) [16, 17]. Entre estos ARP, MB o NB muestran buenas capacidades de respuesta acústica, pero debido a su gran tamaño, la penetración de tejido in vivo es débil y la estabilidad de la muestra es pobre. NP muestra una permeabilidad tisular más fuerte y un ciclo farmacocinético más largo debido a su pequeño tamaño. Sin embargo, las capacidades de respuesta acústica de los NP son limitadas. Por lo tanto, es urgente diseñar ARP de tamaño pequeño, con alta estabilidad y gran capacidad de respuesta.

Los fluorocarbonos líquidos experimentan una transición de fase líquida a fase gaseosa en respuesta a la estimulación externa [18, 19]. Natalya y sus colegas desarrollaron una nanoemulsión que contiene fluorocarbono líquido que produce efectos de vaporización de gotas acústicas (ADV) bajo ultrasonido focalizado de baja intensidad (LIFU) [20, 21, 22]. Las emulsiones formaron burbujas y simultáneamente desencadenaron la liberación del fármaco, lo que permitió el tratamiento del tumor. Sin embargo, una capa de material de sellado envuelto alrededor del fluorocarbono líquido condujo a un aumento en la intensidad y el tiempo del ultrasonido requerido para el tratamiento del tumor, lo que resultó en daño al tejido sano circundante. Por lo tanto, se requiere una mayor optimización del portador de fluorocarbono líquido.

En este estudio, desarrollamos una nanopartícula de ferritina (FRT) cargada con perfluoropentano de fluorocarbono líquido (PFP) que se combinó además con la molécula diana del tumor ácido fólico (FA) para formar FA-FRT-PFP. La ferritina es una proteína nanocage endógena altamente biocompatible que muestra sensibilidad al pH [23, 24, 25]. La proteína se puede desmontar en un entorno ácido y se puede volver a montar en un entorno alcalino. Esto permite la carga y liberación controladas de ferritina en respuesta a los cambios de pH [26,27,28]. PFP es un material de transformación de fase de uso frecuente que muestra una temperatura de ebullición de 29 ^o C. La baja temperatura de ebullición facilitó la fácil transformación de fase de LIFU, que era más segura que HIFU. La PFP se cargó en ferritina y la FA-FRT-PFP resultante tenía un diámetro de ~ 47,3 ± 2,8 nm con alta estabilidad a soluciones y temperaturas fisiológicas. Según los resultados, FA-FRT-PFP tenía las siguientes ventajas:(1) PFP se podía cargar fácilmente en FRT cambiando el pH de ácido a neutro; (2) bajo ultrasonido enfocado de baja intensidad (LIFU, 2 W / cm ² , 3 min) y pH =5.0, FA-FRT-PFP libera PFP y sufre cambios de fase para mejorar las señales de imágenes de EE. UU. A través de la vaporización de gotas acústicas (ADV); 3) Bajo irradiación LIFU a largo plazo (4 min) y pH =5,0, la PFP liberada de FA-FRT-PFP explotó y produjo una onda de choque física que podría destruir eficazmente las células tumorales a través de la necrosis. Hasta donde sabemos, este es el primer ejemplo de carga de PFP en FRT como un tumor teranóstico de EE. UU. Estos resultados indican que FA-FRT-PFP + LIFU es una nueva estrategia para el diagnóstico y tratamiento integrados de tumores.

Materiales y métodos

Materiales

Gel de agarosa, ferritina (FRT), ácido fólico (FA) y perfluoropentano (C ₃ F ₈ , PFP) se adquirieron en Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). NH ₂ -PEG ₂₀₀₀ -FA y NH ₂ -PEG ₂₀₀₀ -COOH fueron suministrados por Xi’an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (China). Se adquirieron 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). El kit de recuento de células 8 (CCK-8) se obtuvo de Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japón). El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), la solución salina tamponada con fosfato (PBS), la penicilina-estreptomicina, la tripsina-EDTA y el suero fetal bovino (FBS) se adquirieron en Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.).

Cultivo celular

La línea celular de cáncer de ovario humano SK-OV-3 fue proporcionada por el Instituto de Biología Celular de Shanghai, Academia de Ciencias de China. Se obtuvieron células epiteliales de ovario normales HUM-CELL-0088 de PriCells, Wuhan, China. Las células se cultivaron en medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% y solución de penicilina-estreptomicina al 1%. Las células se mantuvieron en una incubadora con una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO ₂ a 37 ° C

Preparación de FA-FRT-PFP

En primer lugar, la molécula objetivo FA se conjugó con FRT a través de la reacción de esterificación [29]. En resumen, NH ₂ -PEG ₂₀₀₀ -FA (10 mg) y la solución de FRT se mezclaron con la presencia de EDC (5 mg / ml) y NHS (20 mg / ml). Después de 3 h de reacción a temperatura ambiente con ligera agitación, la mezcla se purificó mediante diálisis contra agua destilada (PM de corte =1,2 kDa) durante 24 h. La solución resultante fueron nanopartículas de FA-FRT. En segundo lugar, la carga de PFP en la cavidad de FRT se preparó con el proceso de desnaturalización y renaturalización de proteínas [30]. Brevemente, se diluyó FA-FRT en 5 ml de PBS para que fuera 2 mg / ml y se ajustó a pH =5,0 con 30 min de agitación ligera a temperatura ambiente para asegurar la disociación completa del FRT. Después de eso, se agregaron 500 μl de PFP a la solución en un baño de hielo y se sometió a sonicación por pulsos con 5 s encendidos y 5 s en pausa durante un total de 5 min a 80 W en un baño de hielo. Después de la sonicación, el valor de pH de la mezcla se ajustó a neutro (pH =7,4). Como la PFP estaba en estado aceite y no se podía resolver en agua, la PFP excesiva se eliminó fácilmente mediante separación de líquidos para ser FA-FRT-PFP. FRT-PFP se preparó con un método similar excepto para cambiar NH ₂ -PEG ₂₀₀₀ -FA en NH ₂ -PEG ₂₀₀₀ -COOH.

Caracterización de FA-FRT-PFP

Los tamaños y potenciales zeta de las nanopartículas fueron probados por un Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, Reino Unido). La morfología de FA-FRT-PFP se observó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, Hitachi, Japón) y microscopía de fluorescencia invertida (Olympus, Japón). La estructura química de las nanopartículas se detectó mediante una espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Alemania). La captación celular de FA-FRT-PFP se detectó mediante microscopía de barrido láser confocal (LEXT OLS4100, Olympus, Japón). Las células de doble tinción FITC / PI se analizaron mediante citometría de flujo (BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.).

El rendimiento de la generación de gases sensibles al pH y al ultrasonido

FA-FRT-PFP en condiciones de pH =5,0 y 7,5 se irradiaron con diferente intensidad acústica de LIFU (1,5 y 2,0 W / cm ² ) y durante un tiempo total diferente (1, 2, 3 y 4 min) en el modelo de gel de agarosa, luego se observaron imágenes de EE. UU. con un equipo de EE. UU. (Esaote Mylab 90, Italia) con una frecuencia de 5 a 12 MHz e índice mecánico ( MI) de 0,06. Después de eso, se observó la aparición de FA-FRT-PFP por microscopía óptica en el tiempo. La intensidad de EE. UU. De la región de interés en la imagen de EE. UU. Fue analizada por el software ImageJ.

Captación celular

Brevemente, se disolvió 1 mg de FITC en 1 ml de DMSO y luego se mezcló con FRT-PFP y FA-FRT-PFP durante 30 min con agitación suave. Luego, la solución mezclada se dializó durante la noche en agua desionizada para eliminar FITC y DMSO libres para obtener nanopartículas marcadas con FITC. A continuación, se cultivaron células SK-OV-3 y células ováricas normales (HUM-CELL-0088) en el medio durante 24 h, y luego se incubaron conjuntamente con FITC libre, FRT-PFP marcado con FITC y FA-FRT-PFP con Células SK-OV-3 durante 5 h. Además, se incubó FA-FRT-PFP marcado con FITC con células SK-OV-3 pretratadas con FA durante 5 h. Las células se lavaron 3 veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con 0,2 mg / ml de solución de DAPI durante 10 min. Se obtuvieron imágenes de las células mediante microscopía de barrido láser confocal para capturar imágenes fluorescentes. La señal de fluorescencia se cuantificó mediante un citómetro de flujo.

Imágenes por ultrasonido in vitro

Las células SK-OV-3 se cultivaron durante 24 h en medio libre de FA, y luego se incubaron PBS, FRT-PFP y FA-FRT-PFP, y FA-FRT-PFP + FA con las células SK-OV-3 para 6 h. Las células se recolectaron y se mezclaron con gel de agarosa, y luego, las células se irradiaron con o sin LIFU durante 3 min (1 s encendido y 1 s pausa por un total de 3 min; 1 MHz; 2,0 W / cm ^ {2} ). Por fin, se capturaron imágenes de EE. UU.

Eficacia anticáncer in vitro

Las células SK-OV-3 se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10 ⁴ células / pocillo, y se dejó adherir durante 24 h. Para la citotoxicidad de FA-FRT, se cultivaron varias concentraciones (0, 20, 40, 100, 200 y 500 μg / ml) de FA-FRT con células SK-OV-3. Después de 24 h de tratamiento, las células se trataron con medio DMEM que contenía CCK-8 al 10% durante 20 min en una incubadora. La absorbancia de las células a una longitud de onda de 450 nm se detectó mediante un lector de placas multimodo (Thermo Scientific) para caracterizar la viabilidad celular. Además, las células SK-OV-3 y las células ováricas normales (HUM-CELL-0088) se trataron con PBS, FRT-PFP y FA-FRT-PFP y FA-FRT-PFP + FA durante 3 h, y luego se irradiado por LIFU (1 s con una pausa de 1 s durante un total de 4 min; 1 MHz; 2,0 W / cm ² ). Las células tratadas se incubaron durante otras 21 h. Como control, sin LIFU, las células se trataron con PBS, FRT-PFP y FA-FRT-PFP y FA-FRT-PFP + FA durante 24 h. Después de eso, la viabilidad de las células tratadas se detectó mediante el ensayo CCK-8.

Análisis de muerte celular

Para evaluar el tipo de muerte celular, se sembraron células SK-OV-3 en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10 ⁴ células / mL. Después de 24 h, las células se trataron con PBS, FRT-PFP y FA-FRT-PFP y FA-FRT-PFP + FA durante 3 h, luego se irradiaron con LIFU (1 s, pausado durante 1 s para un total de 4 mínimo; 1 MHz; 2,0 W / cm ² ). Las células tratadas se incubaron durante 23 h más. Como control, las células se trataron con PBS, FRT-PFP y FA-FRT-PFP y FA-FRT-PFP + FA durante 24 h en ausencia de LIFU. Las células se tripsinizaron, centrifugaron a 1500 × g durante 3 min, se lavó 3 veces con PBS helado y luego se resuspendió en 200 ml de tampón de unión. Posteriormente, se agregaron 5 μL de anexina V-FITC y 10 μL de PI y se incubaron con las células durante 15 min en la oscuridad. Las células teñidas se analizaron con un citómetro de flujo.

Western Blot

El western blot se realizó de acuerdo con la literatura previa. Las células se trataron con 40 μg / mL de PBS (control), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA y FA-FRT-PFP combinados con o sin irradiación LIFU (2.0 W / cm ² , 4 min) y 21 h más de incubación. Y luego las células tratadas se lisaron en tampón RIPA (Sigma). Cincuenta microgramos de cada proteína con tampón de muestra de Laemmli se hirvieron durante 5 min y se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Bio-Rad Laboratories) usando Trans-Blot semiseco (Bio-Rad Laboratories). Las transferencias se incubaron primero en tampón de bloqueo TBS que contenía leche al 2% o BSA al 2% (para anticuerpos fosfoespecíficos) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego con los anticuerpos primarios respectivos diluidos en TBST (que contenía Tween20 al 0,1% y BSA al 2%) durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, las transferencias se lavaron e incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados (Santa Cruz) en TBST y se detectaron utilizando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Thermo).

Análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student. * P <0.05, ** P <0,01 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados y discusión

Preparación y caracterización de FA-FRT-PFP

Se sintetizó FA-FRT-PFP y se utilizó para la terapia tumoral (Fig. 1). Se cargaron gotitas de transformación de fase en FRT a través del desmontaje y reensamblaje reversibles inducidos por pH de FRT. La PFP con vaporización de gotitas acústicas inducida por LIFU (ADV) se administró a las células y actuó como un agente de formación de imágenes por ultrasonido. La Figura 2a-c muestra imágenes TEM de FRT, FRT-PFP y FA-FRT-PFP, que eran de morfología esférica. Los tamaños medios de partícula de FRT, FRT-PFP y FA-FRT-PFP fueron 6,9 ± 0,3 nm, 43,8 ± 1,6 nm y 47,3 ± 2,8 nm, respectivamente, (Fig.2d) demostrando que la carga de PFP y la conjugación de FA mejoraron la tamaño de FRT. El potencial zeta medio de FRT y FA-FRT-PFP fue - 43,2 ± 3,1 mV, - 46,9 ± 2,2 mV y - 41,5 ± 2,7 mV, respectivamente (Fig. 2e). Además, la conjugación de FA con FRT se caracterizó por FT-IR como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S1. El espectro FT-IR mostró bandas de absorción a ~ 1110 cm ⁻¹ puede corresponder al enlace de éter vibratorio C – O – C de PEG; picos de absorción a ~ 1601 cm ⁻¹ y ~ 1710 cm ⁻¹ pertenecen a enlaces vibracionales C =O de PEG y FRT, así como de –COOH y –CONH ₂ de FA y FRT; las bandas a ~ 2820 cm ⁻¹ , ~ 2920 cm ⁻¹ y ~ 2950 cm ⁻¹ corresponden a vibraciones de estiramiento C – H asimétricas y simétricas de –CH ₂ de FA y PEG; picos de absorción a ~ 1440 cm ⁻¹ están asociados con el anillo fenilo de FA. El resultado confirma la conjugación exitosa de FA con FRT. Durante el período de almacenamiento de 28 días, el tamaño y la PDI de FA-FRT-PFP en agua, PBS, solución salina y FBS permanecieron sin cambios significativos (Fig. 3a, b), lo que indica que FA-FRT-PFP muestra una excelente estabilidad. La Figura 3c muestra el cambio de tamaño de FA-FRT-PFP a varias temperaturas que van desde los 25 ^o C a 45 ^o C. El tamaño de FA-FRT-PFP casi no cambió cuando la temperatura se redujo a 25-40 ° C, lo que indica que FA-FRT-PFP muestra una alta estabilidad por debajo de 40 ^o C. Cuando la temperatura alcanzó los 45 ° C, el tamaño de FA-FRT-PFP varió de 42,1 nm a 6 nm, probablemente debido a que la PFP en FA-FRT-PFP sufrió una gasificación severa, lo que provocó la ruptura de las nanopartículas. La temperatura de gasificación de FA-FRT-PFP aumentó de 29 ^o C (temperatura de gasificación de PFP a presión normal) a 45 ^o C, probablemente debido a la cobertura de la carcasa FRT [21, 31,32,33].

Mejora de respuesta de pH y LIFU en EE. UU.

Se realizaron experimentos fantasmas estadounidenses de FA-FRT-PFP a diferentes valores de pH e intensidad de potencia LIFU. Como se muestra en la Fig. 4a, en ausencia de irradiación LIFU (pre), la señal de EE. UU. Fue débil en todos los grupos. A pH 7,5 después de 3 min de irradiación LIFU, FA-FRT-PFP mostró una señal de EE. UU. Baja tanto a 1,5 como a 2,0 W / cm ² , mientras que a pH =5,0 bajo el mismo tiempo de irradiación LIFU, FA-FRT-PFP tuvo una intensidad de señal de EE. UU. más fuerte. Esto demostró que el FA-FRT-PFP mostró efectos ADV dependientes del tiempo y de la intensidad acústica. Esto se debió a que, a pH =5,0, FA-FRT-PFP desensambló y liberó PFP, lo que facilitó la transformación de fase. Curiosamente, cuando el tiempo de irradiación LIFU se extendió a 4 min, FA-FRT-PFP a pH =5.0 y 2.0 W / cm ² de LIFU tuvo una intensidad de señal de EE. UU. más débil en comparación con la de un tiempo de irradiación más bajo, probablemente debido a que el LIFU en esta condición es demasiado fuerte que induce la ruptura de las burbujas. Estos resultados demostraron que el FA-FRT-PFP podría liberar PFP, generando transformaciones de fase y explosión a 2,0 W / cm ² de irradiación LIFU a pH =5,0. Los resultados de la intensidad de EE. UU. Se muestran en la Fig. 4b, c. La figura 4d-g muestra la morfología de las soluciones de FA-FRT-PFP después de 3 min de irradiación LIFU (2,0 W / cm ² ) y a pH =7,5 y 5,0. FA-FRT-PFP a pH =5,0 y 2,0 W / cm ² LIFU generó grandes burbujas, validando aún más nuestros hallazgos.

Captación de celda

La Figura 5 muestra la capacidad de captación celular de FA-FRT-PFP. Las células libres tratadas con FITC mostraron una fluorescencia insignificante, pero después del etiquetado en FA-FRT-PFP, fue evidente una fuerte señal de fluorescencia, lo que indica que FA-FRT-PFP tiene una fuerte capacidad de absorción celular. Las células tratadas con FRT-PFP y tratadas con FA-FRT-PFP preincubadas con FA mostraron una fluorescencia de FITC más débil. Esto demostró además que FA mejora la focalización activa de nanopartículas. Además, FA-FRT-PFP mostró un comportamiento de absorción comparable al FCM (Fig. 5c, d). Las tasas de absorción de FA-FRT-PFP fueron 46,5 ± 2,8%, que fue significativamente más alta que la de FITC libre (control), FRT-PFP y FA-FRT-PFP + FA. Además, archivo adicional 1:La figura S2 muestra la captación celular de nanopartículas en células ováricas normales. No hay diferencias significativas entre los grupos FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA y FA-FRT-PFP en la captación celular. Esto probablemente se deba a que las células ováricas normales (HUM-CELL-0088) tienen una expresión de receptor de FA baja en comparación con las células SK-OV-3.

Imágenes por ultrasonido in vitro

Para confirmar que FA-FRT-PFP mejora la obtención de imágenes por ultrasonido mediante ADV in vitro, se incubaron nanopartículas con las células durante 5 hy se irradiaron con o sin LIFU (2,0 W / cm ² ). Como se muestra en la Fig.6a en ausencia de irradiación LIFU, las células en todos los grupos probados no mostraron señales de ultrasonido mejoradas mientras seguían la irradiación LIFU, las células tratadas con FA-FRT-PFP mostraron altas intensidades de EE. UU. En comparación con los controles FRT-PFP y FA-FRT -Grupos PFP + FA, respectivamente. Para la obtención de imágenes por ultrasonido, se calculó el análisis cuantitativo de los valores de la escala de grises utilizando el software ImageJ. Los resultados fueron coherentes con los datos de imágenes de EE. UU. (Fig. 6b) que muestran que la intensidad de EE. UU. De las células tratadas con FA-FRT-PFP mejoró después de la irradiación con LIFU a 2,0 W / cm ² durante 3 min. FA-FRT-PFP entra en las células y en el ambiente ácido de los lisosomas (pH =~ 5,0) se desmonta y libera PFP en el citoplasma [34, 35]. Después de la irradiación LIFU, el PFP generó fácilmente transformaciones de fase de gotitas a gas, lo que mejoró la intensidad de EE. UU.

Análisis in vitro de eficacia anticáncer y muerte celular

La Figura 7a muestra la citotoxicidad de FA-FRT-PFP a concentraciones de hasta 0,5 mg / ml. En ausencia de irradiación LIFU, FA-FRT-PFP no mostró una supresión obvia de la viabilidad en las células SK-OV-3. Se utilizaron ensayos CCK-8 para analizar la eficacia anticancerosa de FA-FRT-PFP combinada con LIFU. Como se muestra en la Fig. 7b, en ausencia de irradiación LIFU, FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA y FA-FRT-PFP no mostraron citotoxicidad notable en comparación con los grupos de control. Cuando se combinó con 4 min de irradiación LIFU, FA-FRT-PFP mostró una citotoxicidad significativa que fue mayor que la de FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, con tasas de inhibición celular máximas cercanas al 90% a 40 μg / ml. Esto puede deberse a que FA-FRT-PFP se absorbe más fácilmente en el citoplasma y luego en los lisosomas en comparación con FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA. En el ambiente ácido de los lisosomas, FA-FRT-PFP liberó PFP en el citoplasma. Bajo 4 min de irradiación LIFU, la PFP liberada se gasificó, causando cavitación y ruptura, generando una serie de fuerzas de choque físico que mejoraron significativamente los efectos letales de los tumores [36,37,38]. Además, archivo adicional 1:La figura S3 muestra la citotoxicidad de las nanopartículas en las células ováricas normales. No hay diferencias significativas entre los grupos FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA y FA-FRT-PFP en la citotoxicidad cuando se combinan con LIFU. El resultado puede deberse a que las células HUM-CELL-0088 tienen una expresión de receptor de FA baja que no mostró ningún efecto de focalización de FA.

Como se muestra en la Fig. 8a, b, en ausencia de irradiación LIFU, las células mostraron una muerte celular mínima en todos los grupos. Después de 4 min de irradiación con LIFU, las células tratadas con FA-FRT-PFP mostraron una necrosis significativa (~ 91,6%) en comparación con otros grupos debido a las ondas de choque físicas generadas por la cavitación de PFP inducida por LIFP o el estallido de burbujas. Además, archivo adicional 1:La figura S4 muestra el nivel de expresión de la proteína TNF de las células. Sin LIFU, las células apenas expresaban proteína TNF. Mientras que con LIFU, las células en el grupo FA-FRT-PFP tienen un alto nivel de expresión de TNF, en comparación con las de los grupos FRT-PFP y FA-FRT-PFP + FA, lo que indica que la proteína TNF era una FA-FRT-PFP vital + Proteína relacionada con la muerte inducida por LIFU [39]. Basado en el excelente efecto de la terapia del cáncer in vitro [40,41,42], FA-FRT-PFP es prometedor para la futura terapia del cáncer in vivo.

Conclusión

En resumen, desarrollamos con éxito nanopartículas de transformación de fase cargadas con PFP y basadas en FRT modificadas con una molécula objetivo de FA (FA-FRT-PFP). Como novedoso teranóstico de EE. UU. Dirigido, FA-FRT-PFP tenía múltiples ventajas:(1) FA-FRT-PFP tenía un tamaño de partícula a nanoescala; (2) Se utilizó FRT como portador, que se podía desmontar y volver a montar para cargar y liberar gotas de PFP en condiciones ácidas y neutras, respectivamente; (3) en 3 minutos de asistencia LIFU y condiciones ácidas, FA-FRT-PFP liberó PFP y generó transformaciones de fase a través de ADV, lo que podría aumentar significativamente su contraste en EE. UU. (4) bajo 4 min de irradiación por LIFU y un ambiente ácido, la PFP liberada podría inducir fácilmente un "efecto de explosión" intracelular, dando como resultado características físicas antitumorales. Estos resultados demuestran que FA-FRT-PFP con la asistencia de LIFU proporciona una estrategia novedosa para la obtención de imágenes moleculares por ultrasonido y la terapia de tumores.

Disponibilidad de datos y materiales

Las conclusiones de este manuscrito se basan en los datos que se presentan y se muestran en este documento.

Abreviaturas

ADV:: Vaporización de gotas acústicas
ARP:: Plataforma de respuesta acústica.
CCK-8:: Kit de conteo de células 8
EDC:: 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida
FA:: Ácido fólico
FBS:: Suero fetal bovino
FITC:: Isotiocianato de fluoresceína
FRT:: Ferritina
LIFU:: Ultrasonido enfocado de baja intensidad
NHS:: N-hidroxisuccinimida
PFP:: Perfluoropentano
EE. UU .:: Ultrasonido

Heteroestructuras de dimensiones mixtas de CuFe2O4 / MoS2 con respuesta de detección de gas mejorada Conmutación analógica y comportamiento sináptico artificial de Ag / SiOx:Ag / TiOx / p ++ - Dispositivo de memristor Si

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